Bài : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Khái niệm : Hoạt động hay hay hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn • Nguyên tắc : o Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định o Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm tương ứng với nồng độ enzyme xác đinh Đơn vị hoạt tính enzyme A Đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: i B Một đơn vị chuẩn enzyme ( U) lượng enzyme xúc tác chuyển hóa µmol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn U = µmol sản phẩm = µmol chất (10-6 mol)/phút Katal : Katal lượng enzyme xúc tác chuyển hóa mol chất sau giây điều kiện tiêu chuẩn 1kat = mol chất / giây = 60 mol / phút = 60 x 10 µmol/ phút = x 107 U U = 1/60 x 10-6 Kat = 16.67 nKat (nanokatal) 2.1 Hoạt tính riêng ( specific activity) enzyme : Hoạt tính riêng ă chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Hoạt tính riêng biểu thị số đơn vị enzyme/mg protein (U/mg pro) Thực hành: 3.1 Xác định protein theo Bradford : Ống nghiệm Dung dịch BSA 0.1 ĐC 0 Chuẩ n1 0.1 Chuẩ n2 0.2 Chuẩn 0.3 Chuẩ n4 0.4 Chuẩ n5 0.5 Mẫu X - mg/ml (ml) Nước cất (ml) Mẫu phân tích pha loãng hệ số F Nồng độ BSA (µg/ml) Thuốc thử Bradford(ml) - 0.9 - 0.8 - 0.7 - 0.6 - 0.5 - 200 10 20 30 40 50 2 Hình 2.1 : Enzyme sau Ly Tâm Hình 2.2 Các ống nghiệm chuẩn bị theo bảng Hình 2.1 : Số liệu thu nhận từ máy đo OD đường chuẩn Albumin 3.2 Xác định hàm lượng mẫu : P1 (mg/ml) = X*F Mà X = (0.390 – 0.004)/0.0083 = 46.5 P1 = 46.5 * 120 = 5,580(µg/ml) Hàm lượng từ chế phẩm thô : Po (mg/g) = P1*V/m  (5,580 * 100)/20 = 27900 (mg/g)  3.3 Xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến - Phương pháp dựa thủy phân protein casein enzyme protease có dịch nghiên cứu Định lượng sản phẩm tạo thành phẩn ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Follin – ciocalteu Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên Hóa chất HCl 0,2N Điệm phosphate pH (0,05M) Dung dịch casein 1% Na2CO3 6% Dung dịch trochlacetic acid 1mM (1µmol/ml) Thuốc thử Follin – ciocalteu (gọi tắc FC) Dung dịch enzyme: thu từ Tiến hành Dựng đường chuẩn tyrosine ống nghiệm (ĐC) Dung dịch tyrosine chuẩn 1µmol/ml (ml) 0, 0, 0, 0, Dung dịch HCl 0,2N (ml) 0, 0, 0, 0, Dung dịch Na2CO3 6% (ml) 5 5 5 Thuốc thử FC pha loãng (ml) 1 1 1 Nồng độ tyrosine (1µmol/ml) (tính) 0, 0, 0, 0, o Lắc để yên 37 C/30 phút Đo độ hấp thu dung dịch 750nm lấy mẫu đối chứng (ĐC) làm mẫu trắNg (Blank) HÌNH: ống mẫu đo OD dựng đường chuẩn Tyrosine Kết đo OD 750: 1µmol/ 0D750n ml m 0 0.2 0.145 0.4 0.246 0.6 0.379 0.8 0.601 0.704 Đường chuẩn Tyrosine Phản ứng xác định hoạt tính protease Hóa chất ống thí nghiệm ống đối chứng Dung dịch enzyme o ổn định nhiệt độ enzyme: 37 C/5 phút Casein 1% 37oC 2 o Phản ứng enzzyme: ủ 37 C/ 20 phút TCA (ml) 2,5 2,5 Dung dịch enzyme (ml) Kết tủa chât dư: lắc đều, ủ 37oC/ 30 phút Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa Dịch lọc (ml) 1 Na2CO3 5 FC pha loãng (ml) 1 o Phản úng tạo phức với FC ủ 37 C/30 phút Đo độ hấp thụ 750nm ATN ( ezyme thô) = AĐC = 0,520 ATN ( enzyme tinh sạch) = 0,149 Tính toán kết hàm lượng protein giải phóng enzyme protease thủy phân tính dựa vào đường chuẩn tyrosine từ (ATN - AĐC) suy X µmol/ml tyrosine sinh y = 0.6271x - 0.0022  X = = 0,234 µmol/ml hoạt tính dd enzyme pha loãng : HT1 (U/ml) = = = 0,07722 U/ml Hoạt tính chế phẩm enzyme thô HTo (U/g) = = = 38,61 (U/g) Xác định hoạt tính enzyme amylase Phương pháp dựa vào thủy phân chất tinh bột enzyme amylase (không phân biệt alpha glucoamylase) nguồn gốc nấm mốc pH 5.0 400c thành glucose Lượng đường khử sinh cho phản ứng với acid 2-hydroxy3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh sau phản ứng xác định phương pháp so màu quang phổ kế bước sóng 540nm ( phương pháp Miller, 1959 Hóa chất - Đệm Na-acetate 0.05M - Cơ chất: tinh bột tan - Dung dịch chất (1% W/V tinh bột): hòa tan 10g tinh bột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml nước cất bình định mức 100ml, lắc Đặt vào bếp cách thủy sôi, lắc liên tục tinh bột tan hoàn toàn Sau làm nguội bổ sung đệm Na-acetate 0.1M pH=5.0 đến vạch mức, lắc Dung dịch chuẩn bị ngày sử dụng Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS): cân 20g 2-hydroxy-3,5dinitrobenzoic (DNS), cho vào beaker 2000ml, thêm khoảng 800ml nước cất, đặt beaker vào chậu nước 800c khuấy đều, hòa tan 32g NaOH với 300ml nước cất, thêm dung dịch NaOH từ từ vào dung dịch, khuấy nhiệt 800c Tiếp tục thêm 600g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS tiếp tục khuấy nhiệt độ 800c Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng Chuyển dung dịch vào bình định mức 2000ml, thêm nước cất đến vạch lắc Bảo quản dung dịch DNS chai màu nâu có nắp - Dung dịch enzyme: thu từ 1, enzyme trích ly, dung dịch enzyme kết tủa sau hòa tan vào dung dịch đệm hay dung dịch thu sau sắc ký lọc gel Mẫu đun sôi: Tiến hành dựng đường chuẩn glucose Bảng dựng đường chuẩn glucose để xác định hoạt tính enzyme amylase Ống số Nồng độ glucose (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -dd glucose 1mg/ml (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -dd DNS (ml) 3 3 3 - nước cất (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Bảng bước xác định hoạt tính enzyme amylase Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng Dd enzyme (ml) Ổn định nhiệt độ enzyme 400c/5p Tinh bột 1% 400c/5p (ml) 1 Phản ứng enzyme 400c/20p Dd DNS(ml) 3 Dd enzyme đun sôi (ml) Đun sôi cách thủy 10p Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Đo mật độ quang A54nm Đường chuẩn glucose Atn Ađc Kết đo OD bước sóng 540nm: 0 0,1 0,148 0,2 0,322 0,3 0,511 0,4 0,675 0,5 0,851 Tính toán AG=a*G+b G 0,213489021 F(he so pha loang) 120 HT1(U/ml)=G*(1000/180)*(1/10 PHÚT)*(1/1.0ml)*F HT1 14,23260137 Atn-Adc ODx=A 0,355 HT(U/g)=HT*V/m Hàm lượng enzyme amylase P1(mg/ml) =X*F =0,355*100 =35,5 BÀI 5: CỐ ĐỊNH ENZYME Hóa chất - Dung dịch natri alginate3% - Dung dịch CaCl2 0,2M - Hóa chất xác định protein theo Bradford - Hóa chất xác định hoạt tính enzyme theo Tiến hành Cân 0,5g enzyme hòa tan dung dịch natri alginate3% Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan nhỏ từ độ cao 20 cm vào 50ml dung dịch 0,2M CaCl2 để tạo gel Quá trình tạo gel xảy giờ, nhiệt độ phòng Sau cố định, dung giấy lọc, lọc enzyme cố định Kết thu hạt gel enzyme nhốt khuôn gel Dịch lọc thu đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford hoạt tính Xác định hoạt tính enzyme amylase Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng Dung dịch enzyme (ml) Ổn định nhiệt độ enzyme 40ºC/5 phút Tinh bột 1% ủ 40ºC/5 phút (ml) 1 Phản ứng enzyme ủ 40ºC/20 phút Dd DNS (ml) 3 Dd enzyme đun sôi (ml) Đun sôi cách thủy 10 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Đo mật độ quang A540nm 0,060 5.3 Tính toán 1) Hiệu suất hoạt tính enzyme cố định Hiệu suất cố định enzyme tính theo công thức sau: Trong đó: H Enz%: Hiệu suất cố định enzyme (%) E0: Hoạt tính enzyme thể tích dùng để cố định Ef: Hoạt tính enzyme thể tích sau cố định V0: Thể tích dung để cố định Vf: Thể tích enzyme lại sau cố định 2) Hiệu suất protein enzyme cố định Hiệu suất cố định protein tính theo công thức sau: Trong đó: H Enz: Hiệu suất cố định enzyme P0: Nồng độ ban đầu protein V0: Thể tích ban đầu dung dịch enzyme Pf: Nồng độ protein tổng phần nước lọc Vf: Tổng thể tích phần nước lọc BÀI 6: KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ HOẠT ĐỘNG VÀ ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG ENZYME I Vật liệu: Xem II Tiến hành Xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme Nhiệt độ khảo sát 30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C giữ pH điều kiện tiêu chuẩn Sơ đồ xác định ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme Enzyme 30 0C 40 0C 50 0C 60 0C 70 0C Hoạt tính (U/ml) Nhiệt độ tối ưu Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng Dung dịch enzyme (ml) 0 ổn định nhiệt độ enzyme 40 C/5 phút Tinh bột 1% ủ 40 C/5 phút (ml) Phản ứng enzyme 40 0C/20 phút Dd DNS (ml) 3 Dd enzyme đun sôi (ml) Đun sôi cách thủy 10 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Kết đo dd enzyme nhiệt độ khác nhau: Đc TN 30 0C 0,846 40 0C 0,688 50 0C 0,477 70 0C 0,607 Kết luận: nhiệt 40 0C, 50 0C thích hợp Hệ số pha loãng ống 40 0C, 50 0C lần Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme Enzyme pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH7 Hoạt tính (U/ml) pH tối ưu Hóa chất ống thí nghiệm ống đối chứng Dung dịch enzyme ml ổn định nhiệt độ enzyme: 37 0C/ phút Casein % 37 0C ml 2 Phản ứng enzyme: ủ 37 0C/ 20 phút TCA ml 2,5 2,5 Dung dịch enzyme ml Kết tủa chất dư: lắc đều, ủ 37 0C/ 30 phút Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa Dịch lọc ml 1 Na2CO3 ml 5 FC pha loãng ml 1 Phản ứng tạo phức FC ủ 37 0C/ 30 phút Đo độ hấp thu 750 ODtn ODđc = nm Kết đo được: ODđc Odtn pH3 0,083 pH4 0,132 pH5 0,205 pH6 0,096 pH7 0,070 pH8 0,112 pH = thích hợp Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 0,627X – 0,002 => R2 =0,9952 • Ở pH = vào pt đường chuẩn: 0,083 = 0,627X3 – 0,002 => X3 = 0,135 Vận tốc ban đầu phản ứng enzyme: V03 = X/20 phút = 0,135/20 = 6,778.10-3 • Tương tự pH = 4, 5, 6, 7, X4= 0,214 => V04 = 0,0107 (µM/phút) X5 = 0,330 => V05 = 0,0165 (µM/phút) X6 =0,156 => V06 = 7,8.10-3 (µM/phút) X7 = 0,115 =>V07 = 5,75.10-3 (µM/phút) X8 = 0,182 => V08 = 0,1.10-3(µM/phút) Xác định thông số động học Michaelis-Menten Enzyme protease (µM/phút) Nồng độ chất casein (mg/ml) 10 10 Cơ chất 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 1 1 (ml) Đệm Phosphate , pH = (ml) Ổn định nhiệt độ t0pt, phút Enzyme 0 0 0 (ml) Phản ứng enzyme t0pt, 20 phút TCA 5% (ml) Enzyme 2, 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 1 1 1 0 0 (ml) Để yên 20 – 30 phút, lọc bỏ tủa lấy dịch Dịch lọc 1 1 1 1 1 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 (ml) Na2CO3 (ml) FC pha loãng (ml) Phản ứng tạo phức với FC: ủ 37°C, 30 phút Đo độ hấp thu 750 nm 0,26 0,35 0,41 0,50 1,28 0,29 0,36 0,43 0,98 Tính toán: Nồng độ tyrosine giải phóng enzyme protease thủy phân tính dựa vào đường chuẩn tyrosine (từ (ATN – AĐC) suy X µmol/ml tyrosine sinh ra) Vận tốc ban đầu phản ứng enzyme v0 (µM/phút) = X/20 phút 1.32