PHN TCH A D NG TRèNH T ADN TY TH V M I QUAN H DI TRUY N C A Bề HMễNG V I M T S QU N TH Bề KHC Ph m Doón Lõn1, Nguy n Tr ng Bỡnh1, Tr n Xuõn Hon1, V Chớ Cng1, Lờ ỡnh Lng v J.C Maillard3 Phũng TN tr ng ủi m Cụng ngh t bo ủ ng v t -Vi n Chn nuụi - Th y phng - T Liờm - H N i i h c Khoa h c T nhiờn - i h c Qu c gia - H N i Giỏm ủ c CIRAD vựng ụng Nam * Tỏc gi liờn h : Ph m Doón Lõn - Phũng Thớ nghi m tr ng ủi m Cụng ngh t bo ủ ng v t Tel: (04).2.166.147 / 0914 366 975; Fax: (04) 389.775; Email: pdlanvn@yahoo.com ABSTRACT Mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationships of HMong cattle to other cattle populations Hmong cattle is an local breed with unclear origin To assess the mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationship of Hmong cattle to various other cattle populations, we analyzed for partial (530bp) of mtDNA D-loop sequences of 26 Hmong cattle samples in conjunction with previous published sequences from Northeast Asian (Korea, Japan), Europe, Africa, India and American bison cattle The results showed that 14 haplotypes were observed in total of 26 analyzed cattle samples, indicating that the Hmong cattle population had a high diversity of mtDNA In phylogenetic analysis, the Hmong cattle samples were clustered into two distinct genetic lineages: taurine (Bos taurus) and zebu (Bos indicus) The Hmong zebu lineages are closely related to Indian zebu cattle and are clearly separate from other cattle populations while the Hmong taurine lineages, Eropean, African, Japanese and Korean cattle clustered together These results suggested that Hmong taurin lineages are closely related to cattle of Northeast Asian and Europe Keywords: Mitochondrial DNA diversity, phylogenetic relationship, Bos indicus, Bos taurus TV N Bũ cú vai trũ chớnh s phỏt tri n c a n n minh loi ng i v l m t nh ng loi v t nuụi thu n hoỏ cú ý ngha kinh t nh t Cú hai ph loi chớnh ủú l bũ khụng cú u (Bos taurus) v bũ cú u (Bos indicus) ủ u ủ c cho l b t ngu n t bũ r ng Chõu u (Bos primigenius) ủó t n t i t cỏch ủõy 8.000 - 10.000 nm v ủ c thu n hoỏ riờng bi t (Epstein, 1971; Epstein v Mason, 1984; Machugh v cs, 1997; Loftus v cs, 1994) Cỏc gi ng bũ hi n ủ u l cỏc bi n th c a hai ph loi Bos indicus v Bos taurus Tớnh d ng v di truy n, ngu n g c, s b o t n v l i ớch c a cỏc gi ng bũ ny ủó ủ c quan tõm nghiờn c u nhi u trờn Th gi i Bũ Hmụng hay bũ Mốo l m t gi ng bũ ủ a phng ủ c trng c a t nh H Giang, chỳng g n li n v i ủ i s ng v hoỏ c a ủ ng bo dõn t c Hmụng Cựng v i ng i Hmụng, bũ Hmụng sinh s ng bỏn cụ l p ủ cao cao trờn 1.000 so v i m t n c bi n ủú chỳng ớt b lai t p b i cỏc gi ng bũ khỏc Theo m t s gi thi t cho r ng bũ vng Vi t Nam cú ngu n g c t bũ cú u n (Bos indicus) v bũ vng Trung Qu c khụng cú u (Bos taurus) (Lờ Vi t Ly v cs, 1999) Tuy nhiờn cha cú m t b ng ch ng no m c ủ phõn t v s lai t p v ngu n g c gi a hai dũng bũ cú u v bũ khụng cú u bũ Vng Vi t Nam núi chung v bũ Hmụng núi riờng ủ c cụng b Trong nghiờn c u ny chỳng tụi trỡnh by: M t s k t qu phõn tớch s d ng trỡnh t ADNvựng D-loop ty th , xỏc ủ nh s lai t p gi a hai lo i bũ cú u v bũ khụng cú u qu n th bũ Hmụng ủ ng th i so sỏnh m i quan h di truy n gi a bũ Hmụng v i m t s qu n th bũ khỏc c a Nh t B n, Hn Qu c, n , Chõu Phi, Chõu u, v bũ r ng M (Bison bison) LI U V PHNG PHP NGHIấN C U i t ng nghiờn c u Hai mi sỏu cỏ th bũ Hmụng ủ c ch n ng u nhiờn cỏc huy n ng Vn, Mốo V c, Xớn M n v Hong Su Phỡ c a t nh H Giang Trỡnh t nucleotit vựng D-loop ty th c a cỏc m u bũ Nh t B n, Hn Qu c, n , Chõu u, Chõu Phi bũ r ng Chõu M ủ c thu th p t ngõn hng gen Qu c t (GeneBank) Tỏch chi t ADN v nhõn ADN ủ c hi u (PCR) Quy trỡnh tỏch chi t ADN h gen t cỏc m u mụ tai c a 26 cỏ th bũ Hmụng ủ c th c hi n theo b kớt tỏch QIAamp c a hóng Qiagen ( c) Vựng ADN D-loop ty th cú kớch th c 990 bp ủ c nhõn ủ c hi u b i ph n ng PCR v i c p m i ủ c hi u cú trỡnh t : M i xuụi: 5-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3 M i ng c: 5-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3 Ph n ng PCR ủ c ti n hnh t ng th tớch 50 àl bao g m: m PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200 àM m i lo i dNTP (A,T,G,C), 0,2 àM m i lo i m i xuụi, m i ng c v 50-100 ng ADN khuụn Ph n ng PCR ủ c th c hi n theo cỏc b c: Tr c tiờn ADN ủ c bi n tớnh 94oC phỳt, ti p theo ủú v i 32 chu k, m i chu k ủ c th c hi n ủi u ki n nh sau: bi n tớnh 92oC phỳt, g n m i 55oC phỳt, t ng h p chu i ADN 72oC phỳt 20 giõy Cu i cựng k t thỳc ph n ng 72oC 10 phỳt Ph n ng gi i trỡnh t S n ph m PCR sau ủú ủ c tinh s ch b ng b Purification kit) c a hóng Qiagen ( c) kớt tinh s ch (QIAquick PCR Ph n ng gi i trỡnh t ủ c th c hi n tr c ti p t cỏc s n ph m PCR ủó ủ c tinh s ch v i c m i xuụi v ng c s d ng b kớt gi i trỡnh t (DTCS-Quick Start Master Mix) c a hóng Beckman Coulter v ủ c ti n hnh phõn tớch trờn mỏy gi i trỡnh t CEQ8000 Phõn tớch trỡnh t Trỡnh t nucleụtit vựng D-loop ty th c a cỏc m u bũ Hmụng ủ c so sỏnh v i trỡnh t cỏc m u bũ c a Nh t B n, Hn Qu c, n , Chõu u, Chõu Phi, bũ r ng M (B s binson) v trỡnh t ton b ADN ty th c a hai m u bũ khụng cú u v cú u ủ i ch ng v i mó truy c p trờn ngõn hng gen tng ng l V00654 v NC-005971 s d ng cụng c CLUSTALW ph n m m BIOEDIT v DNAsp o Kho ng cỏch di truy n gi a cỏc trỡnh t vựng D-loop ty th c a cỏc nhúm bũ ủ c tớnh theo phng phỏp c a Tamura v Nei (1993) Cõy quan h di truy n (phylogenetic tree) ủ c xõy d ng b ng ph n m m MEGA phiờn b n 4.0 (Kuma v cs, 1994) K T QU V TH O LU N S d ng trỡnh t ADN vựng D-loop ty th ADN ty th l m t d ng v t li u di truy n n m ngoi nhõn ủ c di truy n theo dũng m Chỳng cú t l ủ t bi n cao hn 5-10 l n so v i h gen nhõn, ủ c bi t vựng ki m soỏt D-loop (displacement loop) cú t l thay ủ i r t cao ủú th ng ủ c s d ng cỏc nghiờn c u v phõn lo i v ngu n g c ti n hoỏ c a cỏc loi Ti n hnh gi i trỡnh t ADN vựng D-loop ty th c a cỏc m u bũ Hmụng chỳng tụi thu ủ c ủo n trỡnh t nuclờụtit cú ủ di 530 bp (base pair) trờn ủ di 990 bp c a s n ph m PCR o n trỡnh t ny cú v trớ t nuclờụtit 15813 ủ n 16343 c a ton b trỡnh t ADN ty th ủ c cụng b b i Anderson v c ng s (1982) v i mó truy nh p trờn ngõn hng gen Qu c t l V00654 So sỏnh v phõn tớch trỡnh t D-loop ty th c a 67 m u bũ bao g m: Hmụng (26 m u); Hn Qu c (4 m u bũ vng); Nh t B n (9 m u bũ ủen), n (6 m u g m cỏc gi ng Harianna, Sahiwal, Tharparkar); Chõu Phi (8 m u g m cỏc gi ng: Butana, Fulani, Kenana v NDama); Chõu u (12 m u g m cỏc gi ng: Aberdeen Angus, Charolais, Friesian, Here ford, Jersey v Simantal) v m u ủ i ch ng c a bũ cú u v khụng cú u, k t qu cho th y xu t hi n 39 ki u di truy n ủn ty th (haplotype) v cú 50 ủi m hỡnh (polymorphic site) trờn ton b ủo n trỡnh t ADN ủ c phõn tớch (530 bp) Trong s 26 m u bũ Hmụng ủ c phõn tớch thỡ cú 14 ki u di truy n ty th ủ c xỏc ủ nh, k t qu ủ c trỡnh by Hỡnh Hỡnh 1: Sai d ng trỡnh t vựng D-loop ty th c a 67 m u bũ phõn tớch Ký hi u c a cỏc m u ủ c th hi n c t th nh t: EU (Chõu u); AF (Chõu Phi); JP (Nh t B n); KR (Hn Qu c); VN (Viờt Nam); IN ( n ) V00654 v NC005971- tng ng l trỡnh t ADN ty th chu n c a m u bũ khụng cú u (B taurus) v bũ cú u (Bos indicus) Ký hi u (-) ch s tng ủ ng gi a cỏc nuclờụtit, (*) m t ho c thờm nuclờụtit s Qua hỡnh cho th y trỡnh t ADN vựng D-loop ty th bũ Hmụng ủ c tỏch bi t thnh hai nhúm: nhúm Hmụng v i cỏc m u t VN1 ủ n VN9 cú trỡnh t c a dũng bũ khụng cú u (Bos taurus); nhúm Hmụng v i cỏc m u t VN10 ủ n VN14 cú trỡnh t c a dũng bũ cú u (Bos indicus) Trong s 26 m u bũ Hmụng ủ c phõn tớch ng u nhiờn K t qu cho th y, cú 14 m u thu c dũng bũ cú u v 12 m u thu c dũng bũ khụng cú u (Hỡnh 2) i u ủú cho th y r ng tớnh d ng ADN ty th c a qu n th bũ Hmụng l tng ủ i cao Kho ng cỏch v m i quan h di truy n Kho ng cỏch di truy n trung bỡnh gi a cỏc qu n th bũ ủ c c l ng d a trờn phng phỏp c a Tamura-Nei K t qu ủ c th hi n B ng B ng 1: Ma tr n kho ng cỏch di truy n gi a cỏc qu n th bũ bao g m c bũ r ng M theo Tamura-Nei [1] Chõu u [2] Chõu Phi [3] n [4] Nh t B n [5] Hn Qu c [6] Hmụng [7] Hmụng [8] Bũ r ng M [1] 0,000 0,008 0,060 0,007 0,007 0,058 0,007 0,135 [2] [3] [4] 0,000 0,061 0,013 0,011 0,060 0,012 0,133 0,000 0,065 0,063 0,004 0,058 0,140 0,000 0,009 0,064 0,009 0,139 [5] [6] [7] [8] 0,000 0,062 0,010 0,139 0,000 0,057 0,137 0,000 0,133 0,000 Qua B ng cho th y, kho ng cỏch di truy n gi a bũ r ng M v cỏc qu n th bũ khỏc (Chõu u, Chõu Phi, n , Vi t Nam, Hn Qu c, Nh t B n) ủ u l n hn 0,1 Trong ủú, kho ng cỏch di truy n gi a bũ n , Hmụng (thu c dũng bũ cú u) v cỏc qu n th bũ thu c dũng khụng cú u (Chõu u, Nh t B n, Hn Qu c, Chõu Phi, Hmụng1) l n hn 0,05 Kho ng cỏch di truy n gi a qu n th bũ Chõu u, Chõu Phi, Nh t B n, Hn Qu c v Hmụng dao ủ ng kho ng 0,0070,013 Kho ng cỏch di truy n gi a nhúm bũ HMụng v bũ cú u n l 0,004 Cõy phõn loi di truy n hỡnh cho th y qu n th bũ Hmụng nhúm v Chõu u, Chõu Phi, Hn Qu c, Nh t B n ủ u thu c dũng bũ khụng cú u v cú m i quan h g n ủ ng th i chỳng tỏch bi t so v i bũ cú u n v bũ r ng M Trong ủú nhúm bũ Hmụng cú m i quan h di truy n r t g n v i qu n th bũ cú u n M c dự k t qu tớnh kho ng cỏch di truy n trờn B ng cho th y, gi a nhúm bũ Hmụng v bũ Chõu u, Hn Qu c, Nh t B n cú m i quan h di truy n g n hn so v i nhúm bũ Chõu Phi tng ng l (0,007-0,01) v (0,012) nhng cõy phõn loi di truy n (Hỡnh 2) khụng cho th y cú s tỏch bi t h n gi a cỏc nhúm bũ Chõu Phi v Hmụng 1, Chõu u, Hn Qu c v Nh t B n K t qu nghiờn c u c a chỳng tụi gi ng v i k t qu nghiờn c u c a Kim v cs (2003), nghiờn c u m i quan h di truy n c a m t s gi ng bũ c a Hn Qu c cng khụng cho th y s tỏch bi t gi a bũ Hn Qu c, Chõu u v Chõu Phi Trong ủú, Mannen v cs (1998) nghiờn c u ngu n g c c a gi ng bũ ủen Nh t B n (B taurus) d a trờn phõn tớch trỡnh t ADN ty th ủó cho th y s tỏch bi t gi a bũ Chõu u v i bũ Chõu Phi Trong ủú, m t s cỏ th bũ ủen c a Nh t B n cú m i quan h di truy n g n gi v i bũ c a Chõu u ÂĂ Ngoi ra, m t s nghiờn c u khỏc cng ủó cho r ng h u h t cỏc gi ng bũ ngy cú ngu n g c thu n hoỏ t khu v c khỏc nhau: Khu v c Tõy l ngu n g c c a bũ cú u (Bos indicus) bao g m cỏc gi ng bũ cú u n hi n nay, vựng C n ụng v Chõu Phi l ngu n g c c a bũ khụng cú u -Bos taurus (Bradley v cs, 1996; Loftus v cs, 1994; Troy v cs, 2001) Cho dự cỏc gi ng bũ Chõu Phi hi n chỳng cú ủ c ủi m hỡnh thỏi l d ng trung gian c a hai ph loi Bos indicus v Bos taurus nhiờn ngu n g c xu t hi n ban ủ u Chõu Phi ủ c cho l bũ Bos taurus JP U87635 JP U87633 KR AF409056 JP U87639 JP U87638 JP U87637 JP U87636 VN8 JP U87634 Bos taurusV00654 VN22 VN5 VN13 VN14 JP U87640 EU L27716 EU L27726 JP U87650 EU L27734 EU L27717 EU L27735 KR AF409055 EU L27718 EU L27719 EU L27727 EU L27712 EU L27725 KR AF409057 EU L27713 VN23 VN17 VN19 VN1 VN15 VN25 EU L27724 AF L27730 AF L27731 AF L27728 AF L27720 AF L27721 AF L27729 VN11 KR AF409054 AF L27714 AF L27715 VN4 VN20 VN24 IN L27723 VN18 IN L27722 IN L27732 IN L27736 IN L27737 IN L27733 Bos indicusNC005971 VN2 VN43 VN6 VN7 VN9 VN10 VN12 VN16 VN21 VN26 Bison U12946 Bison U51848 Bison U12936 Bison U12955 Bison U12959 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 Bũ khụng u Bos taurus Bũ cú u Bos indicus Bũ r ng M Bison bison 0.00 H 2: Cõy quan h di truy n c a 67 m u bũ Vi t Nam (VN), Hn Qu c (KR), Nh t B n (JP), n (IN), Chõu u (EU), Chõu phi (AF), m u bũ r ng Chõu M (Bison) v m u bũ cú u v khụng cú u ủ i ch ng tng ng l V00654, NC00597 W b Ênỡ Theo tỏc gi Phillips (1961) v Payne (1995) thỡ cỏc gi ng bũ b n ủ a c a Trung Qu c v Vi t Nam l s lai t p gi a bũ cú u (Bos indicus) v bũ khụng cú u (Bos taurus) Th c v y nh n ủ nh ny phự h p v i k t qu nghiờn c u c a chỳng tụi trờn qu n th bũ Hmụng (t l bũ cú u chi m 53,8%) cng nh k t qu nghiờn c u c a Xin Cai v cs (2006) 18 gi ng bũ b n ủ a trờn ton lónh th Trung Qu c thỡ bũ khụng u ch y u t p trung phớa B c v i t l 81,8-100% cỏc gi ng v ủ c cho l du nh p t Mụng C kho ng th i gian gi a 3766-3122 nm tr c Cụng Nguyờn Trong ủú bũ khụng cú u ch y u t p trung phớa Nam Trung Qu c v i t l 63,3-100% cỏc gi ng K T LU N Qua phõn tớch sai khỏc trỡnh t ADN vựng D-loop ty th trờn qu n th bũ Hmụng cho th y tớnh d ng di truy n ADN ty th l tng ủ i cao Qu n th bũ Hmụng cú ngu n g c t s lai t p c a hai dũng bũ khụng cú u (B s taurus) v cú u (Bos indicus), t l bũ cú u chi m 53,8% Ô Dũng bũ khụng cú u qu n th bũ Hmụng cú m i quan h di truy n g n v i bũ khụng u c a Hn Qu c, Nh t B n (cú ngu n g c du nh p t bũ khụng u phớa B c Trung Qu c) v Chõu u, ủú dũng bũ cú u cú m i quan h di truy n g n gi v i bũ cú u n K t qu nghiờn c u ủó b c ủ u cung c p b ng ch ng m c ủ phõn t cho th y phự h p v i nh n ủ nh r ng bũ Vng Vi t Nam cú ngu n g c t bũ cú u n (Bos indicus) v bũ Vng Trung Qu c khụng cú u (Bos taurus) TI LI U THAM KH O Lờ Vi t Ly., Hong Kim Giao., Mai Vn Sỏnh., Vừ Vn S , Lờ Minh S t, (1999) Chuyờn kh o b o t n ngu n gen v t nuụi Vi t Nam T p I: Ph n gia sỳc Nh xu t b n nụng nghi p, H n i Anderson, S., de Bruiji, M H., Coulson, A R., Eperon, I C., Sanger, F., and Young, I g, (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA Conserved features of the mammalian mitochondrial genome J Mol Boil 156, pp 683-717 Bradley, D G., Machugh, D E., Cunningham, P and Loftus, R T, (1996) Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle Poc Natl Acad Sci USA 93, pp 5131-5135 Epstein, H., (1971) The origin of domestic animals of Africa Aficana Publishing Corporation, New York Vol.1, pp 185-555 Epstein, H., and Mason, I L, (1984) Evolution of domesticated animal Edited by I L Mason Long man, New York, pp.6-27 Kim, K I., Lee, J H., Lee, S S and Yang, Y H, (2003) Phylogenetic relationships of Northeast Asian cattle to other cattle populations determined using mitochondrial DNA D-Loop sequence polymorphism Biochem Gentic 41, pp 91-98 Kuma, S., Tamura, K and Nei, M, (1994) Molecular evolutionary genetic analysis software for microcomputers Comput.Appl.Biosci 10, pp 189-191 Loftus, R T., Machugh, D E.,Bradley, D G., Sharp, P M and Cunnigham, P, (1994) Evidence for two independent domestications of cattle Proc.Natl Acad Sci USA 91, pp.2757-2761 Machugh, D E., Shriver, M D., Loftus, R T.,Cunningham, P and Bradley, D G (1997) Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication and phylogeography of taurine and zebu cattle (B Taurus and Bos indicus) Genetic 146, pp.1071-1086 Mannen, H., Tsuji, S., Loftus, R T and Bradley, D G, (1998) Mitochondrial ADN variation and evolution of Japanese black cattle (Bos taurus) Genetic 150, pp 1169-1175 Payne WJA, (1995) Diffusion of cattle throughout of Asia in tropical cattle: origins, breeds and breeding policy Black well Sciences Ltd., Oxford, pp 15-22 Phillips W, (1961) World distribution of the major types of cattle J Heredity 86, pp 248-249 Tamura, K., and Nei, M, (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Mol Biol Evol 10, pp 512-526 Troy, C S., Machugh, D.E., Balley, J F., Magee, D A., Loftus, R T., Cunnigham, P., Chamberlain, A T., Sykes, B C., and Bradley, D G, (2001) Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle Nature 410, pp 1088-1091 Xin Cai., Hong Chen., Chuzhao Lei., Shan Wang., Kai Xue and Bao Zhang, (2006) mtDNA diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos Taurus and Bos indicus in China Genetica, DOI 10.1007/s10709-006-9129-y ƯƠ