Công ty Vắcxin Sinh phẩm số Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero quy mô phòng Thí nghiệm Cnđt: Đỗ Tuấn Đạt 8514 Hà nội 2010 DANH MC CC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABLV Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus) BPL Β-propiolactone CVS Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard) EBLV Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus) EP Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia) IU Đơn vị quốc tế (International unit) LAL Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL (Limulus amoebocyte lysate) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose) MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium) MNA Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma cell) MOI Multiplicity of Infection MSV Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus) NIH Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) PM Chủng Pitman-Moore PPLO Pleuropneumonia - like organism PV Chủng Pasteur Virus RFFIT Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid fluorescent focus inhibition test) SDS-PAGE Điện di gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TCYTTG Tổ chức Y tế giới (WHO) VABIOTECH Công ty Vắcxin sinh phẩm số VVSDT Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương WCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank) WSV Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1 Các loại vắcxin dại hệ thứ sử dụng cho người thú y 14 1.2 Các loại vắcxin dại nuôi cấy tế bào quy trình sản xuất 21 2.1 Số lượng tế bào Vero thu qua đời cấy chuyển q trình nhân ni chai ni cấy lớp 49 2.2 Kết nuôi cấy virút dại với liều gây nhiễm khác 51 2.3 Kết nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào 66 2.4 Kết nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trường trì tế bào khác 69 2.5 Kết ni cấy virút dại dạng chai nuôi cấy khác 72 2.6 Kết tinh hỗn dịch virút loại màng lọc khác 75 2.7 Kết bất hoạt virút dại phương pháp bất hoạt khác 76 2.8 Kết cô đặc hỗn dịch virút dại theo tỷ lệ khác 78 2.9 Kết kiểm tra chất gây sốt bán thành phẩm vắcxin dại 91 3.1 Kết nhân nuôi tế bào Vero loạt sản xuất thử nghiệm 95 3.2 Kết gây nhiễm virút dại loạt sản xuất thử nghiệm 96 3.3 Kết nuôi cấy virút dại thu hoạch nước loạt 0109 97 3.4 Kết nuôi cấy virút dại thu hoạch nước loạt 0209 98 3.5 Kết nuôi cấy virút dại thu hoạch nước loạt 0309 99 3.6 Kết tinh hỗn dịch virút loạt sản xuất thử nghiệm 100 3.7 Kết bất hoạt virút loạt sản xuất thử nghiệm 101 3.8 Kết cô đặc hỗn dịch virút loạt sản xuất thử nghiệm 101 3.9 Kết tinh chế virút loạt sản xuất thử nghiệm 102 3.10 Kết pha bán thành phẩm cuối loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.11 Kết sản xuất vắcxin thành phẩm loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.12 Kết kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm sở loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX) 106 3.13 Kết kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm sở loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 107 4.1 Tiêu chuẩn sở cho vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero (dạng lỏng hấp phụ nhôm) 141 4.2 Tiêu chuẩn sở cho vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero (dạng đông khô) 142 5.1 Kết kiểm tra an toàn đặc hiệu vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero 153 5.2 Kết kiểm tra tính an tồn chung vắcxin dại ni cấy tế bào Vero 153 5.3 Kết kiểm tra chất gây sốt vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 154 5.4 So sánh đáp ứng miễn dịch vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab 155 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình số Tên hình 1.1 Cấu trúc hạt virút dại Trang 1.2 Nguồn gốc chủng dại cố định sử dụng sản xuất vắcxin nuôi cấy tế bào 18 2.1 Tóm tắt quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero 39 2.2 Hình ảnh tế bào Vero qua đời cấy chuyển 41 2.3 Hình ảnh chuột liệt chủng virút dại cố định PV 56 2.4 Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero kính hiển vi huỳnh quang 60 2.5 Kết siêu ly tâm phân vùng rotor zonal tinh chế virút dại 85 2.6 Hình ảnh điện di sản phẩm sau tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân rotor zonal 86 2.7 Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng rotor góc cố định tinh chế virút dại 86 2.8 Hình ảnh điện di phân đoạn sau tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân rotor góc cố định 87 2.9 Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư sản phẩm trình sản xuất vắcxin dại 88 3.1 Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư sản phẩm loạt sản xuất vắcxin dại 0209 102 3.2 Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư sản phẩm loạt sản xuất vắcxin dại 0109 0309 103 3.3 Hình ảnh chạy điện di gel SDS-PAGE sản phẩm loạt sản xuất vắcxin dại 0109 103 3.4 Hình ảnh chạy điện di gel SDS-PAGE sản phẩm loạt sản xuất vắcxin dại 0209 0309 104 5.1 Sơ đồ gây miễn dịch lấy máu chuột 146 MỤC LỤC NỘI DUNG Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 1.1.1 Tác nhân gây bệnh đặc điểm bệnh lý 1.1.2 Đáp ứng miễn dịch với virút dại 1.1.3 Tác động bệnh dại sức khỏe cộng đồng 1.1.4 Các khuyến cáo tiêm phòng bệnh dại 1.2 TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI 13 1.2.1 Các vắcxin hệ thứ 13 1.2.2 Các vắcxin hệ thứ hai 17 1.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 20 1.3.1 Quy trình sản xuất vắcxin dại ni cấy tế bào 20 1.3.2 Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại nuôi cấy tế bào 24 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM 31 CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 36 2.1 QUY TRÌNH NI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 39 1.4 2.1.1 Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nuôi cấy tế bào 43 2.1.2 Thử nghiệm kiểm tra virút hấp phụ hồng cầu 47 2.1.3 Kết quy trình ni cấy tế bào Vero chai tế bào lớp 48 2.2 QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 49 2.3 QUY TRÌNH NI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 53 2.3.1 Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại 54 2.3.2 Kết nuôi cấy virút dại theo điều kiện nhân nuôi khác 65 2.4 QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74 2.5 QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT 76 2.6 QUY TRÌNH CƠ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 77 2.7 QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT 79 2.7.1 Thử nghiệm phát ADN tế bào Vero tồn dƣ sản phẩm quy trình tinh chế vắcxin dại phƣơng pháp lai điểm 79 2.7.2 Các phƣơng pháp tinh chế virút dại 84 2.8 QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 89 2.9 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 92 CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 94 3.1 KẾT QUẢ NI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 94 3.2 KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 95 3.3 KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 96 3.4 KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 100 3.5 KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT 100 3.6 KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 101 3.7 KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT 101 3.8 KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 104 3.9 KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 105 3.10 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM TẠI CƠ SỞ 105 CHƯƠNG - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 109 4.1 CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC 110 4.1.1 Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn 110 4.1.2 Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung 113 4.1.3 Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt 116 4.1.4 Phƣơng pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu 119 4.1.5 Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu 121 4.1.6 Thử nghiệm nhận dạng 4.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ 125 126 4.2.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số 126 4.2.2 Xác định pH vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero 130 4.2.3 Định lƣợng thimerosal vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero 131 4.2.4 Định lƣợng nhôm vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng 134 4.2.5 Xác định độ ẩm tồn dƣ vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng đơng khơ 136 4.2.6 Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero 139 5.3 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO 140 CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN VÀ HIỆU LỰC VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 143 5.1 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 144 5.1.1 Các phƣơng pháp đánh giá tính an tồn vắcxin động vật thí nghiệm 144 5.1.2 Các phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch vắcxin chuột 144 5.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN VÀ HIỆU LỰC CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 152 5.2.1 Tính an tồn vắcxin dại nuôi cấy tế bào động vật thí nghiệm 152 5.2.2 Đáp ứng miễn dịch vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero động vật thí nghiệm 154 KẾT LUẬN 157 KIẾN NGHỊ 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO 161 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Tại 100 nước vùng lãnh thổ, dại bệnh gây dịch động vật Bệnh dại chó nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người nguy đe dọa tính mạng 3,3 tỷ người, chủ yếu nước châu Á châu Phi Cùng với chó ni nhà, nhiều giống thú ăn thịt dơi làm lây truyền bệnh dại sang cho người Khi có biểu lâm sàng, phần lớn ca bệnh dại tử vong việc tiêm phòng biện pháp phòng bệnh điều trị bệnh dại cho hiệu cao Gần 10 triệu người tiêm phòng sau phơi nhiễm hàng năm chủ yếu nước châu Á Tiêm phòng dại sau phơi nhiễm tránh 300.000 ca tử vong hàng năm châu Á châu Phi Chi phí tồn cầu hàng năm cho phịng bệnh dại ước tính khoảng tỷ la Mỹ Chi phí tỷ lệ tiêm phòng sau phơi nhiễm dự tính tăng lên cách đáng kể tất nước thay vắcxin sản xuất từ mô thần kinh vắcxin nuôi cấy tế bào Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur cộng phát triển vắcxin dại thô để tiêm phòng sau phơi nhiễm dựa việc bất hoạt virút mơ thần kinh Từ trở số loại vắcxin phát triển sử dụng giới Các vắcxin hệ thứ sử dụng mơ động vật để có hỗn dịch chứa virút Các vắcxin sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho người động vật Tuy nhiên, vắcxin có nhiều nhược điểm virút sống tồn dư, hay gặp phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin hàm lượng kháng nguyên cho liều tiêm thấp đòi hỏi phải có liệu trình điều trị kéo dài với số lượng lớn mũi tiêm Dù có cải tiến cách nhân nuôi virút não động vật sơ sinh trước myelin phát triển, vắcxin bất hoạt sản xuất não động vật chưa dứt sữa gây phản ứng thần kinh không mong muốn Do vậy, vắcxin hệ thứ hai sản xuất nuôi cấy tế bào đời nhằm khắc phục nhược điểm dạng vắcxin cổ điển Vắcxin có tính an tồn cơng hiệu cao nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước sau phơi nhiễm với virút Đáp ứng miễn dịch hiệu lực vắcxin nuôi cấy tế bào chứng minh động vật thí nghiệm thực địa lâm sàng người Ở phương pháp tiêm phòng trước sau phơi nhiễm, vắcxin tạo đáp ứng kháng thể 99% người tiêm Sử dụng vắcxin hệ kết hợp với xử lý vết cắn cách tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại tạo hiệu phòng bệnh dại 100% chí với trường hợp bị cắn có nguy mắc bệnh cao Do việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất tiến tới đưa sử dụng rộng rãi vắcxin dại nuôi cấy tế bào cần thiết Các quốc gia giới cần sớm có chiến lược để sử dụng triển khai rộng khắp loại vắcxin tiên tiến cho hiệu cao Tại Việt Nam, năm 1991-1995, bệnh dại vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng kinh tế người dân Bệnh xảy quanh năm, lưu hành hầu hết tỉnh, thành phố nước Nếu tính người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền lại…) năm 1995 nước tốn gần 100 tỷ đồng Thêm vào đó, năm có 500 người thiệt mạng bệnh dại Trước tình hình nghiêm trọng bệnh dại, năm 1996, Chính phủ ban hành thị việc tăng cường phòng chống bệnh dại Bộ Y tế thành lập ban đạo Phịng chống bệnh dại Quốc gia Thành cơng Chương trình đến năm 2006 số ca tử vong bệnh dại giảm 81% so với năm 1995 Tuy nhiên, năm 2007, số ca tử vong bệnh dại lại tăng Bảng 5.3 Kết kiểm tra chất gây sốt vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) Sản phẩm Nhiệt độ tăng thỏ Thỏ Thỏ Thỏ