VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN XBX MÃ HÓA XYLANASE TRONG E COLI SỬ DỤNG VECTOR BIỂU HIỆN PET-22B(+) Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực : Chu Thị Khánh Ly Lớp : 11-02 Hà Nội- 2015 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn vô sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện công nghệ sinh học TS Đỗ Thị Huyền, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền tận tình hướng dẫn, bảo truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Trong trình làm việc, thầy, cô thường xuyên trao đổi, góp ý, đem đến cho em lời khuyên, nhận xét, khích lệ quý báu để giúp em hoàn thành công việc Với tình cảm chân thành, em xin cảm ơn hướng dẫn giúp đỡ toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt NCS Nguyễn Thị Thảo, NCS Phan Thị Thanh Huyền người hướng dẫn, hỗ trợ bảo nhiệt tình chuyên môn kỹ suốt trình em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ biết ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt bốn năm học tập trường Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, người thân gia đình, bạn bè thân thiết giúp đỡ, ủng hộ em suốt thời gian học tập làm việc vừa qua Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Chu Thị Khánh Ly SVTH: Chu Thị Khánh Ly i K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC  MỞ ĐẦU 1  PHẦN I: TỔNG QUAN 2  1.1 Xylan 2  1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan 3  1.3 Tổng quan enzyme xylanase 4  1.3.1 Khái niệm phân loại xylansae 4  1.3.1.1 Khái niệm 4  1.1.1.1 Phân loại xylanase 5  1.3.2 Cấu trúc xylanase 6  1.3.3 Cơ chế xúc tác xylanase 7  1.3.4 Nguồn xylanase 8  1.3.4.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn .8  1.3.4.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc 9  1.3.5 Ứng dụng xylanase 9  1.3.5.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 10  1.3.5.2 Trong sản xuất bánh .10  1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang 11  1.3.5.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu 11  1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt .11  1.3.5.6 Trong tẩy trắng giấy bột giấy 12  1.4 Tách dòng biểu gen 12  1.4.1 Vector biểu pET-22b(+) 12  1.4.2 Chủng biểu E coli BL21 13  1.4.3 Các nghiên cứu công bố biểu xylanase 14  PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15  2.1 Vật liệu 15  2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 15  2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy 15  SVTH: Chu Thị Khánh Ly ii K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 2.1.3 Hóa chất dung dịch sử dụng 15  2.1.2.1 Hóa chất 15  2.1.2.2 Enzyme 16  2.1.2.3 Dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 16  2.1.2.4 Các dung dịch dùng điện di DNA gel agarose 16  2.1.2.5 Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide- SDS 17  2.1.3 Máy móc thiết bị 17  2.2 Phương pháp nghiên cứu 17  2.2.1 Phương pháp PCR 17  2.2.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế báo E coli phương pháp sốc nhiệt 18  2.2.3 Tách chiết DNA lasmid từ tế bào E coli 19  2.2.4 Điện di DNA gel agarose 21  2.2.5 Xử lý DNA enzyme hạn chế 22  2.2.6 Biểu gen 23  2.2.7 Điện di protein gel polyacrylamid – SDS 23  2.2.8 Phá tế bào siêu âm tách pha protein tan không tan 24  PHẦN III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25  3.1 Thiết kế vector biểu pET22xbx 26  3.1.1 Nhân dòng gen xbx mã hóa enzyme xylanase kỹ thuật PCR 26  3.1.2 Cắt sản phẩm PCR vector pET22b(+) NcoI+XhoI 27  3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu pET-22b(+) 27  3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E coli DH10B 29  3.1.5 Kiểm tra gen xbx vector pET-22xbx enzyme hạn chế 30  3.2 Biểu gen xbx chủng E coli BL21 31  3.3 Lựa chọn điều kiện biểu 33  3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy chủng môi trường có chất cảm ứng 33  3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG 34  KẾT LUẬN 37  KIẾN NGHỊ 38  TÀI LIỆU THAM KHẢO 39  SVTH: Chu Thị Khánh Ly iii K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid deoxyribonucleic Bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra acid acetic EtBt Ethidium bromide Kb Kilobase OD Optical density PBS Phosphate buffered saline RNAse Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA dH2O Nước đề ion SDS-PAGE SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis Amp Ampicillin E coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside SVTH: Chu Thị Khánh Ly iv K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng Thành phần phản ứng cắt 22  Bảng Thành phần chất phản ứng nối ghép gen 22  Bảng Bảng giá trị OD600 thu mẫu 34  SVTH: Chu Thị Khánh Ly v K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc arabinoxylan cỏ Graminiae Hình Vị trí công enzym vào xylan cỏ [2] Hình Cấu trúc không gian chiều Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans Hình Cấu trúc không gian chiều xylanase họ 11 Hình Sơ đồ vector pET-22b(+) 13 Hình Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu mang gen xbx 25 Hình Phân tích sản phẩm nhân gen xbx kỹ thuật PCR gel agarose 0,8% 26 Hình Kết tinh sản phẩm PCR vector pET-22b(+) 27 Hình Đĩa biến nạp pET22-xbx vào tế bào E coli DH10B 28 Hình 10 Phân tích sản phẩm tách DNA plasmid pET22-xbx 29 Hình 11 Kết điện di sản phẩm cắt kiểm tra gen xbx plasmid pET-22b(+) enzyme hạn chế 30 Hình 12 Kết biểu protein XBX từ dòng E coli BL21 tái tổ hợp 31 Hình 13 Kết kiểm tra khả tan protein XBX 32 Hình 14 Phân tích sản phẩm biểu protein E coli BL21 mang gen xbx nhiệt độ khác 33 Hình 15 Phân tích protein tổng số biểu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 35 Hình 16 Phân tích protein pha tan biểu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 35  SVTH: Chu Thị Khánh Ly vi K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Hiện trái đất, năm thực vật sản sinh lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ Tất hoạt động người loài động vật cần đến thực vật Chúng nguồn lương thực để nuôi sống người động vật đồng thời nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho ngành công nghiệp Ngày nay, phế phụ phẩm ngành nông, lâm nghiệp tận dụng để chuyển hóa nhiều chất có giá trị, điển hình nhiên liệu sinh học để thay nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày cạn kiệt Thành tế bào thực vật có cấu tạo vững cellulose, hemicellulose lignin để phá hủy phần toàn chúng người ta thường sử dụng hóa chất mạnh axit mạnh hay kiềm mạnh để loại bỏ lignin, giải phóng cellulose, hemicellulose Bước tiếp theo, nguồn cellulose, hemicelluloses cần chuyển hóa thành đường phức hệ enzyme cellulase Đường tạo thành dùng để lên men tạo sản phẩm cồn sinh học chất khác Do enzyme cellulase, hemicellulase chưa đáp ứng yêu cầu công nghiệp hoạt tính tốc độ thủy phân, nhiều nghiên cứu giới tìm enzyme có hoạt tính sinh học tốt để làm giảm giá thành sản phẩm cuối Một loại enzym nhiều nhà khoa học quan tâm xylanase Enzym có khả thủy phân hiệu xylan – thành phần chủ yếu hemicellulose thành tế bào thực vật Xylanase có nhiều ứng dụng công nghệ chế biến giấy bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol sinh học) từ phế thải nông nghiệp Xuất phát từ vấn đề tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu biểu gen xbxs mã hóa xylanase E coli sử dụng vector biểu pET-22b(+)” Đề tài thực Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam SVTH: Chu Thị Khánh Ly K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Xylan Xylan, thành phần hemicellulose tìm thấy thành tế bào thực vật, polysaccharide thứ hai sau cellulose [1] Trong thực tế, thành tế bào thực vật vật liệu phức tạp cellulose (3550%), hemicellulose (20-30%) - nhóm cacbonhydrat dạng xylan loại chủ yếu - lignin (20-30%) liên kết chặt chẽ với Xylan polysaccharide hỗn tạp có chứa nhóm phụ gốc acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl α-arabinofuranosyl liên kết với khung tạo gốc xylopyranose Bộ khung liên kết với theo kiểu β-1,4-glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan liên kết este gốc axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2], [3] Hình Cấu trúc arabinoxylan cỏ Graminiae Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu thành tế bào thực vật sống lâu năm, từ 15-30% gỗ cứng 7-10% gỗ mềm Với gỗ mềm, nhóm phụ xylan chủ yếu axit 4-O-methyl glucuronic arabinose Chúng liên kết với khung xylan liên kết α-1,3glycozit Hiếm thấy nhóm acetyl xylan gỗ mềm Tỷ lệ arabinose so với xylose thường 0,6 [4] SVTH: Chu Thị Khánh Ly K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hemicellulose gỗ cứng có nhóm phụ axit 4- O-methyl glucuronic, axit acetic axit uronic Bộ khung xylan gỗ cứng gồm gốc β-1,4-Dxylopyranose, trung bình 10 – 20 gốc xylose có axit 4- O-methyl glucuronic liên kết với theo kiểu α-1,2-glycozit Xấp xỉ 60-70% đơn vị xylose este hóa với axit acetic nhóm hydroxyl carbon thứ thứ trung bình mười đơn vị xylose có nhóm axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycozit [2], [4], [5] 1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan Phân huỷ sinh học xylan kết hợp hoạt động nhiều loại enzym endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực nhiệm vụ phân cắt mạch xylan việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo oligosaccharide Sau exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân oligosaccharide thành monomer Các nhóm bên có mặt xylan giải phóng α-L-arabinofuranosidase, α-Dglucuronidase, galactosidase acetyl xylan esterase Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylooligosaccharide cách loại bỏ xylose từ đầu không khử Có nhiều công bố Bacillus sp [6] số nấm [7] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào Enzym α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối không khử α-L-arabinofuranosyl arabinan, arabinoxylan arabinogalactan Một lượng lớn vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn loài vi khuẩn công bố có khả sinh tổng hợp α-arabinosidase Rhodothermus marinus loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn với hoạt độ 6,6 U/ml [8] Enzym α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic xylose D-glucuronic axit liên kết ete với 4-O-methyl Sự thủy phân liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng thủy phân xylan Tương tự liên kết cacbonhydrat lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose hàng rào phá hủy gỗ Có nhiều vi sinh vật có khả sinh tổng hợp α-glucuronidase [9] SVTH: Chu Thị Khánh Ly K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1 Thiết kế vector biểu pET22xbx 3.1.1 Nhân dòng gen xbx mã hóa enzyme xylanase kỹ thuật PCR PCR phản ứng tiến hành nhiệt độ cao nên việc sử dụng enzyme để tổng hợp chuỗi vấn đề cần quan tâm lưu ý Ở sử dụng enzyme Taq polymerase vốn loại DNA polymerase chịu nhiệt, có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus Nhờ đó, trình tổng hợp DNA trở nên dễ dàng PCR kỹ thuật dựa sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp Đoạn gen xbx mã hóa cho enzyme E coli theo lý thuyết có chiều dài khoảng 1410 bp Do đó, sử dụng kỹ thuật để nhân đoạn gen xbx lên gấp nhiều lần nhằm dễ dàng tiến hành cho thí nghiệm Các bước tiến hành PCR mô tả phần phương pháp Sau kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm xbx kiểm tra điên di gel agarose 0,8% Kết thể hình Hình Phân tích sản phẩm nhân gen xbx kỹ thuật PCR gel agarose 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR gen xbx Đường chạy 2: DNA chuẩn 1kb ( Fermentas) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 26 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Trên điện di đồ cho thấy: sản phẩm PCR có băng sáng, sắc nét, có kích thước khoảng 1,5 kb tương đương với kích thước theo tính toàn lý thuyết đoạn gen xbx cần khuếch đại 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR vector pET-22b(+) NcoI+XhoI Sau kiểm tra vector tái tổ hợp pBlue-xbx theo tính toán lý thuyết, tiến hành tủa sản phẩm PCR ethanol để loại bỏ đệm PCR sau cắt sản phẩm PCR cặp enzyme hạn chế XhoI + NcoI Đồng thời cắt vector pET-22b(+) cặp enzyme để tạo đầu dính bổ sung Sản phẩm cắt tinh Kit Qiagen trình bày phần vật liệu phương pháp điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Hình Kết tinh sản phẩm PCR vector pET-22b(+) sau cắt cặp enzyme hạn chế NcoI+XhoI Hình cho thấy gen xbx vector pET-22b(+) tinh thành công sẵn sàng cho thí nghiệm 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu pET-22b(+) Vector pET-22b(+) lựa chọn để biểu gen Như trình bày đoạn gen xbx vector pET-22b(+) có đầu dính bổ sung Khi nằm hỗn hợp phản ứng lai ghép đầu dính bổ sung bắt cặp với nối lại với xúc tác enzyme T4 DNA ligase Đây enzyme có nguồn gốc từ tế bào E coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4, sử dụng phổ biến phản ứng nối ghép gen có khả hình thành liên kết phospho diester nucleotide SVTH: Chu Thị Khánh Ly 27 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học đứng cạnh Nó không hiệu việc ghép nối đoạn DNA đầu dính mà nối DNA đầu Tỷ lệ phản ứng nối ghép gen 3:1 gen vector pET-22b(+) số mol Để thuận tiện, đặt tên cho plasmid tái tổ hợp thu pET22-xbx Sản phẩm phản ứng nối ghép sau biến nạp vào tế bào E coli DH10B để tiến hành chọn dòng Hình Đĩa biến nạp pET22-xbx vào tế bào E coli DH10B Ampicillin chất kháng sinh chứa vòng β – lactam có khả liên kết với enzyme transpeptidaza Enzyme tham gia xúc tác cho hình thành liên kết ngang peptidoglycan vi khuẩn, làm cho thành tế bào vi khuẩn yếu trình phân bào, chí làm tế bào bị thủy phân vi khuẩn bị chết Do đó, môi trường chọn lọc có chứa ampicillin, tế bào vi khuẩn E coli mang dòng plasmid chứa gen kháng kháng sinh sống sót sinh trưởng môi trường đĩa thạch LBA Như vậy, khuẩn lạc quan sát thấy đĩa thạch dòng tế bào mang plasmid Tuy nhiên, tế bào E coli DH10B chứa plasmid mang gen ( pET22-xbx) chứa vector pET-22b(+) không mang gen ngoại lai mang gen kháng kháng sinh nên có khả sinh trưởng đĩa thạch Để loại trừ dòng plasmid không mong muốn lựa chọn dòng tái tổ SVTH: Chu Thị Khánh Ly 28 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học hợp, tiến hành tách DNA plasmid từ thể biến nạp, sau cắt kiểm tra kích thước gen ngoại lai cặp enzyme hạn chế XhoI NcoI 3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E coli DH10B Việc tách chiết DNA plasmid bước nhận biết có mặt gen xbx vector pET-22b(+) Trong thí nghiệm này, lựa chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc từ đĩa biến nạp nuôi lắc qua đêm 37oC môi trường LBAmp lỏng Sau đó, tiến hành tách DNA plasmid dòng E coli DH10B theo quy trình mô tả phần phương pháp vật liệu Kết điện di DNA plasmid từ dòng biến nạp thể hiên hình 10 Hình 10 Phân tích sản phẩm tách DNA plasmid pET22-xbx Đường chạy 1-5: Các dòng biến nạp pET22-xbx Đường chạy 6: Vector pET-22b(+) Theo lý thuyết, plasmid pET-22b(+) mang gen xbx có kích thước lớn so với vector pET-22b(+) gen ngoại lai chèn vào Quan sát điện di đồ (hình 10) thấy mẫu tách chiết có kích thước tương đối đồng Khi so sánh với mẫu đối chứng vector pET-22b(+) không mang gen, dòng DNA plasmid xuất băng DNA có kích thước cao hơn, chứng tỏ khả lớn chúng có mang gen Tuy nhiên, để kết luận xác plasmid có chứa gen xbx hay không, tiến hành cắt plasmid pET22-xbx hai enzyme hạn chế XhoI NcoI đồng thời giải trình tự SVTH: Chu Thị Khánh Ly 29 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1.5 Kiểm tra gen xbx vector pET-22xbx enzyme hạn chế Plasmid tái tổ hợp pET22-xbx cắt kiểm tra cặp enzyme cắt hạn chế XhoI NcoI Trình tự nhận biết hai enzyme đưa vào hai mồi dùng để khuếch đại gen nên gen hạn chế cặp enzyme NcoI, XhoI hai đầu 5’, 3’ tương ứng Vì vậy, cắt cặp enzyme hạn chế này, plasmid pET22-xbx cắt thành đoạn DNA Một đoạn có kích thước 1,4 kb tương ứng với kích thước gen xbx, đoạn lại vector Sản phẩm từ phản ứng cắt điện di gel agarose 0,8%, kết băng DNA thể hình 11 Quan sát kết điện di đồ ( hình 11) thấy, sản phẩm cắt plasmid pET22-xbx dòng số 1, 2, 3, 4, xuất băng: băng thứ có kích thước khoảng 1,4 kb tương đương với kích thước gen xbx; băng thứ hai có kích thước khoảng 5,5 kb tương ứng với kích thước vector pET-22b(+) cắt cặp enzyme XhoI NcoI Như vậy, đưa gen xbx vào vector pET22b(+) để tạo thành vector pET22-xbx Hình 11 Kết điện di sản phẩm cắt kiểm tra gen xbx plasmid pET22b(+) enzyme hạn chế M: DNA kb chuẩn Đường chạy số 1-5: DNA plasmid xử lý với XhoI NcoI SVTH: Chu Thị Khánh Ly 30 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.2 Biểu gen xbx chủng E coli BL21 Trong vector biểu pET 22b(+), hoạt động gen xbx điều khiển operon lac với chế kiểm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG Sau biến nạp lựa chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc E coli BL21 mang gen xbx nuôi cấy qua đêm 37oC môi trường LBA lỏng Sau đó, tế bào chuyển sang bình nuôi cấy khác chứa môi trường LBA cho OD600 ban đầu 0,1 nuôi lắc điều kiện 37oC để OD600 đạt từ 0,6 – 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM cảm ứng điều kiện lắc 30oC, tốc độ 200 vòng/phút để tổng hợp protein XBX Dòng đối chứng chứa vector pET-22b(+) không mang gen (đối chứng âm) nuôi cấy điều kiện Sau ly tâm thu sinh khối tế bào, đưa mẫu giá trị OD600 = 10 Tiếp theo mẫu protein biến tính đệm biến tính điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,6% Kết điện di quan sát sau nhuộm với thuốc nhuộm coomassie (Hình 12) Hình 12 Kết biểu protein XBX từ dòng E coli BL21 tái tổ hợp Đối chứng (-) : Protein chủng E coli mang pET-22b(+) Đường chạy M : Protein chuẩn (Fermentas) Đường chạy số 1-4 : Protein chủng E coli mang pET22-xbx Kết điện di trình bày hình 12 cho thấy, đường chạy mang protein chủng E coli mẫu từ dòng biến nạp mang gen xbx xuất băng protein có SVTH: Chu Thị Khánh Ly 31 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học kích thước khoảng 51,7 kDa tương ứng với kích thước protein XBXS tính toán lý thuyết, đường chạy đối chứng (-) chủng không mang gen không xuất băng protein Như vậy, từ kết nhuộm coomassie cho thấy protein XBX biểu chủng E coli BL21 tái tổ hợp Các enzyme tái tổ hợp thường có hoạt tính tốt biểu pha tan tế bào Để kiểm tra khả tan protein tái tổ hợp tiến hành siêu âm phá tế bào Kết điện di kiểm tra hình 12 Hình 13 Kết kiểm tra protein XBX pha tan M: protein chuẩn (Fermentas) TS: protein tổng số KT: protein không tan T: protein tan (-): đối chứng âm Kết hình 13 cho thấy protein XBX biểu chủng E coli BL21 chủ yếu dạng không tan, dạng không mong muốn Do đó, tiến hành lựa chọn điều kiện để biểu protein dạng tan Vì dạng tan khả protein cuộn xoắn cấu trúc cao hơn, vùng định hoạt tính bộc lộ SVTH: Chu Thị Khánh Ly 32 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.3 Lựa chọn điều kiện biểu 3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy chủng môi trường có chất cảm ứng Thông thường nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng E coli 37oC Tuy nhiên, chủng E coli tái tổ hợp điều kiện quan tâm trước tiên khả tổng hợp protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu này, tiến hành cảm ứng tế bào IPTG nồng độ cuối 0,5 mM cho thay đổi nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC, 37oC Sau nuôi cấy sinh khối tế bào thu cách ly tâm Chúng đưa mẫu giá trị OD600 = 10 Tiếp theo mẫu protein biến tính đệm biến tính điện di kiểm tra gel SDSPAGE 12,6% Kết điện di quan sát sau nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie (Hình 13) Hình 14 Phân tích sản phẩm biểu protein E coli BL21 mang gen xbx nhiệt độ khác M: protein chuẩn TS: protein tổng số T: protein tan KT: protein không tan Hình 14 cho thấy nhiệt độ 20oC 25oC protein XBX tổng hợp tổng hợp kém, với nhiệt độ 37oC băng protein quan tâm xuất so với protein nhiệt độ 30oC Chúng nhận thấy nhiệt độ 30oC băng protein thu tốt Do đó, lựa chọn nhiệt độ để biểu SVTH: Chu Thị Khánh Ly 33 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 30oC Tuy nhiên, tất nhiệt độ khảo sát, XBX tổng hợp chủ yếu pha không tan Vì vậy, tiến hành khảo sát nồng độ IPTG với mong muốn nồng độ IPTG thấp, tốc độ cảm ứng biểu protein tái tổ hợp thấp nên khả enzyme đóng gói tốt pha protein tan 3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG Nồng độ chất cảm ứng điều kiện quan trọng định khả biểu protein ngoại lai Bên cạnh chất đắt tiền Do đó, việc xác định nồng độ IPTG tối ưu cho trình biểu protein ngoại lai công việc cần thiết có ý nghĩa thiết thực trình sản xuất sau Trong thí nghiệm này, tiến hành cảm ứng biểu dải nồng độ IPTG khác nhau: mM, 0,02 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,8 mM, mM, 1,5 mM, mM Chủng E coli BL21 tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LBA 20oC lắc 200 vòng/phút Sau nuôi cấy tiến hành đo OD600 thu mẫu kết bảng Bảng Bảng giá trị OD600 thu mẫu Tế bào thu lại cách ly tâm với tốc độ 600 vòng/ phút 10 phút Sau đó, đưa OD600 = 10 xử lý sóng siêu âm Kết điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6% ( hình 15) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 34 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Kết bảng cho thấy cảm ứng nồng độ IPTG từ đến 0,8 mM, sinh khối tế bào thay đổi không đáng kể Chứng tỏ biểu XBX không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tế bào Hình 15 Phân tích protein tổng số biểu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 0-2 mM: nồng độ IPTG cảm ứng M: Protein chuẩn (Fermentas) Hình 16 Phân tích protein pha tan biểu E coli BL21 mang gen xbx nồng độ IPTG khác 0-2 mM: nồng độ IPTG cảm ứng M: Protein chuẩn (Fermentas) SVTH: Chu Thị Khánh Ly 35 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Quan sát ảnh điện di, thấy cảm ứng IPTG nồng độ 0,02 mM, nồng độ IPTG thấp nên không thấy băng protein XBX, chứng tỏ nồng độ chất cảm ứng không đủ để cảm ứng promoter sinh tổng hợp protein tái tổ hợp Từ nồng độ 0,05 mM trở lên thấy xuất XBX kích thước 51,7 kDa Hàm lượng protein biểu tương đương cảm ứng nồng độ 0,2 mM đến mM IPTG Kết kiểm tra pha tan cho thấy băng protein quan tâm xuất cảm ứng nồng độ 0,05 mM trở lên Tuy nhiên hàm lượng protein thấp Chúng chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,3 mM băng protein tái tổ hợp thu pha tan nhiều SVTH: Chu Thị Khánh Ly 36 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KẾT LUẬN Với mục tiêu đặt trình thực đề tài “Nghiên cứu biểu gen xbxs mã hóa xylanase E coli sử dụng vector biểu pET-22b(+)”, hoàn thành công việc sau: - Thiết kế thành công vector biểu pET22b-xbx mang gen xbx mã hóa cho enzyme xylanase E coli - Biểu thành công protein XBX chủng biểu E coli BL21 - XBX biểu pha tan tốt chủng nuôi cấy môi trường LBA có chứa 0,3 mM IPTG với nhiệt độ nuôi cấy 20oC SVTH: Chu Thị Khánh Ly 37 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KIẾN NGHỊ Để tiếp tục hướng nghiên cứu này, có số kiến nghị sau: - Cần kiểm tra hoạt tính sơ enzyme tái tổ hợp - Tinh chế XBX để xác định tính chất xylanase SVTH: Chu Thị Khánh Ly 38 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Biely, P., Microbial xylanolytic systems, Trends in Biotechnol 3, 286- 289, 1985 Puls, J., Chemistry and biochemistry of hemicelluloses: Relationship between hemicellulose structure and enzyms required for hydrolysis, Macromol Symp 120, 183-196, 1997 Bissoon, S., Christov, L and Singh, S., Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochem 37, 567-572, 2002 Dervilly, G., Thibault, J F and Saulnier, L., Experimental evidence for a semi-flexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res 330, 365-372, 2001 Teleman, A., Tenkanen, M., Jacobs A and Dahlman, O., Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono) xylan isolated from birch and beech, Carbohydrate Research 337, 373-377, 2002 La-Grange, D C., Claeyssens, M., Pretorius, I S., van-Zyl, W H., Coexpression of the Bacillus pumilus beta-xylosidase (xynB) gene with the Trichoderma reesei beta-xylanase-2 (xyn2) gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Appl Microbiol Biotechnol 54, 195-200, 2000 Poutanen, K Characterisation of xylanolytic enzyms for potential applications Ph.D Thesis, Technical Research Centre of Finland, Publications, 47, Espoo, 1988 Gomes, J., Gomes, I., Terler, K., Gubala, N., Ditzelmuller, G and Steiner, W., Optimisation of culture medium and conditions for α – L - arabinofuranosidase production by the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus, Enzym Microb Technol 27, 414-422, 2000 Hazlewood, G P and Gilbert, H J., Molecular biology of hemicellulases, in Hemicelluloses and Hemicellulases, Coughlan, M P and Hazlewood, G P Eds., Portland Press, London, 103-126, 1993 10 Wong, K.K.Y., Tan, L U L and Saddler, J N., Multiplicity of β1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications, Microbiol Rev 52, 305-317, 1988 11 Sapag, A., Wouters, J., Lambert, C., Ioannes, P., Eyzaguirre, J and Depiereux, E., The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships, J Biotechnol 109-131, 2002 12 Kuno, A., Kaneko, S., Ohtsuki, H., Ito, S., Fujimoto Z., Mizuno, H., Hasegawa T., Taira K., Kusakabe, I And Hayashi, K., Novel sugar-binding specificity of the type XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86, FEBS Letts 482, 231-236, 2000 13 Biely, P., Markovik, O., and Mislovicova, D., Sensitive detection of endo-1,4-βglucanases and endo-1,4-β-xylanases in gels, Anal Biochem 144, 147-151, 1985 SVTH: Chu Thị Khánh Ly 39 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 14 Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M and Kluepfel, D Endo-β-xylanases families: differences in catalytic properties, J Biotechnol 57, 151-166, 1997 15 Jeffries T W Biochemistry and genetics of microbial xylanases Curr Opin Biotechnol 7, 337-342, 1996 16 Torronen, A., Harkki, A., Rouvinen, J., Three dimensional structure of endo1,4-β-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in active state, EMBO J B 3, 2493-2501, 1994 17 Wakarchuk, W W Campbell, R.L Sung, W.L., Davoodi, J and Yaguchi, M., Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase, Prot Sci 3, 467-475, 1994 18 Leggio, L L Jenkins, J., HarrisG.W and Pickersgill, R W., X-ray cystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A, Proteins: Struct Function and Genetics, 41, 362-374, 2000 19 Meagher, MM, Tao, B.Y., Chow, J M., and Reilly, P.J., Kinetcs and subsite mapping of β-D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus endoxylanase, Carbohydr Res 173, 273-283, 1988 20 Bray, M R and Clarke, A J., Identification of an essential tyrosyl residue in the binding site of Schizophyllum commune xylanase-A, Biochemistry, 34, 20062014, 1995 21 Kulkarni N., Shendye A and Rao, M., Molecular and biotechnological aspects of xylanases, FEMS Microbiol Rev 23, 411-456, 1999 22 Cleemput, G., Hessing, M., van Oort, M., Deconynck, M and Delcour, J A., Purification and characterization of β-D-xylosidase and an endo-xylanase from wheat flour, Plant-Physiol 113, 377-386, 1997 23 Lebeda, A., Luhová, L., Sedlá, M and Jan, D., The role of enzyms in plantfungal pathogens interactions, Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 108,89-95,2001 24 C Feoli, J D Hancock, C R Monge, C L Jones, and C W Starkey, Effects of xylanase and wheat middings in diets for finishing pigs, 124-127, Swine Day 2006 25 Dawn Elizabeth Stephens, Protein engineering or a fungal xylanase, Department of Biotechnology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of Technology, Durban, South Africa February 2007 26 Tamba-Berehoiu Radiana, Jurcoane Stefana, Popa N.C, Bagiu Liliana, Rosu Ana, Testing of the efficiency of some enzymatic mixture, concerning the conversion of several lignocellulosic biomass’ sourses, to reducing sugars, Lucrări ştiinŃifice Zootehnie şi Biotehnologii, vol 41(1), Timişoara, 155-161, 2008 27 J Ragauskas, Kathleen M Poll, Effect of Xylanase Pretreatment Procedures for Nonchlorine Bleaching, Institute of Paper Science and Technology, Atlanta, GA 30318, 1993 SVTH: Chu Thị Khánh Ly 40 K18.CNSH.11-02 [...]... men cũng được sử dụng khá nhiều để biểu hiện gen 1.4.1 Vector biểu hiện pET- 22b(+) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET- 22b(+) làm vector biểu hiện Vector pET- 22b(+) có chiều dài 5493 bp (hình 5) là vector được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E coli Về cấu tạo, vector này bao gồm: - Trình tự khởi đầu sao chép (ori) là vị trí gắn của DNA polymeraza, quyết... dòng Gen xbx trong pET2 2b(+) được kiểm tra bằng enzyme hạn chế Các vector tái tổ hợp mang đúng gen được đặt tên là pET2 2xbx và được biến nạp vào E coli BL21 để biểu hiện gen Hình 6 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang gen xbx SVTH: Chu Thị Khánh Ly 25 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET2 2xbx 3.1.1 Nhân dòng gen xbx mã hóa enzyme xylanase. .. gen Chủng E coli BL21 (DE3) được sử dụng làm chủng biểu hiện gen Plasmid pBlue-script SK (+) mang gen xbx (được đặt tên là pBlue-xbxs) do phòng Kỹ thuật di truyền – viện Công nghệ sinh học thiết kế được sử dụng làm nguồn gen Plasmid pET- 22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện gen Cặp mồi sử dụng trong phản úng PCR: Mồi xuôi (forward primer): TCCATGGATAACCCTTACTTACCTGCTTATG Mồi ngược (reverse primer):... Kit Qiagen như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% Hình 8 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET- 22b(+) sau khi cắt bằng cặp enzyme hạn chế NcoI+XhoI Hình 8 cho thấy rằng gen xbx và vector pET- 22b(+) đã được tinh sạch thành công và sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET- 22b(+) Vector pET- 22b(+). .. β-1,4-D-xylosidic trong xylan - Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1, 4xylanase; xylanase; β-1,4 -xylanase; endo-1,4 -xylanase; endo-β-1, 4xylanase; endo-1,4-β-D -xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β -xylanase; β-Dxylanase - Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase 1.1.1.1 Phân loại xylanase Wong và các cộng sự [10] phân loại xylanase thành... plasmid pET2 2 -xbx Đường chạy 1-5: Các dòng biến nạp pET2 2 -xbx Đường chạy 6: Vector pET- 22b(+) Theo lý thuyết, các plasmid pET- 22b(+) mang gen xbx sẽ có kích thước lớn hơn so với vector pET- 22b(+) không có gen ngoại lai chèn vào Quan sát trên điện di đồ (hình 10) chúng tôi thấy các mẫu tách chiết có kích thước tương đối đồng đều Khi so sánh với mẫu đối chứng là vector pET- 22b(+) không mang gen, các... tra protein trên gel polyacrylamide, nhuộm bản gel bằng coomassie brilliant blue trong 1 giờ và rửa lại bằng dung dịch tẩy rửa cho đến khi quan sát được các băng protein SVTH: Chu Thị Khánh Ly 24 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN Các bước thực hiện đề tài nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa enzyme xylanase trong E coli được... công bố về biểu hiện xylanase Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong các vật chủ vi khuẩn và nấm men khác nhau Một số ví dụ, xylanase được tách dòng vào trong E coli bao gồm A oryzae (Kimura cs., 2002), A pullulans var melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee, 2001), Clostridium thermocellum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum saccharolyticum... điện di trên gel agarose 0,8%  Phản ứng nối ghép gen: Bảng 4 Thành phần các chất trong phản ứng nối ghép gen Thành phần Thể tích (µl) H 2O 3 Buffer T4 DNA ligase 10X 1 Gen 3,5 Vector pET2 2b(+) 1,5 T4 DNA ligase 1 Tổng 10 SVTH: Chu Thị Khánh Ly 22 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 2.2.6 Biểu hiện gen  Cơ sở lý thuyết: Chủng E coli mang gen tái tổ hợp được nhân lên trong môi trường... tả tóm tắt trong hình 6 Gen xbx có kích thước 1410 bp được khuếch đại từ vector tách dòng pBluexbxs và được cắt đồng thời bằng cặp enzyme hạn chế NcoI+XhoI Đồng thời, vector pET2 2b(+) cũng được cắt bằng các enzyme hạn chế trên để tạo đầu dính tương thích Sản phẩm cắt gen và vector được tinh chế qua cột Qiagen và được nối lại với nhau bằng T4-DNA ligase sau đó được biến nạp vào tế bào E coli DH10B để