1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo WHO ước tính, năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; máu chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, phải kể đến chế phẩm huyết như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152] đó, huyết kháng nọc rắn (antivenom) loại chế phẩm quan trọng, đặc biệt điều trị rối loạn đông cầm máu nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi đất nơng nghiệp, bờ biển dài 3000 km, Việt Nam có mơi trường thuận lợi cho rắn độc phát triển Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy bị rắn độc cắn cao (> 30.000 người /năm [21]); tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng phải truyền hàng chục lít máu huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai phải truyền ≈ 46 lít máu chế phẩm để cứu người bệnh [174] Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu huyết tương phải sử dụng điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế quan tâm đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đến nay, có số nghiên cứu thành cơng, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23] Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; ta có hai loại HTKNR cho rắn hổ đất rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho quốc gia (khuyến cáo WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt HTKNR cho loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; lồi đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) Việt Nam, lồi rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong cao (> 80% không cấp cứu điều trị kịp thời) [14] Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn Việt Nam từ trước đến cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây hai lồi rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” giống nhau, thống nhìn khó phân biệt Hai lồi rắn khác độc tính nọc biểu lâm sàng, chẩn đốn dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu khơng có tác dụng chéo chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15] Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho hai loài rắn độc nguy hiểm nói giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn nước Để tăng tính an tồn chế phẩm, dạng F(ab’)2 tối ưu, đồng thời phải áp dụng giải pháp kỹ thuật kiểm soát chất lượng tồn diện để chế phẩm đạt Tiêu chuẩn Quốc gia HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9] Với lý trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm” thực hiện, nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia Đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG 1.1.1 Máu: Máu mô lỏng màu đỏ lưu thông hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước Máu chiếm 1/13 trọng lượng thể (60-70 ml/kg); thể tích nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31] Máu động vật có vú gồm HC, BC, TC, huyết tương, với chức cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ thể, tương tự người 1.1.2 Huyết tương: Là phần dịch lỏng thu sau ly tâm để lắng tự nhiên máu chống đông Thành phần chủ yếu huyết tương nước (92%), protein hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen ), đường, yếu tố đông máu, chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide [31],[167] Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, yếu tố đông máu, yếu tố enzyme, protein liên kết với lipid, protein vận chuyển thành phần thay đổi bệnh lý Điện di protein, điện di miễn dịch tách thành phần protein Mỗi protein huyết tương có điểm đẳng điện tương ứng với pH Tính hòa tan protein chịu ảnh hưởng nhiệt độ tính tan dung dịch muối Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hịa tan thay đổi, tính chất sinh học đi; yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163] 1.2 CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG 1.2.1 Máu toàn phần: Máu toàn phần máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật cho máu), bảo quản túi (hoặc chai, bình chun dụng) có chất chống đông bảo quản máu (thông thường CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin) Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40 gam hemoglobin [31],[170] Bảo quản máu toàn phần nhiệt độ - 6oC, thời gian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA Máu toàn phần lưu trữ chứa thành phần hồng cầu, máu thu nhận cịn có tiểu cầu số yếu tố đơng máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ giải phóng chất trung gian; ngồi máu tồn phần cịn chứa bạch cầu lympho yếu tố huyết tương 1.2.2 Khối hồng cầu [31],[170]: Khối hồng cầu máu toàn phần ly tâm tách phần huyết tương trên; tuỳ cách sản xuất mà có loại khối hồng cầu sau: + Khối hồng cầu đậm đặc: khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%, gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết tương; bảo quản nhiệt độ - 6°C; chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm + Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: khối hồng cầu sau tách huyết tương trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu dung dịch bảo quản, bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần; bảo quản nhiệt độ - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày + Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: chế phẩm máu sản xuất từ máu toàn phần tách huyết tương phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làm giảm phản ứng bạch cầu, giảm nguy lây bệnh tác nhân cư trú bạch cầu + Khối hồng cầu rửa: máu toàn phần khối hồng cầu ly tâm bỏ hết huyết tương, sau thay nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều, ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý; bảo quản nhiệt độ 2oC - 6°C 24 giờ, nhiệt độ 22°C + Khối hồng cầu lọc bạch cầu khối hồng cầu chiếu xạ: khối hồng cầu dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hai, bảo quản - 6°C hai tuần từ chiếu xạ Nếu dùng màng lọc rời sau lọc khơng để q 24 Thành phần chủ yếu hồng cầu, bạch cầu, bạch cầu bị bất hoạt Như vậy: sau tách huyết tương, tùy điều kiện nhu cầu truyền trả khối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu phương pháp bảo quản, vận chuyển đường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa Nếu lấy máu ngựa vào túi đôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương truyền trả khối hồng cầu ngựa đơn giản lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít) 1.2.3 Khối tiểu cầu: Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau: + Khối tiểu cầu pool: khối tiểu cầu sản xuất cách ly tâm túi máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast ly tâm tách lấy tiểu cầu; thông thường từ - đơn vị máu tồn phần nhóm ABO sản xuất đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu chưa pool, bảo quản 22°C, lắc liên tục, thời gian từ - ngày; pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ; số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011 + Khối tiểu cầu máy: khối tiểu cầu sản xuất máy tách tế bào lấy tiểu cầu từ người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có bạch cầu; bảo quản 22°C máy lắc liên tục, tối đa ngày 1.2.4 Huyết tương tươi đông lạnh: Huyết tương tươi đông lạnh huyết tương tách từ máu toàn phần kể từ lúc lấy máu, bảo quản đơng lạnh; thành phần có albumin, globulin miễn dịch, yếu tố đông máu bền vững yếu tố VIII khoảng 70%; lượng huyết tương tách từ đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml Thường pool lượng huyết tương tươi hai đơn vị máu tồn phần nhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml Bảo quản nhiệt độ 25°C/năm, bảo quản nhiệt độ thấp - 25°C hai năm [31],[170] Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương nhiều đợt, lấy nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản nhiệt độ ≤ - 25°C để tránh biến tính protein theo thời gian nhiều yếu tố tác động bất lợi 1.2.5 Tủa VIII (cryo): Để huyết tương tươi đông lạnh 4°C, huyết tương tan có phần tủa, ly tâm thu nhận tủa tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần: cryo có khoảng - đơn vị yếu tố VIII /ml yếu tố V, fibrinogen; trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn trọng lượng phân tử IgG (150 kD) [16] tách ta phương pháp tủa Cohn Fraction I, loại bỏ phần tách γ-globulin khơng cần thiết sử dụng 1.2.6 Huyết tương tươi tách tủa: Huyết tương tươi tách tủa phần huyết tương tách sau lấy tủa huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản - 25°C; thành phần gồm có: albumin, globulin, số yếu tố đông máu Nếu sản xuất HTKNR theo phương pháp Cohn, phần cần thiết giữ lại để sản xuất có γ -globulin Sản phẩm cần bảo quản huyết tương tươi đông lạnh: nhiệt độ - 25°C / năm, bảo quản nhiệt độ thấp - 25°C hai năm [31],[170] 1.2.7 Huyết tương đông lạnh: Huyết tương đông lạnh huyết tương tách từ máu toàn phần sau kể từ lấy máu; thành phần gồm yếu tố huyết tương, yếu tố đông máu không bền vững cịn lại ít; bảo quản nhiệt độ - 25°C, huyết tương tươi đông lạnh Huyết tương để sản xuất HTKNR sản xuất, tách chiết theo dạng chế phẩm 1.2.8 Khối bạch cầu hạt: Là chế phẩm huyết tương tách từ phần buffy-coast pool nhiều người cho máu; thành phần chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu số tế bào lympho chất bạch cầu giải phóng; sản xuất theo phương pháp pool từ nhiều người nguy nhiễm virus cao Bảo quản: nhiệt độ 22°C ≤ 24 Trong sản xuất HTKNR, cần tách huyết tương, cần để lại phần bạch cầu tiểu cầu với khối hồng cầu; cần truyền lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục 1.2.9 Albumin: Albumin protein hình cầu, tính hịa tan cao, trọng lượng phân tử 66.500 Da, chiếm nhiều huyết thanh; chức trì 70 – 80% áp lực keo huyết tương liên kết vận chuyển chất có phân tử nhỏ bilirubin, hormon, steroid, acid béo, phân tử thuốc Dung dịch albumin điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 - 20% protein tồn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa 5% protein [163]; trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm theo phương pháp tủa Cohn thu albumin Fraction V, phần tủa Cohn cuối cùng; sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ; theo tiêu chuẩn tinh protein dược điển Việt Nam III-2002, albumin phép dạng vết, phát điện di miễn dịch [7] 1.2.10 Gamma globulin: Hình 1.1 Các thành phần protein điện di protein huyết [176] Gamma globulin (γ-globulin) lớp globulin xác định điện di protein huyết thanh; với lớp γ-globulin IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; chiếm tỷ lệ nhiều IgG, sau IgM; IgD, IgA, IgE chiếm Năm 1940, γ-globulin tách chiết lần giới Khơng lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IGIM) đưa vào sử dụng, tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô γ-globulin huyết (1950) Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IGIV) sản xuất đưa vào sử dụng năm 1970, đau, tác dụng nhanh IGIM Năm 1981, Gamimune Mile phân lập, IGIV đăng ký Mỹ Sandoglobulin hãng Sandoz có thị trường năm 1984 Gamimune chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986; sản phẩm đổi tên thành Gamimuner N Sau đó, số IGIV khác đăng ký Mỹ như: Gammagard Hyland, Polygam hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam Immuno, Venoglobulin - I Alpha Therapeutic, Gammar-IV Armor GammaRaas tập đoàn RAAS (Mỹ) [167] Năm 1991, IGIV sản phẩm dạng bột hoà tan lần chấp nhận (Venoglobulin-S) Năm 1994, sau vụ dịch viêm gan C liên quan đến Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột khơng hồ tan Gammagard Polygam bị đình Năm 1980, bệnh nhân dùng IGIV điều trị giảm γ-globulin huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy đa số gây tăng số lượng tiểu cầu Tiếp theo phát ngẫu nhiên này, việc sử dụng IGIV cho ITP nghiên cứu thức dùng cho định Kể từ IGIV có hiệu ITP, chúng tiếp tục đánh giá điều trị bệnh khác với giả định chế tự miễn Hầu hết sử dụng IGIV bệnh tự miễn có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre Các định γ-globulin thừa nhận gồm: suy giảm miễn dịch tiên phát, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực ghép tuỷ xương Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IGIV) chế phẩm có 95% IgG từ huyết tương người hiến máu tinh chế IGIM chứa 15 - 18% protein, IgG chiếm 90% IGIM dung dịch suốt đục, có màu vàng nhạt nâu nhạt Cả hai loại dung dịch vô khuẩn, không chứa chất gây sốt, gồm γ-globulin chứa nhiều loại kháng thể có mặt máu người bình thường Sau tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết đạt đỉnh hai ngày, phân bổ nhanh ngang khu vực ngồi mạch máu Ở người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy IgG khoảng 23 ngày Khi liều tiêm IGIM lớn 10 ml phải chia thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhằm làm giảm đau chỗ bớt khó chịu Tổng liều lần tiêm bắp thịt không vượt 20 ml - người lớn Bảo quản nhiệt độ từ - oC không để đông băng Thời hạn dùng IGIM không năm kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) nhà sản xuất [31],[123] Bảng 1.1 Các thành phần protein huyết tương [31],[167],[176] Globulins α-globulins α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin, haptoglobin β-globulins γ-globulin Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) Loại khác Albumins hormone, binding globulin, transferrin angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor H, plasminogen, properdin Fibronectin, macroglobulin/microglobulin, Transcobalamin Lòng trắng trứng Serum albumin Loại khác Conalbumin, ovalbumin, avidin Human serum albumin, bovine serum albumin, prealbumin C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin, ricin 1.2.11 Kháng huyết thanh: Kháng huyết (KHT) sinh phẩm chứa γ-globulin miễn dịch có khả trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu từ huyết tương động vật huyết tương người mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định loại bỏ protein không cần thiết [7],[9] Một số KHT nghiên cứu, sử dụng chuyên ngành Huyết học Truyền máu: - Anti-HBs globulin: dùng cho bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173] - Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn (sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109] - Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương thỏ gây mẫn cảm) [132] - Anti-D globulin: điều trị huyết tán bất đồng nhóm máu mẹ hệ Rh, dùng cho người mẹ Rh (-) sau sinh Rh (+) [57],[74],[138],[139] điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119] - Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) [99] - Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất từ huyết tương thỏ) [127] - Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thỏ [111] 10 - Antivenom (SAV): điều trị rối loạn đông máu, DIC, tan máu, rắn độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa, dê, bò, cừu, ) - Antiglobulin người sử dụng chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ huyết tương thỏ, ngựa [22] Hiện lượng KHT thiếu hụt nước nghèo nhà sản xuất sản xuất KHT từ huyết tương người từ động vật tinh chế hai bước, giá thành tăng lên gấp nhiều lần, kèm theo nguy phải đóng cửa trang trại ni ngựa sản xuất KHT khơng đem lại lợi nhuận, giá đắt, thị trường eo hẹp, đạo luật bảo vệ động vật không cho lấy máu, khiến việc sản xuất KHT trở lên hấp dẫn; kết khan số lượng chủng loại thị trường, hậu tất đổ lên người bệnh Để trì sản xuất KHT phục vụ đa số nay, phủ số nước miễn thuế cho sản xuất KHT [77], tăng cường hỗ trợ sản xuất KHT miễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148], tăng cường hỗ trợ ngân sách từ tổ chức quốc tế, tổ chức từ thiện để trì số lượng, chất lượng sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149] 1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG: 1.3.1 Phương pháp tủa lạnh Ethanol: + Phương pháp tủa Cohn: Là phương pháp tách thành phần máu huyết tương thay đổi nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion quy trình cịn gọi là: quy trình tách "tủa protein" biết khỏi protein chưa biết huyết tương; phát minh lần Edwin Joseph Cohn (1892-1953), người Mỹ [169]; phát minh lúc góp phần cứu sống hàng vạn người Chiến tranh giới thứ II; đến phương pháp tách chiết chế phẩm máu huyết tương Trung tâm Huyết học - Truyền máu giới [31] Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn thu albumin huyết thanh, γglobulin, fibrinogen, thrombin số yếu tố đông máu Fibrinogen phần phân đoạn thrombin nghiên cứu sâu hơn, chế tạo thành sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt màng fibrin Các γ-globulin tìm thấy Fraction Cohn II, III chứng minh có tác dụng tốt điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh ngăn ngừa bệnh viêm gan truyền nhiễm cho người lính chiến tranh giới thứ hai Fibrin keo lỏng, fibrin bọt 113 qua bốn thử nghiệm an tồn, cơng hiệu quan trọng Tuy điều kiện sở sản xuất chưa tốt, chúng tơi đánh giá cẩn thận theo tiêu chí chất lượng bốn kiểm định an tồn, cơng hiệu (Bảng 3.18; 3.19; 3.20; 3.21) Sau có kết kiểm định quốc gia, đối chiếu với kết chúng tơi, thấy hồn tồn phù hợp: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu Đạt an tồn chung, khơng có chất gây sốt, vô khuẩn; khác chút kết đánh giá công hiệu: hiệu giá xác định 285,7 LD50/lọ; Kiểm định Quốc gia xác định 267,5 LD50/lọ (thấp 18 LD50/lọ ml so với Kiểm định sở) Theo Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV, không quy định cụ thể hiệu giá HTKNR bao nhiêu, khâu khó xác định trước, nhà sản xuất đặt mục tiêu Hướng dẫn WHO tương tự, khơng có quy định cụ thể mức đạt công hiệu (hiệu giá) Theo Dược điển Châu Âu (Eropean Pharmacopoeia 5.0) hiệu giá phải > 100 LD50 sản phẩm có hiệu giá gấp đơi u cầu [65] Theo dõi thông tin sản phẩm HTKNR giới cho thấy: HTKNRCN đa giá F(ab’)2 chống nọc hai loại rắn cạp nia Bungarus candidus Bungarus multicinctus từ huyết tương ngựa đề tài sản phẩm thành cơng phịng thí nghiệm giới Các hội nghị khoa học HTKNR giới, gần Hội nghị độc chất học Châu Á – Thái Bình Dương Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X (APAMT) Penang, Malaysia (2011) [89], thông tin tạp chí Quốc tế, chưa có tác giả thơng báo sản xuất sản phẩm tương tự Hiện nay, khu vực Đông Nam Á, Thái Lan Malaysia hai nước phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh Về sản phẩm HTKN-RCN cho hai loài Rắn cạp nia bắc, Rắn cạp nia nam, nước có nhiều nghiên cứu đáng ý Theo Fung S.Y; Ponnudurai G., Tan N.H (2004) [135], nhà khoa học hàng đầu Malaysia HTKNR - sản phẩm HTKN- 114 RCN đa giá, phịng thí nghiệm (trên thỏ) cho lồi rắn cạp nia B flavicep Malaixia có hiệu giá 42 LD50/ml, 167 LD50/ml, có khả phản ứng chéo trung hòa nọc rắn cạp nia B candidus, B multicinctus Trước đó, Chanhome L., Wongtongkam N., Khow O (1999) [51], sản xuất HTKN rắn cạp nong (B fasciatus), nhận thấy có nhiều tương đồng nọc B fasciatus với nọc B candidus, B multicinctus Các tác giả nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá chống nọc Rắn hổ mang Thái Lan, Rắn hổ chúa Rắn cạp nong; sau thí nghiệm thử trung hịa chéo nọc độc B candidus, B multicinctus chuột không thành công Các tác giả Ponnudurai G., Tan N.H (1990) [134] cho rằng: có nhiều tương đồng kháng nguyên nọc B flavicef, B fasciatus với B candidus, B multicinctus (cùng chi Bungarus) Các tác giả cho dùng HTKNR B flavicef Malaysia, hay B fasciatus Thái Lan trung hòa nọc độc B candidus, B multicinctus Tuy nhiên, điều khó, nọc rắn có tính đặc hiệu địa phương sản xuất HTKNR đa giá, tính đặc hiệu kháng nọc giảm so với HTKNR đơn giá chống loại nọc rắn, hiệu điều trị thấp phải dùng số lượng HTKNR nhiều, hậu protein miễn dịch khác loài cao Mặt khác, Việt Nam, hai loài rắn cạp nia B fasciatus B flavicef có số lượng khơng nhiều, nhu cầu nhiều so với Thái Lan Malaysia Trong đó, rắn cạp nia Việt Nam, Lào Campuchia có đặc điểm giống Chúng ta phát triển nghiên cứu rắn cạp nia tốt so với hai nước bạn Lào Campuchia; tương lai sản xuất đại trà HTKN-RCN cho hai loại Bungarus candidus, Bungarus multicinctus sản xuất phục vụ nhu cầu lớn (xuất cho Lào, Campuchia, phục vụ số chiến đấu cho Quân đội ) Láng giềng Việt Nam khác Đài Loan, Trung Quốc sản xuất HTKN-RCN bắc cho từ sớm Theo Chippaux J.P, Goiffon 115 M (1998) [55], HTKNR bivalent neurotoxic Đài Loan cho rắn hổ mang Naja naja atra Bungarus multicinctus có hiệu giá 1ml serum potency 100 LD50, sản phẩm sản xuất có hiệu giá thấp Đài Loan, thực tế, cần nghiên cứu thêm phương pháp họ để cải thiện hiệu giá Như vậy, phải chờ đợi thời gian lâu để có sản phẩm HTKNR thị trường nhập điều trị, chưa kể giá có hợp lý hay khơng Mặt khác, tính đặc hiệu kháng ngun nọc rắn theo vùng địa lý điều khó khăn cho ý tưởng mua HTKNR nước khác, trừ việc họ sản xuất theo đơn đặt hàng Cũng nên tính đến tính chủ động cung cấp thuốc cho nhu cầu Việt Nam Về nhóm tiêu chuẩn lý hóa: thử nghiệm u cầu làm có lơ HTKNR cần xuất xưởng, thị trường sử dụng lâm sàng Theo Bảng 3.23, tiêu chuẩn đạt: pH 7.012, NaCl 0,87%; nồng độ chất bảo quản merthiolat = 0; nồng độ protein = 7,43 g/dl (WHO < 10 g/dl); lượng albumin cịn (1,4g/l), chủ yếu globulin (48,4 g/l) với 95,6% mảnh F(ab’)2 cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu đạt độ tinh cao (Bảng 3.17) Theo khuyến cáo WHO, nồng độ merthiolate phải 1/10.000 không nên sử dụng chất bảo quản Merthiolate chất bảo quản sử dụng rộng rãi để bảo quản vắc-xin Tuy nhiên, merthiolate có thủy ngân dạng ethyl mercury, thơng thường, bệnh nhân nhiễm độc nặng sử dụng 15 lọ HTKNR, dùng đến 50 lọ an toàn Các nước: Nga, Đan Mạch, Úc, Nhật Bản, Anh toàn nước vùng Scandinavian dùng merthiolate chất bảo quản Năm 1999, FDA khuyến cáo nên giảm loại bỏ merthiolate vắc-xin Trung tâm nghiên cứu lượng giá chế phẩm sinh học Hoa Kỳ gửi thư tới sở sản xuất vắc-xin yêu cầu có chương trình tiến tới khơng có 116 merthiolate vắc-xin chế phẩm sinh học, đặc biệt cho trẻ sơ sinh trẻ em Tóm lại: kết đánh giá chất lượng Kiểm định sở quan Kiểm định quốc gia, khẳng định: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, nghiên cứu sản xuất từ huyết tương ngựa, đạt chất lượng tốt: An toàn Hiệu lực theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, 2009 theo hướng dẫn WHO guidelines 2008, đạt mục tiêu nghiên cứu đề Kết sơ chứng minh thực tiễn lâm sàng (Tham khảo phần Phụ lục 1) 4.2.3 Về giá thành, hiệu kinh tế xã hội, qui mô sản xuất: Hiệu kinh tế: tính tốn sơ bộ, chưa kể chi phí cơng lao động nhóm nghiên cứu chi phí ban đầu xây dựng labo, mua trang bị, giá thành 70 USD/lọ (bảng 3.24), mức giá cho thấy hiệu kinh tế rõ rệt nghiên cứu: Giả định bệnh nhân nằm viện, cần thở máy khoảng tháng, chi phí cho điều trị thuốc men, khoảng 100 triệu đồng/người Mỗi năm Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai có khoảng 30 bệnh nhân RCN bắc cắn, bệnh nhân tỷ đồng Trong nhóm nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị cần khoảng 200 triệu đồng cho hai lô sản xuất Nếu bán cho bệnh nhân với giá 70 USD/lọ, người cần dùng 20 lọ, chi phí cho thuốc 1400 USD, tương đương 30 triệu đồng/BN Với giả thiết 30 BN/năm, số tiền thuốc chi điều trị hết 900 triệu đồng Đã giảm 1/3 chi phí cho người bệnh So với sản phẩm Mỹ rao bán địa chỉ: antibodies-online Inc 2; Ravinia Drive, Suite 500 Atlanta, GA 30346 USA, Phone + 404 474 4654 Fax + 888 205 9894 (Toll-free) Giá sản phẩm HTKNR F(ab’)2 chất lượng tương tự HTKN-RCN là: 814,67 USD: giá họ đắt 117 gấp > 10 lần Hiệu mặt xã hội: nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chuẩn hóa HTKN-RCN F(ab’)2 đa giá, hướng đến cứu chữa bệnh nhân tốt việc làm thiết thực, cụ thể, thể quan tâm ngành y tế sức khỏe nhân dân; thể tinh thần tự lực tự cường, tính dân tộc, lịng u nước nhà khoa học y tế Tính mạng người vô giá Sản phẩm tốt, cứu bệnh nhân quà quý báu mà người ngành y tế giành cho đồng bào Về quy mơ sản xuất: quy mơ sản xuất phụ thuộc cung cầu thị trường, khơng thể sản xuất lớn thị trường nhỏ Hiện chưa có thống kê cụ thể số bệnh nhân bị tai nạn rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) xảy hàng năm, vài nghiên cứu cho thấy số bệnh nhân nằm bệnh viện Chợ Rẫy loài rắn bị tử vong cao, tới 80% Số nạn nhân tử vong tuyến không kịp đến bệnh viện thực tế bao nhiêu, chưa có số thống kê Tỷ lệ tử vong bệnh viện lên tới 80% cho thấy bất lực điều trị bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn Với vai trò quan trọng HTKNR điều trị rắn độc cắn WHO khẳng định, với tiến công nghệ, kỹ thuật hồi sức cấp cứu hiểu biết rõ xử trí cấp cứu rắn cắn người dân, khả đem đến hiệu tốt điều trị bệnh nhân RCN nam Vai trò HTKN-RCN bắc khẳng định nghiên cứu năm 2006 Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ cộng Với số bệnh nhân vào điều trị không trăm người năm cho thấy nhu cầu HTKN-RCN không lớn Tóm lại, cần sản xuất HTKN-RCN thực tế cần thiết tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao, khơng có cách khắc phục ngồi thở máy HTKNR đặc hiệu; nhiên, nhu cầu HTKNRCN hai loài rắn cạp nia nam rắn cạp nia bắc không cao Cũng nên sản xuất với qui mô nhỏ dạng đa giá F(ab’)2 gồm hai loài hợp lý 118 kỹ thuật kinh tế Về loại HTKNR nên ý: sản xuất HTKNR cần nhu cầu người bệnh Ở nhiều quốc gia có cơng nghệ Dược phẩm ngành sản xuất thuốc phát triển, nhu cầu không nhiều họ sản xuất cho đủ chủng loại [147], Hoa Kỳ, Đài Loan, Úc Theo nghiên cứu Wang J.D., et al (Đài Loan, 2009) [145], thống kê 55 trẻ em bị rắn độc cắn Đài Loan, chuẩn bị phương án sẵn sàng sử dụng HTKNR cho bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, nhiên, thống kê 13 năm, tác giả không gặp bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn để sử dụng thuốc (sản phẩm Bivalent với Naja naja atra) Hoa Kỳ có đến 6000 - 7000 nạn nhân rắn độc cắn /năm số tử vong có - người (do họ có đủ loại HTKNR sẵn sàng cung cấp cho cấp cứu, điều trị [137] Việt Nam nhu cầu HTKNR lớn Theo Nguyễn Thiên Tạo (2011) [39], Việt Nam nơi cư ngụ 193 loài rắn thuộc 69 giống, họ Trong số ghi nhận tổng số 53 lồi rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae 18 loài (8 giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae Như vậy, rắn độc chiếm 53/193 loài rắn Việt Nam, ~25%, cao gấp đơi so với số trung bình giới Hiện nay, cung cấp thị trường hai loại: HTKN rắn hổ đất HTKN rắn lục tre Các sản phẩm khác sản xuất phịng thí nghiệm HTKN rắn hổ chúa, HTKN rắn cạp nia nam, HTKN rắn hổ mang; cung cấp phạm vi hẹp, dạng sản phẩm nghiên cứu lâm sàng đa trung tâm theo Quyết định Bộ y tế HTKN rắn choàm quạp, rắn hổ đất + hổ mang Như vậy, sản xuất HTKNR (antivenom) Việt Nam nhiều việc phải làm Một xu hướng sản xuất HTKNR sản xuất HTKNR dạng đa giá Nói chung, với lồi rắn khác độc tính nọc, họ (Elapidae, Viperidae), chi (Bungarus), khả dễ chẩn 119 đoán nhầm lẫn vùng giáp ranh, xen kẽ nơi cư trú lồi rắn đó, sản xuất HTKNR đa giá; dùng cho nhau, chưa chẩn đốn xác định lồi chúng Thường thường, độc tính nọc rắn vào thể, cần trung hòa sớm tốt Chẩn đoán chậm trễ, dùng HTKNR muộn q khơng có hiệu hiệu thấp, nọc kịp gây hậu xấu, bệnh nhân tổn thương chết trước y tế kịp can thiệp HTKNR đa giá F(ab’)2 giải pháp tốt giải vấn đề KẾT LUẬN Đã sản xuất thành công HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), đạt yêu cầu với 8/8 tiêu Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009), đạt 9/10 tiêu WHO (Guidelines, 2008) HTKNR dùng cho người HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu sản xuất khẳng định tính “An tồn” “Hiệu lực” phịng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng cấp sở Kiểm định Quốc gia 120 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu người tình nguyện khỏe mạnh để xác định tính an tồn Nghiên cứu hiệu lực trung hịa độc tính nọc HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 với loại nọc rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam động vật thực nghiệm với cỡ mẫu lớn Thử lâm sàng với bệnh nhân tình nguyện bị rắn cạp nia cắn, nhiễm độc nặng; tiến tới thử lâm sàng đa trung tâm; ứng dụng kết nghiên cứu lâm sàng