VI VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC - KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO O DÒNG D VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS NHƯỢC ĐỘC PHỤC ỤC VỤ V CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH ỆNH HO HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ BIỂN Giáo viên hướng h dẫn : ThS Nguyễn n Thị Thu Hiền Hi Sinh viên thực th : Đàm Thận Quảng Lớ ớp: 11-02 Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Thu Hiền Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành đề tài Em quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Đàm Thận Quảng MụC LụC MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi đề tài CHƯƠNG ITỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn Vibrio sp 1.1.1 Tình hình giới 1.1.2 Tình hình nước 1.2 Giới thiệu Vibrio parahaemolyticus 1.2.1 Đặc điểm Vibrio parahaemolyticus 1.2.2 Độc tố Vibrioparahaemolyticus 1.3 Tổng quan bệnh hoại tử gan thận cá biển Vibrio parahaemolyticus gây 11 1.3.1 Cơ chế gây bệnh 13 1.3.2 Triệu chứng gây bệnh 13 1.4 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 14 1.4.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn 16 1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 18 1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương 25 1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 25 1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 25 CHƯƠNG IIVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trường dung dich nuôi cấy 27 2.1.4 Thiết bị 28 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp vi sinh 30 2.3.2 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 30 2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử 32 2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 36 CHƯƠNG IIIKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân 37 3.1.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tia UV 37 3.1.2 Kết tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus kháng sinh rifampicin 38 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng đôt biến 39 3.2.1 Kết thử khả dung huyết 40 3.2.2 Kết gây nhiễm cá 41 3.2.3 Kết chạy PCR xác định gen độc tố 43 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC VIẾT TẮT Brain Heart Infusion Broth BHI Broth Base pair bp Brain Heart Infusion BHI Deoxyribonucleotide Acid DNA Deoxynucleotidetriphosphate dNTP Food and Drug Adimistration FDA Polymerase Chain Reaction PCR Rifampicin Rif Thiosulfate Citrae Bile Salt Sucrose TCBS DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine 20 Hình 1.3 Tác động tia UV làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 21 Hình 1.4.Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 23 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP 23 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB 24 Hình 2.1 Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV 31 Hình 3.1 Khuẩn lạc sống sót sau chiếu UV 38 Hình 3.2 Khuẩn lạc chịu môi trường TCBS có bổ sung kháng sinh 39 Hình 3.3 Khả dung huyết chủng LBT6 Dòng 41 Hình 3.4 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến 43 Hình 3.6: Sản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh 45 Hình 3.7 Cá thí nghiệm sau gây nhiễm 15 ngày 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 35 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý UV 37 Bảng 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lýkháng sinh rifamycin 39 Bảng 3.3 Kết khả dung huyết 40 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá 15 ngày tiêm 42 Bảng 3.5 Kết kiểm tra có mặt gen độc tố 44 Bảng 3.6 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ 46 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây Biển Đông, có bờ biển dài 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam tạo điều kiện thuận lợi cho hình thành phát triển kinh tế, đặc biệt nghề nuôi trồng thủy hải sản Nuôi trồng thủy sản ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh giới, mang lại tiềm to lớn để đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế biển Theo thống kê Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn), tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng tháng đầu năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn, sản lượng khai thác 244 nghìn tấn, sản lượng nuôi trồng 299 nghìn tấn, đưa tổng sản lượng thủy sản tháng đầu năm xấp xỉ 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, sản lượng khai thác 1,9 triệu (tăng 4,9%), sản lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%) Tổng cục Thủy sản cho biết, giai đoạn 2011-2015 ngành thủy sản hướng tới phát triển bền vững ngành xuất hàng hóa lớn, có khả cạnh tranh cao hội nhập vững giới Hiện nay, đối tượng nuôi mô hình nuôi thủy sản Việt Nam phong phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng ngày khẳng định vị trí Đây mô hình áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao Cá nuôi lồng phải chịu nhiều yếu tố gây stress phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sản kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Đáng lưu ý bệnh hoại tử gan thận cá biển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến người nuôi cá biển Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt cá nuôi lồng, xuất cá nước Khi vi khuẩn V.parahaemolyticus xâm nhập vào thể cá biển, gây hoại tử lên nội quan cá (đặc biệt gan, thận), lở loét lớp biểu bì Gan thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt Bệnh thường xảy giai đoạn cá, tìm phương pháp phòng trị bệnh hạn chế tổn thất dịch bệnh gây cần thiết SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Thực tế nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tượng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Vi khuẩn có khả tạo màng bảo vệ trước thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe người Hiện phương pháp phòng bệnh hiệu sủ dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tương đối cần thiết Một bước quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo chủng vi khuẩn nhược độc, làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận cá biển Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắcxin phòng bệnh hoại tử thận số loại cá biển.” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoạt tử gan thận cá biển 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung Tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc có khả tạo khánh thể bảo hộ cá 1.2.2 Mục tiêu cụ thể • Tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng tia UV • Tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine • Đánh giá đặc tính chủng đột biến: Đánh giá lạikhả dung huyết Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm cá Kiểm tra xác định gen độc tố Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học đáng kể vẫnn khuẩn khu lạc mọc khả chống ng ch chịu tia UV Đến đờii không khuẩn khu lạc mọc Khuẩn lạc sống ng sót sau chiếu chi tia UV Khuẩn lạc sống ng sót sau chi chiếu tia UV 21 phút phút Hình 3.1 Khuẩn K lạc sống sót sau chiếu UV 3.1.2 Kết tạoo dòng vi khuẩn khu Vibrio parahaemolyticus ng kháng sinh rifampicin Chủng tự nhiên LBT6, tiến ti hành tăng ng sinh môi tr trường BHI+0,5µg/ml kháng sinh rifampicin ngày, cấyy lên môi tr trường TCBS+0,5µg/ml xác định nh khuẩn khu lạc mọc được, lấy ngẫuu nhiên khu khuẩn lạc tăng ng sinh môi trường tr kháng sinh lần Sau liên tụcc gây áp llực lần với vi khuẩnn môi trường trư BHI bổ sung rifampicin có nồng độộ 0,7µg/ml 0,8µg/ml 0,9µg/ml 1µg/ml 1,1µg/ml 1,2µg/ml 1,2 1,3µg/ml, thu kết Bảng ng 3.2, Hình 3.2 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 38 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học Bảng 3.2 Số khuẩn khu lạc sống sót sau xử lýkháng sinh rifam rifampicin Nồng 0,5 0,7 0,8 0,9 1,1 1,2 1,3 µg/ml µg/m ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml độ kháng sinh CFU/đĩa 250 120 153 96 68 12 Qua đời sử dụng ng kháng sinh với v nồng độ khác nh nhận thấy: số khuẩn lạc vi khuẩn khu sống sót tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh bbổ sung vào môi trường ng BHI Riêng đời thứ nhất, mật độ vi khuẩn sống ng sót gi giảm đột ngột, ½ so với đĩa đốii chứng ch không sử dụng kháng sinh Đờii không khu khuẩn lạc mọc ng sót sau xxử Khuẩn lạc vi khuẩn sống ng sót sau xxử lý Khuẩn lạc vi khuẩn sống lý rifampicin 1,2µg/ml rifampicin 1,1µg/ml Hình 3.2 Khuẩn lạcc chịu ch môi trường TCBScó bổ sung kháng sinh 3.2 Kết đánh ánh giá m mức độ giảm độc lực dòng đôt biến n Từ dòng vi khu khuẩn thu sau xử lý chiếuu tia UV rifampicin tiếp tục đánh giá mức độ giảm độc lực môi trường thạch ch máu cá SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 39 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 3.2.1 Kết thử khả dung huyết Độc tố dung huyết (haemolysis) yếu tố gây bệnh chủ yếu vi khuẩn V parahaemolyticus vật chủ Độc tố haemolysin bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng giải phóng haemoglobin Kết tạo tượng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis) Đánh giá khả gây dung huyết chủng đột biến nhằm mục đích xem xét mức độ giảm độc lực độc tố Kết thu Bảng 3.3, Hình 3.3 Bảng 3.3 Kết khả dung huyết Nguồn gốc Khả dung Chủng huyết Chủng tự nhiên Phân lập từ gan ruột cá hồng β LBT6 Dòng Sau 15 phút chiếu UV β Dòng Sau 18 phút chiếu UV γ Dòng Sau 21 phút chiếu UV β Dòng Sau 24 phút chiếu UV γ Dòng Chịu nồng độ kháng sinh γ 0,9µg/ml) Dòng Chịu nồng độ kháng sinh γ µg/ml) Dòng Chịu nồng độ kháng sinh 1,1 β µg/ml) Dòng Chịu nồng độ kháng sinh 1,2 γ µg/ml) γ không dung huyết β: dung huyết β SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 40 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học Kết thí nghiệm m nh nhận thấy, y, có dòng: Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng 8, có biểu u hi giảm độc lựcc hi tượng dung huyết thạch máu cừu n vòng dung huyết huy Không xuất Xuất dung huyếtt vòng dung huy huyết rõ Hình 3.3 Khảả dung huyết chủng ng LBT6 Dòng 3.2.2 Kết gây nhiễm m cá Trên đối tượng độộng vật mẫn cảm, sử dụng ng cá mú có kích thước 3cm để gây nhiễm ng dòng vi khuẩn khu gây đột biếnn dòng ttự nhiên LBT6, Liều tiêm cho mỗii cá 0,5ml canh khu khuẩn chứa 105CFU/ml Cá thí nghiệm đư nuôi điều kiện cho giống tự nhiên, th thời gian theo dõi 15 ngày Kếtt qu tiến hành gây nhiễm thực nghiệm ng dòng đột biến Dòng tự nhiên ban đầu đ LBT6 cho cá Mú phòng thí nghi nghiệm có kết cụ thể Bảng ng 3.4 Hình 3.4 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 41 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá 15 ngày tiêm Gây nhiễm Chủng Số cá thí Số cá Trạng thái bơi Trạng thái lấy thức ăn nghiệm sống LBT6 15 0 Dòng 15 Lờ đờ, hoạt động bơi Chậm chạm lội Dòng 15 13 Nhanh nhẹn, phản xạ Kém ăn Nhanh tốt Dòng 15 nhẹ Lờ đờ, hoạt động bơi Chậm chạm lội Dòng 15 14 Nhanh nhẹn, phản xạ Bình thường tốt Dòng 15 13 Nhanh nhẹn, phản xạ Kém ăn hơn, nhanh tốt Dòng 15 12 nhẹn Nhanh nhẹn, phản xạ Kém ăn Chậm tốt Dòng 15 0 Dòng 15 14 Nhanh nhẹn, phản xạ Bình thường tốt Lô cá có gây bệnh với dòng 1, dòng 3, dòng chủng tự nhiên gây chết hoàn toàn số cá sống sót Sau 48-72 gây nhiễm cá có biểu bệnh điển hình xuất huyết chỗ tiêm, thân vây,biếng ăn, bơi lờ đờ không nhanh nhẹn Chủng tự nhiên LBT6 dòng gây chết hoàn toàn cá thí nghiệm Các lô cá có gây nhiễm với dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 8, cho số lượng cá sống sót cao hơn, từ 12-14 sau 24-48 lây nhiễm cá có tượng ăn hoạt động Tuy vậy, sau 48 cá hoạt động lại bình thường SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 42 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học Cá khỏe mạnh nh bình thường th Cá có dấu hiệu bệnh nh lý Hình 3.4 Cá sau gây nhiễm nhi chủng đột biến n Như vậy, từ kết k thu thí nghiệm gây độột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, c, xác định đượcc dòng vi khu khuẩn nhược độc, dòng: òng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 3.2.3 Kết chạyy PCR xác định gen độc tố Các dòng vi khuẩnn đư lựa chọn nghiên cứu mục 3.2.2 đư tiếp tục sử dụng để xác định nh gen độc đ tố Mục đích thí nghiệm để xác định chế giảm độc lực chủủng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn: dòng 1, dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 7, dòng 8, LBT6,được nuôi cấy y môi tr trường BHI, đem tăng sinh khốối máy lắc vòng 24h, 28ºC vớii tốc t độ 150 vòng/phút Sau đem dịch ch nuôi cấy c ly tâm thu cặn tế bào Điện n di ki kiểm tra lại Kết thể Hình 3.5 3.5 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 43 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học (M: maker; 9: LBT6; 1: dòng 1; 2: dòng 2; 3: dòng 3; 4: dòng 4; 5: dòng 5; 6: dòng 6; 7: dòng 7; 8: dòng; M: maker.) Hình 3.5 Kích th thước DNA tổng số dòng Kết thể hiệện qua Hình 3.5 cho thấy kết tách DNA r tốt, sản phẩm đượcc dùng làm nguyên li liệu cho phản ứng PCR Chúng tiếnn hành kiểm ki tra gen độc tố Tox R, tdh, tlh, trh củaa dòng đột biến chủng LBT6 tự nhiên kết k thể Bảng 3.5.Hình 3.6 Dòng Bảng ng 3.5 Kết K kiểm tra có mặt gen độc tốố Tox R tdh tlh trh LBT6 Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có Dòng Có Không có có SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 44 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học Qua bảng kết kiểm ki tra gen độc tố dòng đột biếnn ch chủng LBT6 chứng tỏ gen độc tốố chủng sau xử lý UV rifampicin hoàn toàn giống số lượng ng kích thước th so với chủng tự nhiên Theo nghiên ccứu Zulkifli cộng sự, 1987 2009 Gen toxR có mặt tất ch chủng không gây bệnh chủng gây bệnh,, có chức điều hòa biểu củaa gen độc tố loài V parahaemolyticus arahaemolyticus Sự có mặt gen dòng vi khu khuẩn chứng tỏ chúng V.parahaemolyticus trình gây độtt bi biến tượng tạp nhiễm Gen Tox R (368bp) Gen tlh (450bp bp) Hình 3.6: Sảản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh Từ kết đánh ánh giá mức m độ giảm độc lực kết xác định nh gen đôc tố ng PCR cho phép bbước đầukết luận sơ rằng: ng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng vi khu khuẩn bị đột biến gen theo hướng giảm m đđộc lực 3.3 Kết đánh ánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá Một chủng ng vi khuẩn khu nhược độc đạt tiêu chuẩn sản xuất vắc-xin xin đạt nhấtt hai tiêu chí: 1) an toàn động vật mẫn cảm 2) có khả nă sinh kháng thể bảo hộ Từ kết xác định dòng vi khuẩn nhược độc, c, ti tiếp tục đánh giá khả tạo o kháng th thể bảo hộ dòng vi khuẩn độtt biến, bi bao gồm: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Cá mú sử dụng d cho nghiên cứu có kích thướcc 3cm, m mạnh khỏe, kiểm m tra không nhiễm nhi bệnh hoại tử gan thận phản ứng ng PCR Li Liều gây miễn dịch cho cá 105CFU/ml, sau gây mi miễn dịch sở, cá đượ ợc thử thách chủng tự nhiên LBT6 với v liều công cường độc 107CFU/ml Kếết thể Bảng 3.6 Hình 3.7 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 45 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Bảng 3.6 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ Trạng thái bệnh tích Gây nhiễm Dòng Số cá Số cá ban sống đầu sót Trạng thái Trạng thái bơi lấy thức ăn Bệnh tích cá - Không xuất huyết da Dòng 15 13 Chậm Kém ăn - Không xuất điểm chạm lờ Chậm hoại tử gan thận đờ chạm - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Không xuất huyết da Dòng 15 14 Bình Bình thường thường - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Không xuất huyết da Chậm Dòng 15 13 chạm hơn, bình - Không xuất điểm Kém ăn hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, thường bị stress tiêm - Không xuất huyết da Dòng 15 12 Lờ đờ Kém ăn chậm chạm - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 46 Viện Đại Học Mở Hàà Nội N Khoa Công Ngh Nghệ Sinh Học Chết hoàn Chết Dòng 15 hoàn - Xuấtt huy huyết toàn thân, toàn sau 60 toàn sau 60 nội tạng giờ - Hoại tử gan thận Đối chứn g Chết hoàn Chết (chủn g tự 15 nhiên hoàn - Xuấtt huy huyết toàn thân, toàn sau 60 toàn sau 60 nội tạng giờ - Hoại tử gan thận LBT6 ) Hình 3.7 Cá thí nghiệm nghi sau gây nhiễm 15 ngày Hình 3.7.Cá thí nghiệm m sau gây nhiễm nhi sống hoạt động ng bình th thường Từ kết kết luận dòng: dòng 2, dòng 4,dòng 4, 5, dòng 6, có khả ng sinh kháng thể th bảo hộ cá, dòng sử dụng làm nguyên liệu sản xuấtt vvắc-xin SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 47 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Từ chủng Vibrio parahaemolyticustự nhiên LBT6 phân lập từ gan ruột cá hồng có dấu hiệu hoại tử Cát Bà, Hải Phòng Chúng tiến hành sử dụng hai tác nhân tia UV kháng sinh rifampicin để tạo chủng nhược độc Chúng tạo nhiều dòng đột biến thời gian thí nghiệm hạn chế tiến hành kiểm tra dòng đột biến thời gian chiếu UV nồng độ kháng sinh đời cuối, cụ thể là: dòng 1(Sau 15 phút chiếu UV), dòng (sau 18 phút chiếu UV), dòng (Sau 21 phút chiếu UV), dòng (Sau 24 phút chiếu UV), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 0,9µg/ml), dòng (Chịu nồng độ kháng sinh µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 1,1 µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 1,2 µg/ml) dòng vi khuẩn qua đánh giá mức độ giảm độc lực môi trường thạch máu, PCR cá Chúng xác định dòng vi khuẩn nhược độc, dòng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng vi khuẩn đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ chúng xác định dòng:dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, có khả sinh kháng thể bảo hộ cá, dòng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin B Kiến nghị Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dòng có vi khuẩn an toàn nhất, tạo đáp ứng miễn dịch bền vững để nghiên chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 48 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr186-198 [2] Từ Thanh Dung (2011), Thử nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh, Tạp chí thương mại thủy sản [3] Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhược độc cách chọn môi trường kháng sinh Rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Kỷ yếu Hội nghịcông nghệ sinh học toàn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr.108 [4]Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát Vibriotrong thủy hải sản đông lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM, tr15, 40-42 Tài liệu tiếng Anh [5] Amy J.V., Joseph D.B., Stephanie P.F., Christine T.H., Kimothy L.S.,Paul K (2002), Molecular analysis of Rifampicin resistance in Bacillus anthracis and Bacillus cereus, Antimicrobial agents and chemotherapy46 (2): 511-513 [6] Austin B., Austin D.A (2007) Vibrios, bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish, Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK, p 594 [7] Alsina M and Blanch A.R (1994) Improvement and update of a set of keys for biochemical-identification of Vibrio species, Journal of Applied Bacteriology 77: 719-721 [8] Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.C (2008), Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates,Vaccine 26: 5582 – 5589 [9] Chao G., Jiao X., Zhou X., Yang Z., Huang J., Zhou L., Qian X (2009), Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio parahaemolyticusisolated from different sources in coastal province Jiangsu, China, Food Control 20: 907-912 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học [10] Christopher A.B., Thomas J.C., Kim O (2011),Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and Infection 13: 992-1001 [11] Daniels N.A., MacKinnon L., Bishop R., Altekruse S., Ray B., Hammond R.M., Thompson S., Wilson S., Bean N.H., Griffin P.M., Slutsker L (2000),Vibrio parahaemolyticus infections in the United States 1973–1998 Journal of Infectious Diseases 181: 1661 – 1666 [12]Duff D.C.B (1942),The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida, Journal Immunology 44: 87-94 [13] Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N., Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 – 912 [14] Harris K.A., Hartley J.C (2003), Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service, Journal of Medical Microbiology 52: 685-691 [15] Harikrishnan R., Balasundaram C., Heo M.S (2010), Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology, Aquaculture 309: 1-14 [16] Harikrishnan R., Kim J.S., Balasundaram C., Heo M.S (2012) Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on immune response and disease protection in Epinephelus bruneus against Vibrio harveyi, Aquaculture 342-343: 69-74 [17] Honda T., Iida T (1993),The pathogenicity ofVibrio parahaemolyticus& the role of thermostable direct hemolysin & related hemolysins Rev Med Microbiol 4: 106–113 [18] FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 [19] Kaper J.B., Colwell R.R., Joseph S.W., Colwell R.R., Kaper J.B (1983),Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios Critical Rev Microbiol 10: 77-123 [20] Kaneko T., Colwell R.R (1973), Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology 113: 24-32 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 50 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học [21] Kazuyuki K., Shigeko T., Hiroo I (1979), Effect of Mediumon Flagellation of Vibrio parahaemolyticus, Appied and Environmental Microbioogyl 37: 1248-1249 [22] KumarK.P., Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase – effect of Rifampicin on purine or pyramidine–initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletter306 (1): 46 -50 [23] Lee, A.S.G., Irene H.K., Lim, Lynn L.H Tang Sin Yew Wong,(2005) High frequency of mutations in the rpoB gene in Rifampicin – resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Singapore Journal of Clinical Microbiology, 43(4): 2026 – 2027 [24] Nash G., Anderson I.G., Shariff M., Shamsudin M.N (1987), Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia, Aquaculture 67:105-111 [25] Nishibuchi M., Kaper J.B (1995), Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium Infection and immunity 63(6): 2093–2099 [26] Nishibuchi M., Kumagai K., Kaper J.B (1991), Contribution of the tdh1 gene of Kanagawa phenomenon-positive Vibrio parahaemolyticus to production of extracellular thermostable direct hemolysin Microbial Pathogeness 11: 453–460 [27] Tuyet D.T., Thiem V.D., Von S.L., Chowdhury A., Park E., Canh D.G., Chien B.T., Van T.T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy T.H., Nichibuchi M., Clemens J., Trach D.D (2006), Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Journal of Infectious Diseases 186(11): 1615–1620 [28] Shyne A.P.S, Sobbhana K S, George K C, Paul R.R (2008) Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.), joumal of the marine biological association 50: 1-6 [29] Van W.B (2008),A history of fish immunology and vaccination The early days, Fish Shellfish Immunol 25: 397-408 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 51 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học [30] Zhang X.H., Austin B (2005),A review haemolysins in Vibrio species, Journal of Applied Microbiology 98: 1011–1019 [31] Zulkifli Y., Alitheen N.B., Son R., Yeap S.K., Lesley M.B.,Raha A.R (2009), Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes International Food Research Journal 16: 289-296 Tài liệu internet [32] http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren-thuy-san11372/ [33] http://www.tuamvisinh.com/tin-tuc/kiem-tra-dinh-tinh-vibrio-cholera-vibrio- parahaemolyticus.html [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_ngo%E1%BA%A1i SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 52 [...]... dài Sau đó, nhiều loại vắc- xin vi khuẩn cho cá với các phương thức chế tạo khác nhau đã được nghiên cứu như vắc- xin bất hoạt kết hợp đa kháng nguyên, vắc- xin sống nhược độc, vắc- xin có bổ sung các loại chất bổ trợ khác nhau Vi c sử dụng vắc- xin phòng bệnh đã đem lại những thành công vượt bậc cho nghề nuôi cá ở nhiều nước Trong vài năm trở lại đây, các nghiên cứu vắc- xin phòng bệnh cho cá mú bắt đầu được... khả năng tạo kháng thể bảo hộ là nguyên liệu có chất lượng tốt để sản xuất vắc- xin bệnh hoại tử gan thận ở cá biển 1.4 Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi của đề tài Hiện nay, ở Vi t Nam, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn V .parahaemolyticus giảm độc lực sử dụng để sản xuất vắc- xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển là nghiên cứu mới Thành công của đề tài sẽ góp phần giải quyết một cách đáng kể vi c sử... Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản vẫn còn hạn chế Vi c tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra cho đối tượng thủy sản 1.3 Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển do Vibrio parahaemolyticus gây ra Vi khuẩn V parahaemolyticus. .. cũng có thể bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus, Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus bệnh vi m gan A Hiện nay, V parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn do ăn cá biển và hải sản Trong khoảng 50 năm qua, người ta đã nghiên cứu nhiều về loại vi khuẩn này Các nhà khoa học lo ngại... Tuy nhiên, vắc- xin từ vi khuẩn bất hoạt thường cho hiệu quả bảo hộ trong thời gian ngắn Nhìn chung, trên thế giới, nhiều loại vắc- xin phòng bệnh cho cá nuôi đã được nghiên cứu và sản xuất, từ loại vắc- xin đơn giản như vắc- xin bất hoạt SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 14 Vi n Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học (inactivated), đến vắc- xin có công nghệ sản xuất phức tạp như vắc- xin nhược độc (live attenuated),... attenuated), vắc- xin đa giá (multivalent), vắc- xin tiểu phần (sub-unit vắc- xin) Mỗi loại vắc- xin có qui trình sản xuất, cách sử dụng cũng như công hiệu khác nhau trên các loài cá Tuy nhiên, có rất ít những loại vắc- xin được thương mại hóa ra thị trường hiện nay 1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Vi t Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vắc- xin cho cá vẫn còn khá mới mẽ Vài công trình nghiên cứu. .. gen aroA có độc lực thấp hơn nhiều(>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu được kiểm tra lại bằng cách gây nhiễm lại trên cá hồi Nhìn chung, gần đây những nghiên cứu miễn dịch cá và vắc- xin vi khuẩn phòng bệnh cho cá ở Vi t Nam đã được quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch trên các SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 15 Vi n Đại Học... tác động của nhóm vi khuẩn Vibriosp[32] Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phổ biến ở các loài cá biển trên thế giới Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết khi nhiễm Vibrio có thể trên 50% trong một đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc cơ thể biến đổi và xuất hiện vùng hoại tử Khi cá bệnh nặng nội quan có thể xuất huyết hoặc bên trong chứa đầy dịch lỏng V parahaemolyticus. .. nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen [4] SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 13 Vi n Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 1.4 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Ở các nước có nghề nuôi cá. .. cá biển phát triển như Na Uy, Mỹ, Nhật Bản, vi c nghiên cứu và sử dụng vắc- xin cho cá được đầu tư nghiên cứu từ rất sớm và đạt được nhiều thành công Thử nghiệm vắc- xin vi khuẩn để phòng bệnh cho cá được công bố đầu tiên bởi Duff (1942) [12] Trong nghiên cứu này, cá hồi sau khi ăn vi khuẩn Aeromonas salmonicida bất hoạt bằng chloroform đã có khả năng kháng bệnh lở loét Furunculosis Năm 1970, vắc- xin