ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS Vi Thị Đoan Chính tận tình giúp đỡ trình thực hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Phú Hùng cán môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN nhiệt tình giúp đỡ Xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngô Đình Quang Bính cán phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học công nghệ Việt Nam Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN tạo nhiều điều kiện để hoàn thành luận văn Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh tạo điều kiện cho đƣợc học tập hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô, bạn bè đồng nghiệp động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình ngƣời thân yêu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Thái nguyên, ngày 15 tháng năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn .5 1.1.4 Cấu tạo xạ khuẩn 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .10 1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 10 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN .12 1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12 1.3.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 15 1.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.4 MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18 1.4.1 Một số bệnh hại chè nấm 18 1.4.2 Các chất kháng sinh bảo vệ thực vật .21 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu hóa chất .24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu chè 27 2.2.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28 2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3.Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29 2.2.3 Bảo quản giống 29 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 30 2.2.4.1 Đặc điểm hình thái 30 2.2.4.2 Đặc điểm nuôi cấy 31 2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31 2.2.5 Lên men tạo kháng sinh .32 2.2.5.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 32 2.2.5.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon 33 2.2.5.3 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ 33 2.2.6 Các phƣơng pháp sinh học phân tử phân lập gen 16S - rRNA 33 2.2.6.1 Tách chiết DNA xạ khuẩn đệm CTAB 33 2.2.62 Khuếch đại gen 16S - rRNA phản ứng PCR 34 2.2.6.3 Phƣơng pháp điện di gel agarose 35 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập khiết chủng nấm gây bệnh chè 37 3.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 38 3.2.1 Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn 38 3.2.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41 3.3 Đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại chủng XK Đ1 R2 42 3.3.1 Đặc điểm hình thái 42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43 3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .45 * Khả đồng hóa nguồn cacbon .45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp 46 * Khả chịu muối 46 * Khả sinh enzym ngoại bào 47 3.3.4 Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 48 3.3.5 Vị trí phân loại hai chủng xạ khuẩn R2 Đ1 50 3.4 Khả sinh tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn lựa chọn 52 3.4.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52 3.4.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon 54 3.4.3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 56 3.5 Phân loại chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57 3.5.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng xạ khuẩn 57 3.5.2 Kết nhân gen 16S - rRNA phản ứng PCR 58 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận .60 Kiến nghị nghiên cứu 61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Đặc điểm số mẫu chè làm nguồn phân lập chủng nấm 37 Bảng 3.2 Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39 Bảng 3.Tính đối kháng xạ khuẩn với chủng nấm gây bệnh chè .40 Bảng Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.5 Đặc điểm nuôi cấy chủng R2 Đ1 .44 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn Đ1 R2 45 Bảng 3.7 Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp chủng R2 Đ1 46 Bảng 3.8 Khả chịu muối chủng R2 Đ1 47 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 với chủng nấm kiểm định .48 Bảng 3.10 So sánh đặc điểm phân loại chủng R2 với S misawaensis 50 Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại chủng Đ1 với A brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn môi trƣờng lên men khác 53 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 55 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 .56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1 Ba chủng nấm phân lập từ mẫu chè bị bệnh 38 Hình Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu .39 Hình 3.3 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm .40 Hình 3.4 Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn lựa chọn 42 Hình 3.5 Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng R2 42 Hình 3.6 Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng Đ1 .43 Hình 3.7 Khả hình thành sắc tố melanin chủng 44 Hình 3.8 Hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn .47 Hình 3.9 Hoạt tính kháng chủng nấm kiểm định chủng Đ1 R2 49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả tổng hợp CKS 54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp CKS .55 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp CKS 57 Hình 3.13 Ảnh điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn .58 Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn nghiên cứu 59 -1- MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam nước nông nghiệp nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm Mưa điều kiện thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt VSV gây bệnh thực vật Vì việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật từ lâu phổ biến Việt Nam Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường độc hại tồn dư đất, nước nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ người, gây ô nhiễm môi trường cân sinh thái Chính vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương FAO năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học tảng chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phát triển quần thể ký sinh Một hướng nghiên cứu theo xu hướng sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế quần thể VSV gây bệnh Trong số tác nhân sinh học thường sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ loài có khả sinh CKS cao, có nhiều CKS có khả chống nấm mạnh Thái nguyên tỉnh giàu tiềm nông, lâm nghiệp Trong chè loại chủ đạo hàng năm bệnh nấm gây thiệt hại nặng nề, làm giảm suất chất lượng sản phẩm Vì việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật xây dựng nông nghiệp an toàn bền vững Xuất phát từ lý trên, từ xu hướng nghiên cứu giới để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô phong phú Thái Nguyên Chúng thực đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -22 Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh chè - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên - Các chủng vi nấm gây bệnh chè Thái Nguyên * Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng nấm gây bệnh chè để sử dụng làm VSV kiểm định Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ mẫu đất khác Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh lựa chọn Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả tạo thành CKS chủng lựa chọn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Chúng có đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số VSV [43] Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có lớp đất kiềm axit lớp đất kiềm, số lượng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm Một đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả sinh chất kháng sinh Cho tới khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh [6] Trong số có 15% có nguồn gốc từ loại xạ khuẩn Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng ý xạ khuẩn cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng y học gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hoá nhiều hợp chất đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym proteaza, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -4amylaza, xenluloza…một số axit amin axit hữu Một số xạ khuẩn gây bệnh cho người, động vật [7] 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm bật xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh nấm mốc với đường kính thay đổi khoảng 0,2 m đến m, chiều dài đạt tới vài cm [10],[22] Kích thước khối lượng hệ sợi thường không ổn định phụ thuộc vào điều kiện sinh lý nuôi cấy Kích thước hệ sợi xạ khuẩn đặc điểm phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn khuẩn lạc nấm mốc hệ sợi nấm mốc có đường kính lớn, thay đổi từ 50 m, dễ quan sát mắt thường Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài điều kiện ngoại cảnh Kích thước hình dạng khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài tuỳ vào điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính khuẩn lạc chừng 0,5 mm có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm lớn Khuẩn lạc có lớp, lớp vỏ có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản phẩm trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể tích luỹ sinh khối tế bào xạ khuẩn hay tiết môi trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -5* Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi xạ khuẩn phát triển thành loại: loại cắm sâu vào môi trường gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức chủ yếu sinh sản Nhiều loại có hệ sợi chất có loại (như chi Sporichthya) lại có hệ sợi khí sinh Khi HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn giai đọan phát triển 11 m/giờ [43] chất nhân tế bào xạ khuẩn xếp đặn theo chiều dài sợi Do đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi trương lên, sau - xuất trình tổng hợp ARN, nhân gene cần thiết từ genom tiến hành tổng hợp protein, sợi hình thành phát triển Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử bên chứa bào tử nang [7] 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn hình thành nhánh phân hóa khuẩn ty khí sinh - gọi cuống sinh bào tử Đó quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử bào tử đặc điểm quan trọng phân loại xạ khuẩn Cuống sinh bào tử xạ khuẩn có dạng thẳng lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời tất chiều dài cuống sinh bào tử theo cách: kết đoạn hay cắt khúc thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn xù xì, có gai gai phát triển dài thành dạng lông [9] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -6Bào tử xạ khuẩn bao bọc màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A0 chia lớp Các lớp tránh cho bào tử khỏi tác động bất lợi điều kiện ngoại cảnh nhiệt độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử cấu trúc màng bào tử tính trạng tương đối ổn định đặc điểm quan trọng dùng phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên tính trạng có thay đổi định nuôi cấy môi trường có nguồn nitơ khác [13] Muốn kích thích hình thành bào tử trước hết phải kích thích sinh trưởng khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp kích thích hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm 1.1.4 Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương, toàn thể tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân thể ẩn nhập Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng trì hình dáng khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm lớp: Lớp dày khoảng 60 120A0, già đạt tới 150 200A0, lớp rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp dày khoảng 50A0 Các lớp chủ yếu cấu tạo từ lớp glucopeptide bao gồm gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic liên kết 1,4 Khi xử lý lyzozym, liên kết 1,4 - glucozit glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi bị phá huỷ xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân lớp có cấu tạo chủ yếu lipit (thành HSKS có nhiều lipit so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose kitin chứa nhiều enzym tham gia vào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -7trình trao đổi chất trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], [32], [35] [36] Căn vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn chia thành nhóm [6], [8] Nhóm I: Thành phần thành tế bào axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm Nhóm II: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) glyxin Nhóm III: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic Nhóm IV: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose galactose Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50 nm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipit protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trình trao đổi chất trình hình thành bào tử xạ khuẩn Nguyên sinh chất nhân tế bào xạ khuẩn khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất xạ khuẩn chứa mezoxom thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol) Tuy nhiên, điểm khác biệt xạ khuẩn so với sinh vật prokaryote chỗ chúng có tỷ lệ G + C cao DNA, thường lớn 55%, vi khuẩn tỷ lệ 25 45% [11] Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên yếu tố di truyền nhiễm sắc thể có yếu tố di truyền nhiễm sắc thể, chúng tự nhân lên mà Lederberg gọi plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý có thêm khả phân giải số hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -8chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh, chuyển gene, sản xuất chất kháng sinh đất môi trường tuyển chọn [3] Xạ khuẩn thuộc loại thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng đường, tinh bột, rượu nhiều chất hữu khác Nguồn nitơ hữu protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô nitrat, muối amôn…Khả đồng hoá chất loài hay chủng xạ khuẩn khác khác 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI Cùng với phát triển mạnh sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học nên việc định tên chủng xạ khuẩn tiến hành tương đối nhanh chóng xác với nhiều phương pháp phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh Song người ta chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học sinh học phân tử 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho chủng xạ khuẩn cần định loại biểu đầy đủ đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng môi trường dinh dưỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh ghi lại đặc điểm hình thái nuôi cấy xạ khuẩn, đặc biệt quan mang bào tử, hình dạng bề mặt bào tử Theo Pridham cộng [38], cuống sinh bào tử chia thành nhóm: RF cho cuống sinh bào tử thẳng lượn sóng RA cho cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ ngắn S cho cuống sinh bào tử phát triển mạnh xoắn Việc sử dụng đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy coi liệu dùng phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên ta biết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -9xạ khuẩn không bền vững mặt di truyền, thường xuyên xảy xếp lại phân tử DNA Trong loài biểu khác hình thái hay loài khác giống mặt hình thái Vì để phân loại xác, ngày người ta phải dùng thêm tiêu khác bổ sung đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [45] 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại sử dụng rộng rãi hiệu vòng 20 năm trở lại Đây phương pháp có hiệu thông qua việc định tính định lượng thành phần hóa học tế bào VSV Hóa phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm sau: - Typ thành tế bào dựa sở phân tích axit amin thành phần peptit đường thành tế bào hay polysaccarit gắn vào thành tế bào - Typ peptidoglycan (PG) dựa vào thông tin thành phần cấu trúc mạch tetrapeptit PG cầu nối peptit liên kết mắt xích PG - Axit mycolic phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium cornebacter Đây đặc điểm phân loại cho chi - Axit béo thường sử dụng phân loại axit béo bão hòa mạch thẳng không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso enteiso metyl hóa nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) đặc điểm để phân loại đến chi [11] - Photpholipit có typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -10Trong phân loại xạ khuẩn typ thành tế bào đặc điểm quan trọng Khi muốn đưa loài mô tả loài có ý nghĩa đó, người ta không xác định thành tế bào 1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả biến đổi chất khác nhờ hệ thống enzym Nhu cầu oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng phát triển khác nhau, tính chất đối kháng nhạy cảm với chất kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác xạ khuẩn Hopwood (1975) khẳng định phần lớn đặc điểm sinh lý - sinh hóa đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động có giá trị thấp mặt phân loại Do tính không ổn định biến dị cao xạ khuẩn mà ngày nguyên tắc sử dụng đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn phải thay đổi [29] 1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) Để phát loài sở khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta sử dụng kết dựa phân loại số Phương pháp dựa đánh giá số lượng mức độ giống VSV theo số lớn đặc điểm chủ yếu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh chủng xạ khuẩn với đôi một, người ta vào hệ số giống (hệ số S - Similarity) có công thức tính hệ số S hay sử dụng - Công thức Sokal Michener (SSM ) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -22 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có... hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng 3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên * Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định 2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có... chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên Chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi. .. năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã... gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất. .. cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. .. galactose Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập... hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 8chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3] Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm. .. kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau 3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ... Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ quan sát bằng mắt thường Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều