ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học đã tận tì nh hướng dẫn và dì u dắt quá trì nh hoàn thành luận văn Luận văn thực Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với hỗ trợ kinh phí Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010 Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy tạo điểu kiện cho học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học , đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải – Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng , KS Hà Hồng Hạnh đã giúp đỡ và chỉ bảo rất tận tì nh suốt thời gian thực tập và thực hiện luận văn vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên liệu bèo cho luận văn Cuối cùng , xin dành cho gia đì nh và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho suốt quá trì nh học tập và hoàn thành khóa luận Học viên Trần Thị Kim Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Trần Thị Kim Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHƢ̃NG TƢ̀ VIẾT TẮT Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal v/p 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide vòng/phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kích thước gen nhân số loài bèo 1.2 Thành phần hàm lượng hợp chất hữu có cánh bèo 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 43 pJETSpUbipin6R 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hoa Lemna gibba 1.2 Cây phân loại bèo theo Landolt cộng 1.3 Sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 11 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin thực vật 14 2.1 Lemna aequinoctialis DB1; Spirodela polyrrhiza DB2 21 3.1 Điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 33 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 34 bèo Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) vị trí mồi 3.3 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 36 3.4 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 38 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 39 3.6 Trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài bèo 40 Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán vùng chức promoter 3.7 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 44 bèo Lemna aequinoctialis DB1 vị trí mồi 3.8 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 với dự 49 đoán vùng chức promoter Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan Những từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Mục lục Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bèo 1.1.1 Phân bố bèo 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo 1.1.3 Cây phân loại bèo 1.1.4 Hình thức sinh sản bèo 1.1.5 Hệ gen bèo 1.1.6 Giá trị dinh dưỡng 1.1.7 Tiềm sử dụng bèo công nghệ sinh học 1.2 Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật 10 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật 10 1.2.2 Cấu trúc promoter 11 1.2.3 Vai trò biểu gen promoter 13 1.2.4 Phân loại promoter 13 1.2.5 Ứng dụng promoter công nghệ gen thực vật 15 1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bèo 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.1 Nguyên liệu 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel Agarose 24 2.2.3 Nhân gen kỹ thuật PCR 24 2.2.4 Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 2.2.5 Xác định trình tự gen 30 2.2.6 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ bèo 31 3.2 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài S polyrhiza 33 3.2.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 3.2.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pJET1.2 33 3.2.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 38 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 39 3.3 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài L aequinoctialis 43 3.3.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 3.3.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pCR1.2 44 3.3.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 46 3.3.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Khi người có sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, khu vực Tiểu Á lưu vực sông Nin người ta bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích trì cải thiện chất lượng giống trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu người ngày tốt Con người biết tạo giống trồng mang đặc tính mong muốn phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính hai dòng trồng) Phương pháp cần nhiều thời gian, công sức nhiều trường hợp lai thu kèm theo tính trạng không mong muốn Ngày nay, công nghệ gen sử dụng phương pháp đại khắc phục hạn chế Công nghệ gen cho phép nhà di truyền chọn giống thực vật xác định thiết kế gen đặc hiệu cho mục tiêu mong muốn (kể gen có nguồn gốc từ sinh vật khác loài) chuyển gen vào giống sử dụng, tạo giống trồng biến đổi gen mang đặc tính đáp ứng yêu cầu người đem lại lợi ích quan trọng tăng tính chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng suất chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng Công nghệ gen thực vật mở khả sử dụng thực vật nhà máy sản xuất loại thuốc cần thiết cho người vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin loại thuốc chữa bệnh khác [3] Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh gen có giá trị mã hoá cho tính trạng mong muốn, promoter cần thiết cho biểu gen nhận quan tâm đặc biệt nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật Promoter thành phần quan trọng cấu trúc tất gen, khởi đầu cho phiên mã, đóng vai trò then chốt việc biểu gen Việc phân lập promoter biểu gen hữu hiệu trồng, đặc biệt promoter đặc hiệu cho loại cây, biểu loại mô tế bào khác ngày quan tâm đến Nhiều promoter từ gen thực vật phân lập số phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter gen mã hóa sucrose synthase [4] Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn mặt tế bào tất giai đoạn sinh trưởng, protein tham gia vào trình phân giải polypeptide tế bào chất, đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ tế bào chuyển hóa chất tế bào Promoter Ubiquitin gen từ ngô sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật [22], [41], [53] Bèo mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein polysaccharide cao Với đặc thù cấu trúc trình trao đổi chất, bèo sử dụng công nghệ gen thực vật nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp Một số promoter bèo phân lập promoter gen SSU5A, SSU5B, promoter gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1) có phản ứng với điều kiện chiếu sáng cảm ứng ABA nghiên cứu trình quang hợp [18], [61] Để tăng cường hiệu chuyển gen, sử dụng promoter truyền thống promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo Lemna minor phân lập, nghiên cứu hoàn thiện Mỹ, đánh giá có hiệu cao đăng ký thành patent [24] Ở Việt nam có loài bèo phát thấy Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza Wolffia globosa nhiều vùng khác Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ loài bèo Việt Nam phục vụ cho việc thiết theo vector mang gen đem lại lợi ích cho người để chuyển vào bèo tấm, chúng xin đăng ký thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2” với nội dung sau đây: Hoàn thiện phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2; Nghiên cứu thiết kế mồi đặc hiệu nhân đoạn yếu tố điều khiển biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2 PCR; Tách dòng xác định trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bèo 1.1.1 Phân bố bèo Bèo với tên khoa học Lemnaceae loài sinh vật thủy sinh có khả tồn phát triển nhiều nơi giới, trừ vùng cực bắc cực nam quanh năm giá lạnh Ở vùng sa mạc vùng ẩm ướt có mặt bèo Trong chi thuộc loài bèo chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) phân bố khắp giới, Wolffia tìm thấy châu Mỹ châu Phi Spirodela có tâm phân bố Nam Mỹ Chi Lemna có tính đa dạng cao Bắc Mỹ Đông Nam Á Wolffiella phân bố chủ yếu vùng ven nhiệt đới châu Mỹ châu Phi Wolffia tồn chủ yếu châu Mỹ, Đông Nam Á châu Úc Lemna aequinoctialis phân bố rộng rãi vùng có khí hậu ấm áp giới Cùng với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi nhiều vùng khác như: Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…[36] Ở Việt Nam, phát thấy có loài bèo thuộc chi khác (Spirodela, Lemna, Wolffia) loài L aequinoctialli, S polyrrhiza W globosa [36] Hiện nay, loài bèo phân bố phổ biến vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng tập trung nhiều khu vực đồng Bắc Bộ Nam [7], [36] 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo Lemnaceae thuộc nhóm mầm nhỏ phần lớn có lá, rễ, hoa, quả, trưởng thành thân Lá (cánh bèo) có kích thước khác phụ thuộc vào chi, loài 1.1.2.1 Đặc điểm cánh bèo Dạng thân giống loài Lemnaceae gọi “frond” (cánh bèo), tập hợp mô có biệt hóa hạn chế Mức độ tổ chức mô cánh bèo họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella Wolffia [36] Cánh bèo không dạng phẳng mà tồn u lồi đặc trưng có định vị gân lá, trưởng thành thường có từ 4-7 gân non có gân Đa số bèo có cánh mỏng giống Một số loài có cánh không dẹt có xoang khí Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn lớn Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm rộng tới cm (S polyrrhiza, L trisulca) Loài nhỏ có cánh đạt kích thước mm điều kiện tối ưu Ở điều kiện thường nhỏ mm (Wolffia) Kích thước hình dạng cánh bèo phụ thuộc nhiều vào điều kiện bên kiểu gen chúng Các yếu tố ngoại cảnh bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi magie, nhiệt độ…[36] 1.1.2.2 Đặc điểm rễ bèo Kích thước số lượng rễ cánh bèo loài bèo không giống phụ thuộc vào loài [36] Đa số loài thuộc họ Lemna có rễ, S polyrrhiza có từ 7-12 rễ nhiều dài đến 10 mm, Landoltia có 23 rễ lên đến rễ với chiều dài tối đa đạt mm Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay chất khoáng, rễ dài Trong đó, môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn chí có loại không hình thành rễ Cấu trúc rễ bèo đơn giản, rễ không phản ánh tăng trưởng tạo nhánh Vì lẽ đó, rễ bèo mảnh nhỏ Cũng giống loại rễ phổ biến khác, rễ bèo có cấu tạo gồm phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài, vùng tế bào thục 1.1.2.3 Hoa bèo Hoa loài bèo nghiên cứu tương đối kĩ Chúng thường hình thành tồn thời gian ngắn quan sát thấy Hoa loài bèo hình thành thời gian ngắn hay dài khác tuỳ thuộc vào loài Mỗi hoa thường có nhị hoa vòi nhụy hoa Các nhụy hoa thường ngắn khó quan sát Quả bèo đa phần nhỏ, có lớp vỏ khô, số quan sát thấy mắt thường Quả bèo thường có dạng túi có cưa, có dạng dọc phẳng, thường chứa từ 1-6 hạt [36] Hình 1.1 thể số đặc điểm hoa bèo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Hình 1.1 Hoa Lemna gibba 1.1.3 Cây phân loại bèo Hình 1.2 Cây phân loại bèo theo Landolt cộng Theo Landolt, bèo thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Liliopsida, Arales, họ Lemnaceae gồm chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Woffiela với 40 loài khác [36] Ông phân loại bèo dựa số rễ kích thước cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)… Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Năm 2002, Les cộng dựa đặc điểm hình thái nhiễm sắc thể vi phân tử (DNA nhân lục lạp) đề giả thiết phân loại bèo gồm chi tức có thêm chi Landoltia [38] Một số nghiên cứu gần Rothwell cộng sự, dựa so sánh trình tự đoạn intron tRNALeu UAA (trnL) tRNAPhe UAA (trnF) gen lục lạp xác định họ Lemnaceae Pisita thuộc họ ráy Araceae [48] Hình 1.2 biểu thị phân loại bèo [37] 1.1.4 Hình thức sinh sản bèo Bèo có hai phương thức sinh sản để trì nòi giống: Sinh sản hữu tính sinh sản vô tính Sinh sản vô tính chiếm ưu so với sinh sản hữu tính Hình thức sinh sản hữu tính bèo xảy chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòi giống [36], [37] 1.1.4.1 Sinh sản vô tính Bèo sinh sản vô tính hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh nằm xoang vùng gốc cánh Hình 1.3 thể trình sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza Hình 1.3 Sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vô tính bèo gần đạt mức tăng theo hàm số mũ Lượng cánh bèo tăng gấp đôi sau 24 nuôi cấy loài sinh trưởng nhanh L aequinoctialis, W microscopica Với hình thức sinh sản vô tính thời gian vòng đời cánh bèo vài tuần Theo nhiều tác giả cho biết, vòng đời cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, 30 oC vòng đời giảm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn nửa so với 20oC Trong giai đoạn ngủ, nghỉ nhiệt độ thấp, cánh bèo tồn vài tháng Điều kiện dinh dưỡng có ảnh hưởng đến vòng đời cánh bèo Sự thiếu hụt chất dinh dưỡng làm cánh bèo già hoá nhanh chết sau đến tuần Có thể nói, vòng đời dài tốc độ nhân lên cánh bèo nhỏ Khi nồng độ dinh dưỡng giảm ngưỡng tối thiểu cánh bèo bị tổn thương chết nhanh bình thường [36] 1.1.4.2 Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính thực thông qua hoa tạo hạt tương tự loài thực vật hạt kín khác Với kích thước cánh bèo, hoa hạt nhỏ bé, bèo coi loài thực vật hạt kín nhỏ bé giới thực vật Sinh sản hữu tính bèo bao gồm giai đoạn: (i) Ra hoa (ii) Tạo hạt * Giai đoạn hoa: Cơ quan hoa bèo L aequinoctialis gồm thành phần: bắc, nhị hoa, nhụy hoa Ở Spirodela Lemna, quan hoa phát sinh xoang phát sinh cánh Ở Wolffiella Wolffia, hoa phát sinh xoang bề mặt cánh bèo không cung xoang phát sinh cánh Hoa Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh Hoa Wolffiella nằm cạnh đường trung tâm cánh [36] * Giai đoạn tạo hạt: Sau khoảng thời gian từ đến tuần tính từ lúc thụ tinh chín Mỗi có bao khô thường có - hạt Ở hầu hết loài, gần đối xứng ngoại trừ L valdiviana L perpusilla Quả thường dài từ 0,35 mm đến 2,75 mm Hạt bèo có dạng hình trứng với vảy đen đỉnh Khi có nhiều hạt dạng hình trứng tam giác Kích thước hạt biến đổi loài loài từ 0,3 – mm chiều dài 0,2 – 0,8 mm đường kính Hạt có vỏ hạt vỏ hạt trong, nội nhũ phôi Vỏ gồm – 11 lớp tế bào biểu bì ngoài, đỉnh có nhiều lớp tế bào cuối hạt [36] 1.1.5 Hệ gen bèo Các nghiên cứu hệ gen bèo tiến hành từ đầu năm 80 kỷ trước ngày Các kết cho thấy, gen bèo giống với gen thực vật nói chung, bao gồm gen nhân gen nhân Bộ gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn bèo có kích thước nhỏ, (lượng DNA 01 nhiễm sắc thể: 1C=0,6 pg DNA) loài thực vật khác Triticum monococcum gen lớn nhiều (1C=6,23 pg) [54] Kích thước gen nhân loài bèo khác nhau, nhỏ Spirodela lớn Wolffia Số lượng nhiễm sắc thể loài khác khác từ 2n = 16 đến 2n = 126 Kích thước gen số loài bèo so với loài đối chứng liệt kê bảng 1.1 [36] Bảng 1.1 Kích thƣớc gen nhân số loài bèo Loài 2n pg DNA pg DNA / pg DNA / 1C chromsome Spirodela polyrrhiza 7110 80 1.19 / 8C 0.15 0.015 Spirodela punctata 7461 46 1.48 / 4C 0.37 0.032 Lemna minor 7115 126 5.82 / 12C 0.49 0.046 Wolffiella oblonga 79 (7166) Wolffia arrhiza 7347 42 42 3.02 / 4C 6.53 / 4C 0.76 1.63 0.072 0.155 Gen nhân bèo bao gồm gen lục lạp gen ty thể Gen lục lạp (cpDNA) bèo đối tượng quan tâm nghiên cứu nhiều Tháng năm 2008, gen lục lạp Lemna minor giải trình tự hoàn chỉnh Bộ gen lục lạp có cấu trúc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa protein, 30 tRNA gen rRNA gen [42] 1.1.6 Giá trị dinh dƣỡng Bèo có chứa chất dinh dưỡng với đa dạng thành phần hàm lượng Sinh khối bèo có chứa vitamin A, B1, B2… amino acid không thay trừ methionine Bèo nuôi điều kiện tối ưu số loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao Hầu hết loài bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy [37] Trong thời gian gần đây, có nghiên cứu sử dụng bèo hệ thống sinh tổng hợp chất thứ cấp, sản phẩm mang lợi ích cho người dân, protein với hàm lượng lớn hoạt tính sinh học cao…[38] Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần hàm lượng khoáng chất môi trường nuôi (đặc biệt nitơ) Thành phần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn hàm lượng chất dinh dưỡng thành phần hữu khác bèo liệt kê bảng 1.2 Bảng 1.2 Thành phần hàm lƣợng hợp chất hữu có cánh bèo Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô) Proteins 6,8 – 45 Lipid 1,8 – 9,2 Sợi thô 5,7 – 16,2 Đường 14,1 – 43,6 Tro 12,0 – 27,6 1.1.7 Tiềm sử dụng bèo công nghệ sinh học Một mục đích chủ yếu công nghệ sinh học, đặc biệt công nghệ DNA tái tổ hợp tạo sản phẩm chuyển gen có giá trị thương mại cao Để tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học quy mô sản xuất lớn, đòi hỏi cấp thiết cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả sinh trưởng phát triển nhanh, ổn định [13] Cho đến nay, nhà công nghệ sinh học phân tử sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus côn trùng, thực vật, sinh vật đa bào…Việc lựa chọn hệ thống sinh học phụ thuộc phần lớn vào sản lượng chất lượng thương phẩm Hệ thống sinh học từ vi khuẩn có khả tạo protein với hàm lượng cao hoạt tính protein thu có số hạn chế định Các tế bào động vật bậc cao có khả cải biến tốt protein sau dịch mã lại tiềm ẩn tác nhân gây bệnh có nguồn gốc virus chúng ký chủ cho nhiều loại virus gây bệnh cho người gia súc Do nhiệm vụ nhà sinh học phân tử tìm hệ thống sản xuất protein khác đảm bảo yêu cầu: rẻ tiền, dễ sử dụng không mang nguy lây nhiễm bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống thực vật So với hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi việc sản xuất protein tái tổ hợp Trước hết phải kể đến khả glycoside hóa protein, glycoprotein nhóm protein có vai trò quan trọng phản ứng miễn dịch Lợi thứ hai protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao Thứ ba lợi giá thành, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn thực vật trồng diện tích lớn với chi phí tối thiểu phân bón, công chăm sóc nguyên liệu đầu vào Trong loài thực vật nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, loài thuộc họ bèo đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn khả tăng sinh khối nhanh Bèo có tốc độ sinh sản nhanh, nhân đôi trọng lượng vòng 24 – 72 Một số giống bèo có tốc độ tăng sinh khối cao hẳn so với loài thực vật khác Đối với ngô, từ g chất khô ban đầu, sau tuần tạo lượng chất khô lớn 2,3 kg Trong số loài bèo lại tạo 64 g chất khô từ g chất khô ban đầu sau tuần [31], [50] Mặt khác hàm lượng chất dinh dưỡng bèo cao với đa dạng thành phần vitamin (A, B1, B2…), amino acid không thay Riêng protein bèo đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khô tuỳ theo loài [36], tức tỷ lệ tương đương với đậu tương Theo tính toán, cần - % tổng số protein nói có hoạt tính sinh học quan tâm đủ để bèo coi hệ thống tái sinh hiệu Do ưu điểm đó, năm gần đây, có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất hoạt chất sinh học từ bèo Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp sử dụng loài Lemna để chuyển gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất hoạt chất sinh học khác có vacine Quy trình chuyển gen vào bèo tương tự quy trình biến nạp gen số loài thực vật khác, tức phải tạo vật liệu vô trùng ống nghiệm, tạo callus, sau tái sinh callus chuyển gen thành hoàn chỉnh Ngoài ra, loài thuộc họ bèo có khả chuyển gen sử dụng nguyên mà không cần nuôi cấy mô vật liệu vô trùng Tháng 10 năm 2004, phủ Pháp tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo công nghệ sinh học [68] 1.2 Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật Gen đoạn phân tử DNA, RNA, mang thông tin di truyền xác định cấu trúc chuỗi polypeptide phân tử RNA định Một gen có cấu trúc điển hình gồm ba vùng chính: Vùng điều khiển, vùng mang mã di truyền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.Lrc-tnu.edu.vn vùng kết thúc Vùng điều khiển có số trình tự đặc hiệu điều khiển hoạt động gen Vùng mang mã chứa thông tin di truyền, phiên mã sang RNA thông tin (mRNA), gen cấu trúc dịch mã tạo sản phẩm protein Vùng kết thúc mang trình tự phân biệt gen, trình tự kết thúc trình phiên mã Cấu trúc gen bao gồm số cấu trúc đặc thù nằm phía trước, phía sau gen trình tự điều hòa, vùng tăng cường (enhanor), vùng bất hoạt (silencer), vùng đệm (spacer)… [39] Hình 1.4 sơ đồ cấu trúc gen điển hình Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 1.2.2 Cấu trúc promoter Gen cấu trúc biểu thành protein cần có mặt trình tự điều khiển thích hợp nằm vị trí định Trình tự tham gia tích cực vào trình điều khiển biểu gen trình tự khởi động (promoter) Promoter bao gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS), đóng vai trò điều khiển trình phiên mã nhờ khả đảm bảo vị trí nhận biết cho protein tham gia vào việc điều khiển biểu gen enzyme RNA polymerase, nhân tố phiên mã (transcription factor – TF) Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, thuật ngữ “promoter gần” hay “promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal promoter hay minimal promoter ) “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide phía TSS) (distal promoter) sử dụng Cả hai loại promoter gần xa chứa nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp nhân tố điều hòa phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, quan, giai đoạn phát triển môi trường [3], [53] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.Lrc-tnu.edu.vn