KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Khóa luận hoàn thành phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lân Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Mạnh Cường công tác làm việc phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – người thầy dạy dỗ, bảo tận tình suốt trình thực đề tài khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể anh chị cán phòng thí nghiệm giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình tạo điều kiện cho trình nghiên cứu Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội truyền cho kiến thức bổ ích suốt năm học tập Cuối gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ thời gian thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Thị Hẹn SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography Sắc ký cột Mini - C Mini Column Chromatography Sắc ký cột tinh chế Proton-Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry HR-ESI-MS High Resolution Electronspray Ionization Mass Spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence Spectroscopy Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết H-NMR HCTN Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 Phổ DEPT Phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử Hợp chất thiên nhiên AST Aspartate aminotransferase Enzym chuyển hóa aspartat ALT Alanine aminotransferase Enzym chuyển hóa alanine SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG BIỂU SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC SƠ ĐỒ SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Việc sử dụng thuốc Tây lâu dài hay dùng nhiều nguyên nhân làm cho quan thể chịu nhiều tác dụng không mong muốn Gan thận quan có chức chuyển hóa thải trừ loại thuốc sau hết tác dụng dược lý Chính hai quan thường bị ảnh hưởng nhiều dẫn đến việc chức chúng bị suy giảm Từ ngàn xưa, ông cha ta biết đến thuốc cổ truyền bào chế từ thảo dược có tác dụng hữu hiệu phòng, trị bệnh Tác dụng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe thảo dược người chủ yếu hợp chất tự nhiên sẵn có mà chúng sinh tổng hợp, tích lũy trình sinh trưởng phát triển Do sử dụng chúng để phòng trị bệnh thời gian dài mà không gây độc hại cho thể không xuất hiện tượng kháng thuốc Đây ưu điểm bật vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên Nhiều thuốc tác dụng chữa bệnh mà giúp cân lại âm dương Ngoài công dụng chữa bệnh mạn tính, số thuốc chữa bệnh cấp tính, nan y ung thư cổ tử cung, ung thư gan, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi, viêm gan cấp tính… có hiệu cao Việt Nam có lợi nằm khu vực nhiệt đới, nước có y học cổ truyền phát triển từ lâu đời Việc đào sâu tìm kiếm phát thuốc, hoạt chất thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viên gan, ung thư gan nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu Gần đây, báo điện tử tỉnh Khánh Hòa số báo in khác có đăng tin loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) xã Ninh Vân, SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP tỉnh Khánh Hòa có khả chữa bệnh xơ gan cổ trướng Theo báo chí, số người bị bệnh xơ gan giai đoạn cuối sử dụng thuốc sắc từ rễ thân thuốc chữa khỏi bệnh [1] Loài chưa nghiên cứu cụ thể nước nước Do vậy, đề tài này, tiến hành nghiên cứu xác định thành phần hóa học, hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutaceae Việt Nam nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển hiệu dược liệu việc điều trị bệnh gan nói riêng bệnh khác nói chung Theo hướng nghiên cứu ấy, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutacea Việt Nam” Khóa luận gồm nội dung sau: - Thu mẫu thực vật tạo dịch chiết phân đoạn - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan dịch chiết thân rễ Xáo tam phân mô hình chuột BALB/c gây độc gan paracetamol - Phân lập hợp chất từ phân đoạn CHCl3 thân rễ Xáo tam phân - Kết xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ phân đoạn CHCl3 thân rễ Xáo tam phân SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Paramignya Chi Paramignya Cựa gà, hay Xáo thuộc họ Cam (Rutaceae) Robert Wight đặt vào năm 1839 tác phẩm Illustrations of Indian Botany, vol 1, dựa loài chuẩn Paramignya monophylla Wight thu Ấn Độ Ông cho đặc tính “leo” chi cho thấy gần gũi với chi Luvunga [2] 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Paramignya Chi Paramignya dạng gỗ trườn, có gai mọc nách Lá dạng kép lá, mép nguyên, có nhiều tuyến tinh dầu.Cụm hoa mọc nách lá, hoa lưỡng tính màu trắng Đài có 4-5 thùy, thùy dính gốc thành hình chén Tràng hoa có 4-5 cánh, tiền khai lợp Bộ nhị có 8-10 nhị, nhị rời nhau, bao phấn thuôn dài Cuống bầu ngắn, noãn dính hoàn toàn, bầu 3-5 ô Quả mọng, hình cầu trứng, lông hình túi nước mọng (tép), vỏ dày Hạt to, dẹt hai bên, vỏ hạt mỏng, phồng lên [3] 1.1.2 Phân bố chi Paramignya Trên thực tế, việc phân loại chi Paramignya, năm 2008 Zhang cộng cho chi Paramignya có khoảng 15 loài chi phân bố chủ yếu Nam Á, Đông Nam Á miền Bắc nước Úc [4] 1.1.3 Phân loại chi Paramignya Theo liệu thực vật học nhiều tổ chức nghiên cứu nhà thực vật Vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh) Vườn Thực vật Missouri (Hoa Kỳ), đến năm 2013, có 30 loài cho thuộc chi Paramignya Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa thống nhà phân loại học thực vật Gần đây, Zhang D X [4] cho chi Paramignya có khoảng 15 loài phân bố Nam Á, Đông Nam Á miền Bắc nước Úc SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tại Việt Nam, chi Paramignya Phạm Hoàng Hộ ghi nhận loài bao gồm [5]:  Paramignya armata Oliv var andamanica King (Cựa gà, Gai xanh, Quýt gai) [5] Paramignya andamanica dạng thân gỗ trườn, thân cao 1-4 m, cành mảnh, non có lông, trưởng thành nhẵn, gai đơn, dài Lá chét hình trứng ngược, dai, có nhiều tuyến nhỏ, đỉnh nhọn, có mũi, gốc tròn, gân bên 10-12 đôi, cuống dài, có lông non Cụm hoa mọc nách lá, có 1-2 hoa, hoa có bắc, nụ hoa mảnh, cuống hoa dài cuống Đài thuỳ hình tam giác tù, nhẵn mép có lông ngắn Tràng cánh hoa, nhẵn đỉnh tròn Bộ nhị có 10 nhị, nhị rời nhau, gốc nhị nhẵn có lông thưa, bao phấn hình bầu dục thuôn Bầu nhẵn có ô, vòi nhụy mảnh, thuôn, lông, đầu nhụy phồng thuỳ Quả hình tròn, chín có màu vàng Cây nở hoa vào tháng 8, có vào tháng 10 đến tháng 12 Paramignya andamanica phân bố chủ yếu Đà Nẵng, Khánh Hoà (Nha Trang, Phú Hữu), Đồng Nai trồng Nam Cây tìm thấy Ấn Độ, Andaman, Lào, Campuchia Ngoài ra, ăn được, đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho [6]  Paramignya monophylla Wight (Xáo hoa) [5] Paramignya monophylla gỗ nhỏ, leo trườn, cành nhỏ, có gai cong, dài Lá mọc cách, dai, hình thuôn, bầu dục, gốc tròn, mép nguyên, cuống dài nhẵn Cụm hoa có hay vài hoa, mọc nách Đài thuỳ, hình tam giác tù, dính hình chén, mặt có lông.Tràng cánh hoa, gốc có lông, phía có lông thưa nhẵn, đầu nhụy phồng.Quả hình cầu, giống cam nhỏ, chín có màu vàng Xáo hoa loại ưa sáng, hoa vào tháng 6, tháng đến tháng 10 [7] Phân bố: Cây phân bố Vĩnh Phúc (Phúc Yên), Hà Nội (Ba Vì), Nghệ An (Pù Mát) Còn có Ấn Độ [7] SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  Paramignya scandens (Griff) Craib (Xáo leo) [5] Paramignya scandens loại gỗ nhỏ, thân trườn, cành màu nâu có lông mịn, có gai dài nhỏ, cong có lông Lá mọc cách, hình trứng, đỉnh có khía rõ, gốc tròn, cuống có lông mịn Đài 4-5 thuỳ nhỏ, hình tam giác nhọn, gốc dính thành hình chén, có lông Tràng 4-5 cánh hoa, hình dải, nhẵn Bộ nhị có 8-10 nhị, nhị mảnh, nhẵn hay có lông, bao phấn ngắn hình bầu dục, có tuyến nhỏ đỉnh Bầu hình bầu dục, nhẵn hay có lông, ô, ô chứa noãn, vòi nhụy nhẵn có lông, đầu nhụy phồng Quả hình trứng dài Xáo leo ưa bóng, ưa ẩm [7] Mùa hoa vào tháng 4- 6, có từ tháng đến tháng Cây có tỉnh Hà Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng có Lào, Thái Lan, Mianma  Paramignya hispida Pierre ex Guillaum (Cựa gà nhám) [5] Loài Paramignya hispida gỗ nhỏ, có gai cong xuống, dài đến cm, nhánh mảnh, lúc non có lông Lá phiến to, xoăn tròn dài, đáy hình tim, gân phụ không rõ Hoa đơn, đài, có lông mặt ngoài, cánh hoa cao 1cm, tiểu nhụy 10, rời làm thành thư đài, không lông, buồng, noãn với dạng sáo tròn, trái nhỏ Paramignya hispida sống theo dạng bụi leo Cựa gà nhám tìm thấy Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai [7]  Paramignya griffithii Hook (Xáo Grifith) [5] Paramignya griffithii tiểu mộc leo Có gai cong, cành mảnh, có phiến bầu dục, rộng nửa trên, mỏng, hai mặt nâu lọt lúc khô Gân phụ từ năm đến bảy cặp, cuống dài, hoa có từ đến ba hoa mọc nách lá, cong, mảnh, đài hình đĩa, tiểu nhụy từ 6-10 rời nhau, ngắn bao phấn, dĩa mật, não sào có lông Trái xanh, tròn to Xáo Grifith phân bố Khánh Hoà (Nha Trang), Lâm Đồng [7]  Paramignya petetotii Gruill (Xáo petelot) [5] SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 12: Gan chuột cho uống Hình 13: Gan chuột cho uống SPO4 SPO3 10g/kg+PAR 400mg/kg 10g/kg+PAR 400mg/kg Hình 14: Gan chuột cho uống Silymarin 50 mg/kg+PAR 400mg/kg Như vậy, hình thái trực quan lô chuột cho uống HCTN106+PAR 400 mg/kgP cho kết giống với đối chứng dương Silymarin, gan tất chuột bình thường nhu mô gan đồng nhất, không thấy tượng phù hay nhu mô sần sùi thoái hóa đổi màu Điều chứng tỏ khả bảo vệ gan dịch chiết HCTN106 với liều10g/kgP tốt 3.1.6 Kết làm tiêu mô bệnh học gan Để khẳng định rõ khả bảo vệ gan hoạt chất nghiên cứu, tiến hành làm tiêu mô bệnh học mẫu gan quan sát vi thể tiêu Quan sát vi thể: Tiêu gan cố định Bouin, nhuộm He SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Kết vi thể gan chuột thí nghiệm quan sát kính hiển vi thể qua hình ảnh sau Hình 15: Tiêu gan mẫu đối chứng PAR Nhu mô gan hoại tử, không bè gan tế bào nhu mô gan Hình 16: Tiêu gan thử với dịch chiết HCTN106 Cấu trúc tổ chức gan rõ với tiểu thùy khoảng cửa Có tổn thương nhỏ tế bào gan, mạch máu xung huyết Các bè gan không rõ cấu trúc, tế bào nhu mô gan có dấu hiệu thoái hóa, nhiều vùng không rõ hình thái tế bào SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 17: Tiêu gan mẫu đối Hình 18: Tiêu gan mẫu đối chứng dương Silymarin chứng âm Các tế bào nhu mô gan thoái hóa hạt nhẹ, mạch máu xung huyết nhẹ Các tế bào nhu mô gan bình thường Kết nghiên cứu tiêu mô học cho thấy, đối chứng dương Silymarin có hoạt tính bảo vệ tốt, gan không bị tổn thương bị thoái hóa hạt xung huyết nhẹ tác động paracetamol Mẫu HCTN106 cho thấy khả bảo vệ gan tốt với tổn thương, có xung huyết tổn thương nhỏ tế bào gan 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ dịch chiết clorofom Dựa vào kiện phổ thu sau tách chiết, ta tiến hành xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân tách sau: 3.2.1 Cấu trúc hợp chất MC – 390 (Chất mới)  Cấu trúc hóa học SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 19: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-390 Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (+) với hai pic ion giả phân tử m/z 302.1072 [M+H]+ 324.0878 [M+Na]+ cho biết công thức phân tử MC390làC16H15NO5 Trên phổ 13C-NMR hợp chất MC- 390, cho tín hiệu 16 cacbon, nhóm metin hệ vòng thơm C-3 (δC 94.70, d), C-5 (δC 117.10, d), C-7 (δC 120.90, d), C-6 (δC123.90, d); nhóm metoxyl 2-OCH3 (δC 56.70, q), 1-OCH3 (δC60.70, q); nhóm N-CH3 (δC 47.0, q); cacbon bậc nhóm cacbonyl C-9 (δC 183.8, s) Trên phổ 1H-NMR hợp chất MC- 390 cho thấy tín hiệu proton thơm hệ ABX δH 7.73 (1H, dd, 7.5 Hz; 1.5 Hz, H5), 7.14 (1H, t, 7.5 Hz, H-6), 7.19 (1H, dd, 7.5 Hz; 1.5 Hz, H-7), đặc trưng cho proton thơm vòng benzen 1,2,3 Ngoài ra, phổ xuất tín hiệu singlet hai nhóm metoxyl δH3.77 (1-OCH3), 3.96 (2-OCH3) nhóm CH3 liên kết với dị tố Nito δH3.81 (10-NCH3) Các kiện cho phép dự đoán hợp chất MC- 390 alkaloid N-metylacridone có nhóm thế.Cấu trúc hợp chất MC- 390 chứng minh kiện phổ hai chiều (HMBC NOESY) Trên phổ HMBC hợp chất MC- 390 xuất tương tác singlet proton nhóm -NCH3 với hai cacbon bậc bốn C-8a (δC 138.78, s), C-9a (143.57, s) cho phép xác định vị trí 10 nguyên tử Nito khung acridone Metin proton thơm singlet δH 6.42 (H-3) có tương tác HMBC với bốn cacbon bậc bốn, bao gồm C-1 (δC 131.50, s), C-2 (161.30, s), C-4 (161.30, s), C-4a (107.20, s) Hơn nữa, tương tác NOESY proton hai nhóm metoxyl (-OCH3) xác định hai nhóm có dạng vicinal SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 20: Tương tác phổ HMBC NOESY hợp chất MC-390 Kết hợp kiện phổ chiều, chiều, phổ khối lượng so sánh với tài liệu tham khảo [20-23], xác định hợp chất Citrusinine-I 3.2.2 Cấu trúc hợp chất MC- 392 (Chất mới)  Cấu trúc hóa học Hình 21: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-392 Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (+) với pick ion m/z 233.1172 [M+H]+, 267.0782 [M+Cl]+, 255.0992 [M+Na]+ chứng minh công thức phân tử MC- 392 C14H16O3 Phù hợp với công thức phân tử trên, phổ 13CNMR/DEPT hợp chất MC- 392 có tín hiệu 14 cacbon, bao gồm nhóm metyl C-13 (23.29, q), hai nhóm oxymetilen C-12 (68.5, t) C-11 (63.32, t), nhóm metin C-3 (δC 129.04, d), C-7 (127.90, d), C-5 (125.06, d), C-4 (124.40, d), C-8 (116.88, d), C-9 (129.71, d) C-10 (128.72, d), bốn cacbon bậc bốn C-6 (131.05, s), C-4a (122.11, s), C-8a (153.42 , s),vàC-2 (80.2, s) vùng trường cao Trên phổ1H-NMR, hợp chất MC- 392 xuất tín hiệu đặc trưng proton khung benzopyran, với hai cặp proton tương tác ortho H-3/H-4 H-7/H-8, tín hiệu proton duplet δH 7.09 (H-5, d, Hz) Hợp chất MC- 392 có nhóm methyl singlet δH1.35 (H-13) nhóm oxymetilen multiplet δH3.53-3.63 (H-12) Hai proton olefin δH 6.49 (H-9, d, J = 16 Hz) δH 6.22 (H-10, dt, J = 5.5; 16 Hz), có cấu hình trans (J = 16 Hz)được dự đoán thuộc liên kết đôi mạch nhánh Phổ HMBC MC–392 khẳng định khung benzopyran với tương tác proton H-4 với C-2, C-8a; H-3 với C-2, C-4a; H-5 với C-8a; H-8 với C-6, C-4a Nhóm SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP methyl CH3 (C-13) xác định gắn trực tiếp với C-2 qua tương tác HMBC CH3-13với C-2 Phổ NOESY cho thấy proton methyl H-13 có tương tác với metin proton H-3 nhóm oxymetilen H-12, điều cho phép xác định oxymetilen H-12 vào vị trí C-2 Mạch nhánh allylhydroxyl xác định gắn vị trí C-6 vòng benzopyran có tương tác phổ HMBC olefin proton H-9 với cacbon C-5, C-7, H-10 với C-6 Phổ COSY MC–392 khẳng định thứ tự nhánh allylhydroxyl với tương tác H-10/H-9, oxymetilen proton H-11 Đây lần hợp chất khung chromen với mạch nhánh allylhydroxyl phát Hợp chất MC–392 có độ quay cực [α]D25 – 6.9o(c 0.02, MeOH), tương tự với độ quay cực [α]D22 – 9.9o(c 0.66, MeOH) Quercinol (một chromen có loại nhóm vị trí C-2) Do vậy, cấu hình tuyệt đối C-2 hợp chất MC–392 xác định 2S [24] Hình 22: Tương tác phổ COSY, HMBC NOESY hợp chất MC-392 Dựa vào kiện phổ chiều, chiều tài liệu tham khảo [24], xác định hợp chất MC–392 hợp chất chromen đặt tên Chromenin 3.2.3 Cấu trúc hợp chất MC–393  Cấu trúc hóa học SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 23: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-393 Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (+) với peak ion giả phân tử m/z 315.1609 [M+H]+ chứng minh công thức phân tử củaMC–393 C19H22O4 Trên phổ13C-NMR/DEPT hợp chất MC–393 xuất tín hiệu 19 cacbon, gần tương tự hợp chất ostruthin, bao gồm metyl, nhóm metylen, nhóm metin, cacbon bậc bốn nhóm cacbonyl Phổ 1H-NMR hợp chất MC– 393cũng cómột cặp proton thơm H-3/H-4 có tương tác ortho, hai singlet δH 6.72 (H-8) 7.29 (H-5), cho thấy coumarin hai lần vị trí C-6 C-7 Ngoài ra, có tín hiệu mạch nhánh với 10 cabon, bao gồm tín hiệu hai nhóm metyl CH3-9' (δH1.72, s), CH3-10' (δH1.74, s), proton nhóm hydroxylmetin H-6' (δH 4.00,t) Hai proton olefin H-8' (δH 4.81-4.90), H-2' (δH 5.38), nhóm metylen với peak dạng multilet δH 1.67 [2H, m, H-4'], 2.09 [2H, m, H-5'], 3.33 [2H, m, H-1'] Dữ kiện phổ hai chiều HMBC, COSY, NOESY sử dụng để xác định khung, vị trí coumarin mạch nhánh SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 24: Tương tác phổ COSY, HMBC, NOESY hợp chất MC-393 So sánh kiện phổ hợp chất với hợp chất công bố [25] kết luận hợp chất MC- 393 hợp chất lần phân lập từ chi Hợp chất MC- 393 phân lập trước từ Eriostemon tomentellus [25] 3.2.4 Cấu trúc hợp chất MC- 424 ( Chất )  Cấu trúc hóa học Hình 25: Cấu trúc hóa học hợp chất MC- 424 Phổ HR-ESI-MS với hai pic ion giả phân tử m/z 315.1568 [M+H]+ 337.1362 [M+Na]+ cho phép xác địnhcông thức phân tử hợp chất MC-424 C19H22O4, công thức với hợp chất MC-393 Phổ 13C-NMR/DEPT hợp chất MC–424 có tín hiệu 19 nguyên tử cacbon, tương tự kiểu vị trí với coumarin 6, bao gồm nhóm metyl, nhóm metilen, nhóm metin, nguyên tử cacbon bậc bốn Tương tự hợp chấtMC–393, phổ 1H-NMR hợp chất MC–424 xuất tín hiệu dạng duplet H-3 (δH6.20, 9.5 Hz), H-4 (7.56, 9.5 Hz) singlet H-8 (6.85, s), H-5 (7.10, s) Mạch nhánh gồm hai nhóm metyl singlet CH3-9' (δH1.63, s), CH3-10' (δH1.70, s), nhóm metilen nhóm metin olefin nhóm hydroxylmetin Các kiện phổ hai chiều khẳng định hợp chất coumarin vị trí C-6,7 Proton metilen H-1' (δH 2.93, m) oxymetin H-2' (δH 4.45, dd, Hz) có tương tác HMBC với C-6, khẳng định vị trí mạch SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP nhánh C-6 Phổ COSY cho thấy có tương tác proton nhóm metilen H-1' oxymetin H-2', proton metilen H-5' (δH 2.17, m) với proton metilen H-4' metin olefin H-6' (δH 5.12, t, Hz) Dữ kiện phổ khẳng định vị trí nhóm olefin metilen H-8' hai nhóm gem-metyl CH3-9' CH3-10' liên kết trực tiếp với cacbon bậc bốn olefin C-7' Hình 26: Tương tác phổ COSY, HMBC, NOESY hợp chất MC-424 Kết hợp kiện phổ so sánh với tài liệu tham khảo [25], xác định hợp chất MC-424 hợp chất đặt tên Trimethin SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Sau thời gian thực khoá luận tốt nghiệp phòng Hoạt chất sinh học với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng bảo vệ gan Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutacea Việt Nam”, đạt mục tiêu sau: Giới thiệu đối tượng nghiên cứu Xáo tam phân (Paramignya trimera) chi, loài thông qua tài liệu tham khảo nước Đánh giá tác dụng bảo vệ gan động vật thí nghiệm (chuột)  dịch chiết clorofom từ thân rễ Xáo tam phân qua tiêu sau: • Chỉ số AST 116.50 ± 34.65 UI/L, ALT 81.25 ± 8.59 UI/L • Nồng độ cholesterol toàn phần 2.78 ± 0.49 mmol/l • Nồng độ protein toàn phần 61.55 ± 1.41 mmol/l • Khối lượng gan 0.404 ± 0.011 g/10g thể • Hình thái gan bình thường, không bị phù, hay sần sùi • Tiêu mô bệnh học gan thấy có xung huyết nhẹ Dịch chiết clorofom liều 10g/kgP có tác dụng ngăn cản rõ rệt độc tính paracetamol tương đương với đối chứng Silymarin 50mg/kgP (thuốc cí tác dụng bảo vệ gan bán thị trường) Như dịch chiết  clorofom liều 10g/kgP có tác dụng tốt bảo vệ gan Xây dựng quy trình tách chiết phân lập hợp chất từ phân đoạn để xác định hợp chất hợp chất có hoạt tính bảo vệ gan Đã xây dựng quy trình chiết xuất phân lập chất MC-390 (Chất mới), MC-392 (Chất mới), MC- 393 MC- 424 (Chất mới) từ dịch chiết clorofom Xáo tam phân Bằng phương pháp sắc ký cột phân lập bốn hợp chất MC-390 (Chất mới), MC-392 (Chất mới), MC–393 MC–424 (Chất mới) theo danh sách đây: Bảng 8: Bảng tổng hợp kết chất phân lập STT Code SVTH: Nguyễn Thị Hẹn Cấu trúc MW-MF Tên KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MC-390 MW: 302 MF: C15H14N2O5 Mới Citrusinine-I 6-(3- Mw: 232 MC-392 Mf: C14H16O3 Mới Hydroxypropen-1yl)-2-methyl-2methylol)-2H-1benzopyrane Chromenin 6-(3,8-dimethyl-6Mw: 314 MC- 393 Mf: C19H22O4 hydroxyl-2,7octadien-yl)-7hydroxy-2H-1benzopyran-2one) Mw: 314 MC- 424 Mf: C19H22O4 Mới Trimethin  - ĐỀ XUẤT Đưa phương án tối ưu để tách chiết với khối lượng lớn mẫu thực vật Xáo - tam phân Thử hoạt tính bảo vệ gan hợp chất tách từ phân đoạn TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Trần Giỏi Lưu Hồng Trường, Cây thuốc quý Hòn Hèo – Khánh Hòa, Báo Điện tử tỉnh Khánh Hòa, 2012 2) Robert Wight, Might, Illustrations of Indian botany vol 1, 108-109, 1839 3) Bùi Thu Hà Nghiên cứu phân loại họ Cam (Rutaceae Juss.) Việt Nam Luận án Tiến sĩ Sinh học – Hà Nội Tr 116 – 120, 2012 SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4) Zhang, D.X., T.G Hartley, and D.J Mabberley., Rutaceae, Flora of China, 2008, 11- 88 5) Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Vol 2, 437-439, 2000 6) Võ Văn Chi, T.H., Cây cỏ có ích Việt Nam, 1999, Nxb Giáo dục, Hà Nội 7) Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật – Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia, Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập 2003, Nxb Nông nghiệp 8) Kumar, V., N.M.M Niyaz, S Saminathan, and D.B.M Wickramaratne, Coumarins from Paramignya monophylla root bark, Phytochemistry, 1998, 49 (1), 215-218 9) A., Jayawerra.D.M., Medicinal Plants (Indigenous and Exotic) Used in Ceylon, Part V Colombo, A publication of the National Science Council of Sri Lanka, 1982 10) N.M.M Niyaz, Kumar, V., and D.B.M Wickramaratne, Coumarins from stem bark of Paramignya monophylla, Phytochemistry, 1995, 38 (3), 805-806 11) Kumar, V., N.M.M Niyaz, D.B.M Wickramaratne, and S Balasubramaniam, Tirucallane derivatives from Paramignya monophylla fruits, Phytochemistry, 1991, 30 (4), 1231-1233 12) Wattanapiromsakul, C and P.G Waterman, Flavanone, triterpene and chromene derivatives from the stems of Paramignya griffithii, Phytochemistry, 2000, 55 (3), 269-273 13) Wiart, C., Medicinal Plant of Asia-Pacific-Drugs for the Future Vol Library Cataloguing-in-Publication Data, 2006, World Scientific Publishing Co Pte Ltd., British, 380 14) Kumar, V., N.M.M Niyaz, and D.B.M Wickramaratne, Coumarins from stem bark of Paramignya monophylla, Phytochemistry, 1995, 38 (3), 805-806 15) Nguyễn Hữu Toàn Phan, Ninh Thị Diệu Thuần, Nông Văn Duy, Ninh Thị Ngọc, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, “Các hợp chất Glycosit phân lập SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP từ Xáo leo-Paramygnia scandens”, Tạp Chí Khoa Học Và Công Nghệ, 52 (5A), 69-75, 2014 16) Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương, “Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan tác dụng gây độc tế bào ung thư Xáo tam phân” Tạp Chí Dược Liệu, Tập 18, số 1/2013 17) Chau Van Minh, Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi Mai Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, “ Two tirucallane derivatives from Paramignya sacandens and their cytotoxic activity”, Phytochemistry Letters, 9, 78-81, 2014 18) Nguyễn Mạnh Cường, Hồ Việt Đức, Nguyễn Văn Tài, Phạm Ngọc Khanh,Vũ Thị Hà, Trần Thu Hường, Nguyễn Duy Nhất, “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học Xáo tam phân họ Rutaceae”, Tạp Chí Hóa Học, 51(3), 292-296, 2013 19) Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi Mai Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, “ Two tirucallane derivatives from Paramignya sacandens and their cytotoxic activity”, Phytochemistry Letters, 9, 78-81, 2014 20) Chihiro Ito, Yuichi Kondo, Tian-Shung Wu and Hiroshi Furukawa , “Structures of four new Acridones and three new Quinolone Alkaloids”, Chem Pharm Bull 48(1), 65-70, 2000 21) Djalma A P dos Santos, Paulo C Vieira, M Fatima das G F da Silva, Joao B Fernandes, Lauren Rattray and Simon L Croft, “Antiparasitic activities of Acridone Alkaloid from Swinglea glutinosa (BI.) Merr.”, J Braz Chem Soc., Vol., 20, No 4, 644-651, 2009 22) Tian-Shung Wu and Hirosh Furukawa, “Constituent of Citrus sinensis Osbeck var brasiliensis Tanaka Isolation and characterization of three new Acridone Alkaloid, and a new coumarin”, Chem Pharm Bull, SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 31(3), 901-906, 1983 23) Yuko Takemura, Yoshiko Isono, Motoharu Ju-Ichi, Mitsuo Omura, Chihiro Ito, and Hiroshi Furukawa, “Azacridone-A, the first naturally occurring Azaacridone Alkaloid from Citrus plant”, Chem Pharm.Bull 41(4) 789-790, 1993 24) P.Gebhardt et al., “Quercinol, an anti-inflammatory chromene from the wood-rotting fungus Daedalea quercina (Oak Mazegill)”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,17, 2558-2560, 2007 25) M A Rashid, J A Armstrong, A I Gray, P G Waterman Novel Cgenaryl-7-hydroxylcoumarins from the aerial parts of Eriostemon tomentellus, Zeitschrift fuer Naturforschung, 47B, 284-287, 1992 SVTH: Nguyễn Thị Hẹn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: Nguyễn Thị Hẹn 54