KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Cacbon Nitơ trình lên men sinh tổng hợp Mannitol vi khuẩn lactic Người hướng dẫn : Ths Đỗ Trọng Hưng Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Thủy Lớp : 11 – 01 -*** Hà Nội – 2015 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đỗ Trọng Hưng, phó chủ nhiệm môn công nghệ đường bột - Viện Công nghiệp thực phẩm, tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm chuyên môn giúp đỡ động viên tinh thần cho em suốt trình viết khóa luận tốt nghiệp Đồng thời em xin cảm ơn anh, chị cán phòng Công nghệ đường bột – Viện Công nghiệp thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em trình thực khóa luận Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học- Viên Đại Học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức tiếp thu suốt trình học không tảng cho trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên em, cổ vũ động viên em suốt trình học tập thực khóa luận Do thời gian trình độ hạn chế, không tránh khỏi sai sót Em mong nhận giúp đỡ bảo thầy cô Em xin trân trọng cảm ơn Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Phạm Thanh Thủy SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Tên hóa chất dùng nghiên cứu .20 Bảng 2.2: Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu .21 Bảng 2.3: Môi trường MRS 21 Bảng 2.4: Môi trường SCP1 .22 Bảng 2.5: Môi trường SCP2 .22 Bảng 2.6: Môi trường OSCP 23 Bảng 2.7: Môi trường lên men SP 23 Bảng 3.1 Khả phát triển chủng VK lactic môi trường MRS 29 Bảng 3.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp mannitol cao 31 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái chủng Lactobacillus sp HF08 33 Bảng 3.4 Đánh giá khả phát triển điều kiện pH nhiệt độ khác chủng vi khuẩn Lactobacillus sp HF08 34 Bảng 3.5 Khả sử dụng nguồn cacbon khác chủng Lactobacillus sp HF08 35 Bảng 3.6 Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp .36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp đường môi trường nhân giống đến sinh trưởng phát triển Lb fermentum HF08 37 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi nhân giống tới khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối tế bào chủng Lb fermentum HF08 38 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian nhân giống tới khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối chủng Lb fermentum HF08 .39 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH môi trường nhân giống tới khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối tế bào chủng Lb fermentum HF08 40 Bảng 3.11 Ảnh hưởng phối hợp chất đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol .41 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ phối hợp chất đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol .42 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng độ chất đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol .43 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nguồn đường đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol 44 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol 45 Bảng 3.16 Ảnh hưởng tỉ lệ nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol 48 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Đồ thị sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn lactic 30 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) mẫu lên men chủng Lactobacillus sp HF08 (b) 31 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) mẫu lên men môi trường có nồng độ fructose/glucose = 100/50 g/l (b) 43 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) mẫu lên men môi trường chứa cao nấm men FIRI (b) 46 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT CNSH: Công nghệ Sinh học CNTP: Công Nghiệp Thực phẩm MDH: Mannitol dehydrogenase VSV: Vi sinh vật VK: Vi khuẩn LAB: Vi khuẩn Lactic FDA: Cục Quản lý thực phẩm thuốc Hoa Kỳ LDH: Lactate dehydrogenase HPLC: Sắc ký lỏng cao áp CSL: Cao ngô HFCS: High fructose corn syrup rpm: vòng/phút CFU/ml: Số lượng khuẩn lạc/ ml FIRI: Viện Công nghệ Thực phẩm SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Hiện nay, giới Việt Nam bệnh liên quan đến dư thừa lượng béo phì, huyết áp, tim mạch đặc biệt bệnh tiểu đường, tiêu thụ dinh dưỡng mức đặc biệt sản phẩm có chứa đường (carbohydrate), sản phẩm gây bệnh miệng hay gặp trẻ em ăn nhiều thực phẩm có chứa đường thông thường Với phát triển khoa học công nghệ, nhà nghiên cứu nghiên cứu tạo chất có vị đường, polyol sử dụng chất đường thay nên gọi “Sugar free”, có mannitol Mannitol đường rượu sáu cacbon, có độ khoảng nửa đường saccarose Nó tìm thấy nhiều rau củ hoa như: bí ngô, nấm, hành, tảo biển, đặc biệt tảo biển nâu Mannitol sử dụng phổ biến toàn giới mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe người tăng sức đề kháng, có lượng calo thấp, có lợi cho người tiểu đường, tim mạch hay người ăn kiêng sử dụng,… Vì mannitol ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, y tế Trong số phương pháp sản xuất mannitol: hóa học, enzym lên men sinh tổng hợp cho thấy công nghệ lên men có ưu việt hơn, tạo sản phẩm có độ tinh khiết cao, dễ triển khai sản xuất qui mô công nghiệp có khả cạnh tranh giá thành sản xuất từ nguyên liệu có sẵn rẻ tiền Trong trình lên men, chủng vi khuẩn axit lactic sử dụng đối tượng nghiên cứu sản xuất mannitol, chủng ứng dụng rộng rãi an toàn chế biến bảo quản thực phẩm, đồ uống, y dược, Quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol vi khuẩn lactic ảnh hưởng điều kiện lên men nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống, chất cacbon nitơ đóng vai trò quan trọng, định hướng đến sản phẩm cuối theo mong muốn nâng cao hiệu trình lên men Cơ chất để chuyển hoá thành mannitol fructose tác dụng enzyme mannitol dehydrogenase phụ thuộc NADH, bên cạnh phối hợp chất trình lên men nghiên cứu cho thấy chúng có vai trò quan SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển hoá sinh tổng hợp mannitol, nguồn cacbon quan trọng Bên cạnh chất nguồn cacbon vi khuẩn lactic cần nguồn dinh dưỡng khác để sinh trưởng, phát triển cách tốt Một số chất quan trọng nitơ - thành phần thiếu môi trường sinh trưởng phát triển vi sinh vật nói chung vi khuẩn lactic nói riêng, nhằm tổng hợp nên thành phần quan trọng xây dựng tế bào vi sinh vật Do hai yếu tố liên quan chặt chẽ đến trình sinh tổng hợp mannitol phương pháp lên men vi khuẩn lactic, với mục đích nhằm xác định nguồn cacbon nitơ thích hợp để nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng hợp mannitol, giúp cho trình thu hồi sau đạt hiệu suất chất lượng cao Với thời gian có hạn, đề xuất nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Cacbon Nitơ trình lên men sinh tổng hợp Mannitol vi khuẩn lactic” Mục tiêu đề tài: Đánh giá ảnh hưởng xác định tỷ lệ thích hợp nguồn chất cacbon nitơ trình lên men sinh tổng hợp mannitol chủng vi khuẩn lactic Nội dung nghiên cứu chính: Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp mannitol cao Đánh giá số đặc điểm hình thái, tính chất sinh hoá chủng vi khuẩn lactic lựa chọn Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho trình nuôi cấy nhân giống chủng vi khuẩn lactic lựa chọn Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon trình lên men sinh tổng hợp mannitol chủng vi khuẩn lactic lựa chọn • Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nguồn chất trình lên men sinh tổng hợp mannitol • Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối hợp nguồn Cacbon thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp mannitol SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội • Nghiên cứu lựa chọn nồng độ nguồn Cacbon thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp mannitol • Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn đường thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp mannitol Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ trình lên men sinh tổng mannitol chủng vi khuẩn lactic lựa chọn • Nghiên cứu lựa chọn nguồn Nitơ hữu thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp mannitol • Nghiên cứu xác định tỷ lệ Nitơ hữu thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp mannitol SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT T NGHIỆP Viện ện Đại Đạ Học Mở Hà Nội PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 MANNITOL – TÍNH CH CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA A MANNITOL 1.1.1 Mannitol [14,21,23,43 [14,21,23,43]: Mannitol có công th thức hóa học C6H14O6,(tên gọi ọi khác mannite, Dmannohexane-1,2,3,4,5,6-hexaol, hexaol, mannitolum, mannitolo hay đường ờng manna), manna) đồng phân lập thể sorbitol Mannitol llà nguyên liệu sinh hóa quan trọng ọng thường th sử dụng nhiều lĩnh vực ực nh y học thực phẩm, công nghệ sinh học ọc Mannitol thuộcc nhóm polyol - tên gọi thu gọn nhóm rượu u đa phân tử, t nên gọi “sugar gar alcohol” công th thức có chứaa nhóm alcohol (CH-OH) (CH vị trí cacbonyl (C=O) aldose ketose Polyols carbonhydrates nh đường, ải rrượu, chúng sử dụng chất ất làm l ngọt, nhà khoa học gọi chúng "đườ ờng rượu" phần cấu u trúc hóa học h tương tự đường phần tương ương ttự rượu ên phân lập từ dịch triết củaa hoa tro, Fraxinus ornus Mannitol lần vào năm 1920.Trên thếế giớ giới, mannitol sản xuất ên quy mô công nghiệp nghi phương pháp hydro hóa nhi nhiệt độ áp suất cao Nhưng vài năm trở lại lạ nhà khoa học ứng dụng ng công ngh nghệ sinh học để sản xuất mannitol quy mô công nghiệp nghi với nhiều ưu điểm vượt trội ội thay th cho phương pháp truyền n thống thố 1.1.2 Tính chất mannitol[14,47] [14,47] - Là tinh thể màu trắng ắng - Có độ hòa tan thấp: ấp: 20% 20°C - Nhiệt độ nóng chảy ảy cao: 165 - 168°C - Có độ thấp (bằng ằng 50% so với đường mía) giúp ích cho người ời bị bệnh tiểu đường sử dụng SVTH: Phạm Thanh Thủy,11 11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội - Có lượng thấp: 1g mannitol sản sinh 1.6 kilocalo điều cho thấy mannitol thích hợp với người thừa cân béo phì hay người ăn kiêng - Mannitol xếp vào loại prebiotic, kích thích phát triển vi sinh vật đường ruột Bifidobacteria Lactobacilli làm tăng quẩn thể Bifidobaterium Các vi khuẩn đường ruột có khả chuyển hóa mannitol thành axit hữu axit béo chuỗi ngắn (axit axetic, propionic, n-butyric) mà không sinh lượng, tạo môi trường axit thấp đại tràng ngăn chặn phát triển vi khuẩn gây bệnh Ngoài axit hữu cải thiện hệ tiêu hóa, axit axetic propionic chống tăng cholesterol, butyric hạn chế phát triển biểu mô thành tế bào đại tràng giúp đại tràng tăng khả hấp thu khoáng chất, tổng hợp vitamin nhóm B, axit folic tăng cường hệ thống miễn dịch - Mannitol chất không bị thủy phân enzyme tiêu hóa nên có khả phòng bệnh miệng đặc biệt tình trạng sâu trẻ em 1.1.3 Ứng dụng mannitol[7,14,36] 1.1.3.1 Trong thực phẩm: Với đặc tính mannitol như: giảm số đường huyết, kiểm soát insulin khả thấp thụ từ từ thể, giá trị lượng thấp, độ tính chất hút ẩm thấp nên thay thếđường cho sản phẩm cần giảm calo, thực phẩm cho người bị tiểu đường Mannitol thường sử dụng sản phẩm như: kẹo cao su, kẹo mền, kem, kẹo bạc hà, bánh cookie , thạch trái Trong chế biến thực phẩm, mannitol ứng dụng rộng rãi chiếm 50,6%(trong 42% sản xuất kẹo, lại thực phẩm khác) Do tính chất không hút ẩm lượng thấp nên mannitol lựa chọn ứng dụng sản xuất kẹo chủ yếu, mannitol sử dụng sản xuất kẹo socola không đường thành phần bao bọc kẹo giúp kẹo không dính vào giấy gói Trong sản xuất kẹo dùng cho người tiểu đường, số polyol mannitol lựa chọn chất tạo độ thích hợp nhất, không kích thích tăng glucose máu Mannitol Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp vào nhóm thực phẩm an toàn, đặc biệt sử dụng chất phụ gia an toàn cho người SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết cho thấy với nồng độ đường fructose < 100 g/l glucose < 50 g/l mật độ tế bào thấp hạn chế chất nguồn đường, dẫn đến khả chuyển hoá fructose thành mannitol bị hạn chế, với nồng độ đường fructose glucose cao ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu môi trường lên thành tế bào vi khuẩn làm ức chế trao đổi chất sinh trưởng chúng, dẫn đến hiệu suất chuyển hoá fructose thành mannitol bị thuyên giảm Do ta chọn nồng độ đường thích hợp fructose 100g/l glucose 50g/l để nghiên cứu sinh tổng hợp mannitol 3.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn đường đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol Trong sản xuất, nguyên liệu đầu vào yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol, đồng thời góp phần làm hạ giá thành sản phẩm Trong thí nghiệm này, sau hoạt hoá nhân giống môi trường điều kiện nuôi nghiên cứu, tiến hành lên men môi trường SP với nguồn cung cấp đường khác nhau: Glucose, fructose dạng hoá chất siro fructose 55% (HFCS) bổ sung với tỉ lệ glucose/fructose 50/100 g/l, sucrose rỉ đường bổ sung vào môi trường lên men với hàm lượng đường tổng 150 g/l Điều kiện lên men: 350C, 48h, tỉ lệ tiếp giống 10%, pH môi trường ban đầu 6,2-6,5 Kết thí nghiệm thể bảng sau Bảng 3.14 Ảnh hưởng nguồn đường đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol TT Nguồn chất đường Nồng độ CFU/ml đường (g/l) Hàm lượng mannitol (g/l) Dạng hoá chất tinh khiết 150 4,1 x 109 87,5 Siro HFCS55 150 4,0 x 109 87,3 Rỉ đường 150 3,3 x 109 31,4 Sucrose 150 2,6 x 109 43,2 Qua bảng cho thấy, nguồn đường dạng hoá chất tinh khiết dạng siro fructose 55% (HFCS 55) cho kết sinh tổng hợp mannitol tương đương nhau, nguồn đường từ rỉ đường sucrose nguồn đường thích hợp cho trình chuyển SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội hoá tạo mannitol, chí rỉ đường ức chế phát triển chủng vi khuẩn rỉ đường hoá chất vô tẩy trắng đường, tạp chất tồn dư trình sản xuất đường mía Để tính toán hiệu kinh tế, dạng siro fructose 55% rẻ nhiều so với fructose dạng hoá chất, trình nghiên cứu sản xuất sau này, lựa chọn nguồn cung cấp đường siro fructose 55% (HFCS 55) Thành phần đường siro này, 100g chất khô bao gồm: fructose 55%, glucose 45%, lại đường > G1 5% 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ hữu đến phát triển tế bào khả sinh tổng hợp mannitol 3.2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp manniol chủng vi khuẩn lactic Vi sinh vật tất thể sống khác cần nitơ trình sống để xây dựng tế bào Trong tất môi trường nuôi cấy vi sinh vật phải có loại hợp chất nitơ mà vi sinh vật đồng hóa Việc chọn nguồn nitơ cần thiết đảm bảo tốc độ sinh trưởng, hiệu suất lên men cao có lợi mặt kinh tế Vì thí nghiệm sau chủng giống hoạt hoá nhân giống môi trường điều kiện nuôi xác định, tiến hành lên men môi trường SP với thành phần đường fructose/glucose = 100/50 g/l khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ hữu đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol Nguồn nitơ khảo sát gồm: cao nấm men, cao thịt, cao ngô, casamino acid với nồng độ 5g/l Điều kiện lên men: 350C, 48h, tỉ lệ tiếp giống 10%, pH môi trường ban đầu 6,2-6,5 Kết thể qua bảng 3.15 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol Nguồn nitơ hữu CFU/ml Đường khử Đường Hàm lượng Hiệu suất sót (g/l) fructose sau mannitol chuyển lên men (g/l) hoá(*) (g/l) (%) Cao thịt 4,0 x 109 9,1 6,9 85,3 91,6 Cao ngô 3,1 x 109 13,6 8,5 74,8 81,7 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Cao nấm men Viện Đại Học Mở Hà Nội 4,1 x 109 7,3 5,7 87,5 92,8 4,2 x 109 7,4 5,8 87,4 92,8 9,4 72,7 80,2 (Merck) Cao nấm men (Viện CNTP) Casamino acid 2,9 x 109 18,0 (*) : Hiệu suất chuyển hoá fructose thành mannitol 0.6 0.2 0.0 Glucose 11.673 Mannitol 12.347 Fructose 9.727 0.2 0.4 Volts Volts 0.4 Glucose std 11.607 Mannitol std 12.240 Fructose std 10.287 0.6 0.0 10 M inutes 15 10 15 Minutes (a) (b) Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) mẫu lên men môi trường chứa cao nấm men FIRI (b) Qua thí nghiệm cho thấy khả sinh trưởng lên men sinh tổng hợp mannitol môi trường SP có nguồn nitơ hữu khác cho kết khác Nguồn nitơ hữu cao nấm men cho khả sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol cao nhất, hiệu suất chuyển hoá fructose thành mannitoltốt so với nguồn nitơ khác cao nấm men cung cấp đầy đủ loại axit amin đặc biệt axit amin không thay thế, đồng thời chứa nhiều loại vitamin nhóm B khoáng chất nên kích thích vi khuẩn phát triển tốt Đồng thời kết thí nghiệm lựa chọn nguồn cao nấm men Viện Công nghiệp Thực phẩm sản xuất có kết lên men sinh tổng hợp mannitol tương đương với cao nấm men ngoại nhập có giá thành cao nhiều Do vậy, sản xuất chọn nguồn nitơ hữu cho trình lên men sinh tổng hợp SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội mannitol cao nấm men Viện CNTP sản xuất Kết nghiên cứu có ý nghĩa giá trị kinh tế cao, góp phần giảm chi phí đầu tư đáng kể 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol Tác dụng hỗn hợp thành phần có môi trường khác với tác dụng thành phần riêng biệt Có thể có mặt thành phần làm giảm tác dụng kìm hãm làm tăng tác dụng kích thích thành phần Vì trình nghiên cứu ta cần phải xác định tỷ lệ thích hợp thành phần môi trường đường thực nghiệm để chọn môi trường thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển Trong thí nghiệm này, sau chủng Lactobacillus sp HF08 hoạt hoá nhân giống, tiến hành lên men môi trường SP có thành phần nguồn nitơ từ peptone cao nấm men có tỷ lệ khác Điều kiện lên men: 350C, 48h, tỉ lệ tiếp giống 10%, pH môi trường lên men ban đầu 6,2-6,5 Kết thí nghiệm thể bảng 3.16 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 3.16 Ảnh hưởng tỉ lệ nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol Tỷ lệ nguồn nitơ CFU/ml (g/l) Peptone Cao nấm Đường Đường Hàm Hiệu suất khử sót fructose lượng chuyển (g/l) sau lên mannitol hoá(*) (%) men (g/l) (g/l) men 10 2,6 x 109 15,4 8,7 73,8 80,8 10 3,8 x 109 8,1 6,3 86,3 92,1 10 4,2 x 109 7,4 5,7 87,5 92,8 10 4,3 x 109 7,0 5,4 87,8 92,8 2,5 x 109 12,3 9,2 71,3 78,5 3,7 x 109 9,4 7,5 83,5 90,3 4,1 x 109 7,5 5,9 87,4 92,9 10 3,8 x 109 8,0 6,3 86,3 92,1 15 3,0 x 109 10,7 8,5 80,4 87,9 (*) : Hiệu suất chuyển hoá fructose thành mannitol Qua kết thí nghiệm cho thấy với tỉ lệ peptone g/l cao nấm men g/l môi trường lên men cho kết chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.HF08 sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol tốt Ở nồng độ nấm men cao kết sinh trưởng sinh tổng hợp mannitol tăng không đáng kể, không hiệu kinh tế, nồng độ peptone cao cho kết lên men không cao hơn, mà chí bị suy giảm nồng độ peptone kết hợp với cao nấm men tạo nên độ nhớt môi trường cao, áp suất thẩm thấu lớn, gây ức chế sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic, dẫn đến ảnh hưởng đến kết lên men sinh tổng hợp mannitol Do nghiên cưu chọn môi trường lên men SP với tỉ lệ nguồn nitơ: peptone 7g/l cao nấm men FIRI 2g/l SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau: Từ sưu tập chủng giống vi sinh vật công nghiệp CNTP, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic: Chủng vi khuẩn lactic lựa chọn: Lactobacillus sp HF08 - Có đặc điểm hình thái số tính chất sinh hóa chủng: + Là trực khuẩn, gram dương (+), ưa nhiệt 30 - 37°C + Thuộc nhóm vi khuẩn lactic dị hình + Có khả sử dụng số loại đường, không sử dụng đường mannitol Điều kiện thích hợp nuôi cấy nhân giống chủng Lactobacillus sp HF08 - Môi trường nhân giống : OSCP với tỷ lệ cacbon glucose/fructose = 10/20 (g/l) - Điều kiện nuôi cấy: 30°C, 24 giờ, pH = – 6.5 - Kết sinh khối tế bào (CFU/ml): 6.1 – 6.2 x 109 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến trình sinh tổng hợp mannitol: - Sự phối hợp chất: chọn fructose/glucose theo tỷ lệ 2/1 - Nồng độ đường thích hợp: 150(g/l) với tỷ lệ Fructose/Glucose =100/50 (g/l) - Nguồn đường sử dụng: siro HFCS55 (Thái Lan) - Hàm lượng mannitol dịch lên men đạt: 87.3 – 87.5 (g/l) - Hiệu suất chuyển hóa fructose thành mannitol vào khoảng: 92.8 – 92.9 % Ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp mannitol: - Nguồn nitơ chọn được: cao nấm men (viện công nghệ thực phẩm) - Tỷ lệ nguồn nitơ: peptone / cao nấm men = 7/2 (g/l) SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Sưởng, Lương Đức Phẩm (1996) Vi sinh vật bảo quản, chế biến thực phẩm NXB Giáo Dục, tr.14, 41–44, 140–144, 185–288 Kiều Hữu Ảnh (2010) Giáo trình Vi sinh vật học thực phẩm NXB Giáo dục, tr116132 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên (1997) Hoá sinh học công nghiệp Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng (2004) Công nghệ vi sinh,tập 1,2 NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, tr.322-326 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997) Giáo trình Vi sinh vật học NXB Giáo dục, tr.176-189, tr.224-230 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996) Vi sinh học NXB Giáo dục, tr.133138 TIẾNG ANH Anonymous, Chemical prices, Chemical Market Reporter 261 (2002d), issue Brian J B Wood (1992) The Lactic acid bacteria in health and disease Elsevier Applied Science London and New York, vol Calorie Control Council (2006), Questions & Answers For Health Professionals Calorie Control Council 1100 Johnson Ferry Rd Suite 300 Atlanta, GA 30342 (404) 252-3663 10.Carvalheiro F, Moniz P, Duarte LC, Esteves MP, Gírio FM (2011) Mannitol production by lactic acid bacteria grown in supplemented carob syrup J Ind Microbiol Biotechnol., 38:221–227 11 Claudia P.M.L Fontes, Mariana Santiago Silveira, Alexandre A Guilherme, Fabiano A.N Fernandes and Sueli Rodrigues (2013) Substitution of yeast extract by SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 50 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội ammonium sulfate for mannitol production in cashew apple juice Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2:69-75 12.Condon, S., (1987) Responses of lactic acid bacteria to oxygen, FEMS Microbiol Rev., Vol 46, p.269-280 13.Devos F (1995) Process for the production of mannitol U.S patent US 5466795 14.F Patra, S.K Tomar and S Arora (2009) Technological and functional applications of low-calorie sweeteners from lactic acid bacteria Journal of food science, Vol 74, No.1, p.16-23 15.Falguni Patra, Sudhir Kumar Tomar, Yudhishthir Singh Rajut and Rameshwar Singh (2011) Characterization of mannitol producing strains of Leuconostoc species World J Microbiol Biotechnol., 27:933-939 16.Fontes C., Honorato T., Rabelo M., Rodrigues S (2009) Kinetic study of mannitol production using cashew apple juice as substrate Bioprocess Biosys Engin., 32:493–499 17.Graspar P., Neves A.R., Ramos A., Gasson M.J., Shearman C.A., and Santos H (2004) Engineering Lactococcus lactis for production of mannitol: high yields from food-grade strains deficient in lactate dehydrogenase and the mannitol transport system Appl Envion Microbiol., 70, 1466-1474 18.Higuchi, M., Yamamoto, Y and Kamio, Y., (2000) Molecular biology of oxygen tolerancein lactic acid bacteria: functions of NADH oxidases and Dpr in oxidative stress, J.Biosci Bioeng Vol 90, p.484-493 19.Hols, P., Ramos, A., Hugenholtz, J., Delcour, J., De Vos, W M., Santos, H., & Kleerebezem, M (1999) Acetate utilization in Lactococcus lactis deficient in lactate dehydrogenase: A rescue pathway for maintaining redox balance Journal of Bacteriology, 181: 5521–5526 20.Howaldt M., Gottlob A., Kulbe K & Chmiel H (1988) Simultaneous conversion of glucose/fructose mixtures in a membrane reactor Ann N.Y Acad Sci., 542, 400-405 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội 21.Jong Won Yun and Dong Hyun Kim (1998) A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 85, No.2, p.203-208 22.Jonh E Long and Cliton (1996) “High fructose corn syrup” Biotechnology, 31 (12), 868-873 23.Juan Sanchez (1998) Colorimetric Assay of Alditols in Complex Biological Samples J Agric Food Chem., Vol.46, p.157-160 24.Judith Wylie-Rozatt, EdD, RD, (January 2006).High Fructose Corn Syrup 25.Jurgens, Hella (2005),Consuming Fructose-sweetened Beverages Increazas Body Adiposity in Mice Obesity Res., 13: 1146-1156 26.Karin Hofvendahl, Barbel Hahn – Hagerdal (2000) Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources Enzyme Microb Technol., 26(2-4), p.87-107 27.Maria Eugenia Ortiz, Juliana Bleckwedel, Raul R Raya, Fernanda Mozzi (2013) Biotechnological and in situ food production of polyols by lactic acid bacteria Appl Microbiol Biotechnol., Vol.97, p 4713-4726 28.Maria Papagianni, Matic Legisa (2014) Increased mannitol production in Lactobacillus reuteri ATCC 55730 production strain with a modified 6phosphofructo-1-kinase Journal of Biotechnology, 181:20-26 29.Min Yue, Hailong Cao, Jianping Zhang, Shuguang Li, Yanyu Meng, Wei Chen, Lishuxin Huang, Yuguang Du (2013) Improvement of mannitol production by Lactobacillus brevis mutant 3-A5 based on dual-stage pH control and fed-batch fermentations World J Microbiol Biotechnol., 29:1923–1930 30.Neves AR., Ramos A., Shearman C., Gasson M., Almeida JS., Santos H (2000) Metabolic characterization of Lactococcus lactis deficient in lactate dehydrogenase using in vivo 13C-NMR Eur J Biochem., 267: 3859–3868 31 Ojamo H., H Koivikko and H Heikkila (2000) Process for the production of mannitol by immobilized microorganisms PCT patent application WO 0004181 32.Onishi H and T Suzuki (1970) Microbial production of D-mannitol and DSVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 52 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội fructose from glycerol Biotechnol Bioeng., 12: 913-920 33.Ortiz ME, Fornaguera MJ, Raya RR, Mozzi F (2012) Lactobacillus reuteri CRL 1101 highly produces mannitol from sugarcane molasses as carbone source Appl Microbiol Biotechnol., 95:991-999 34.Racine FM., Saha BC (2007) Production of mannitol by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 in fed-batch and continuous cellrecycle fermentations Process Biochem., 42:1609–1613 35.Rodrı´guez C, Rimaux T, Fornaguera MJ, Vrancken G, de Valdez GF, Vuyst LD, Mozzi F (2012) Mannitol production by heterofermentative Lactobacillus reuteri CRL 1101 and Lactobacillus fermentum CRL 573 in free and controlled pH batch fermentations Appl Microbiol Biotechnol., 93:2519–2527 36.S.M Ghoreishi and R.Gholami Shahrestani (2009) Inovative strategies for engineering mannitol production Trends in Food Science and Technology, Vol.20, p.263-270 37.Saha BC (2003) Production of mannitol by fermentation In: Saha BC (ed) Fermentation biotechnology American Chemical Society, Washington, DC, pp 67– 85 38.Saha BC (2006a) A low-cost medium for mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 Appl Microbiol Biotechnol., 72:676–680 39.Saha BC (2006b) Effect of salt nutrients on mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 J Ind Microbiol Biotechnol., 33:887–890 40.Saha BC, Nakamura LK (2003) Production of mannitol and lactic acid by fermentation with Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 Biotechnol Bioeng., 82:864–871 41.Saha BC, Racine FM (2011) Biotechnological production of mannitol and its applications Appl Microbiol Biotechnol., 89:879–891 42.Saha BC., Racine FM (2010) Effects of pH and corn steep liquor variability on mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 Appl Microbiol Biotechnol., 87:553–560 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 53 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội 43.Seung Hoon Song, Claire Vieille (2009) Recent advances in the biological production of mannitol Appl Microbiol Biotechnol., 84:55-62 44.Soetaert W (1990) Production of mannitol with Leuconostoc mesenteroides Med Fac Landbouwwet Rijksuniv Gent, 55:1549–1552 45.Soetaert W., Vanhooren P.T and Vandamme E.J (1999) Production of mannitol by fermentation Methods Biotechnol 10 (Carbohydrate Biotechnology Protocols), p.261-275 46.Song KH, Lee JK, Song JY, Hon g SG, Baek H, Kim SY, Hyun HH (2002) Production of mannitol by a novel strain of Candida magnoliae Biotechnol Lett., 24:9–12 47.Vicente Monedero, Gaspar Pérez-Martínez, María J.Yebra (2010) Perspective of engineering lactic acid bacteria for biotechnological polyol production Appl Microbiol Biotechnol., Vol 86, p.1003-1015 48.von Weymarn FNW, Hujanen M, Leisola MSA (2002a) Production of D-mannitol by heterofermentative lactic acid bacteria Proc Biochem., 37:1207–1213 49.von Weymarn FNW, Kiviharju KJ, Jaaskelainen SP, Leisola MSA (2003) Scaleup of a new bacterial mannitol production process Biotechnol Prog., 19:815–821 50.Wichmann R., Wandrey C., Buckmann A.F and Kula M.R (1981) Continuous enzymatic transformation in an enzyme reactor with simultaneous NAD(H) regeneration Biotechnol Bioeng., 23:2789-2802 51.Wisselink HW, Weusthuis RA, Eggink G, Hugenholtz J, Grobben GJ (2002) Mannitol production by lactic acid bacteria: a review Int Dairy J., 12, 151–161 52.Yun JW, Kang SC, Song SK (1996b) Microbial transformation of fructose to mannitol by Lactobacillus sp KY-107 Biotechnol Lett 18:35–40 53.Yun JW, Kim DH (1998) A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria J Ferment Bioeng 85:203–208 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 54 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 MANNITOL – TÍNH CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA MANNITOL 1.1.1 Mannitol 1.1.2 Tính chất mannitol 1.1.3 Ứng dụng mannitol 1.1.3.1 Trong thực phẩm 1.1.3.2 Trong dược phẩm 1.1.3.3 Trong công nghiệp 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT MANNITOl 1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.2.2 Phương pháp sử dụng enzyme 1.2.3 Phương pháp sử dụng vi sinh vật 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP MANNITOL BẰNG VI KHUẨN LACTIC 1.3.1 Sinh tổng hợp mannitol vi khuẩn lactic đồng hình 1.3.2 Sinh tổng hợp mannitol vi khuẩn lactic dị hình 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP MANNITOL 11 1.4.1 Nguồn Cacbon 11 1.4.2 Nguồn Nitơ 12 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng khác 13 1.4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 13 1.4.3.2 Ảnh hưởng pH 13 1.4.3.3 Ảnh hưởng thời gian 14 1.4.3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất 14 1.5 VI KHUẨN LACTIC – ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỦA SINH TỔNG HỢP MANNITOL 14 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 55 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội 1.5.1 Đặc điểm vi khuẩn lactic 14 1.5.2 Nhu cầu dinh dưỡng cho phát triển vi khuẩn lactic 15 1.5.2.1 Nhu cầu Cacbon 15 1.5.2.2 Nhu cầu Nitơ 16 1.5.2.3 Nhu cầu muối khoáng 16 1.5.2.4 Nhu cầu Vitamin 17 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình trao đổi chất 17 1.5.3.1 Ảnh hưởng oxy 17 1.5.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 18 1.5.3.3 Ảnh hưởng pH 18 1.5.3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất 19 1.5.3.5 Một số ảnh hưởng khác 19 PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 NGUYÊN LIỆU 20 2.1.1 Chủng vi sinh vật 20 2.1.2 Nguyên liệu dùng nghiên cứu 20 2.1.1.1 Nguồn Cacbon 20 2.1.2.2 Nguồn nitơ 20 2.1.3 Hóa chất dùng nghiên cứu 20 2.1.4 Dụng cụ thiết bị 21 2.1.5 Các môi trường nghiên cứu 21 2.1.5.1 Môi trường bảo quản giống 21 2.1.5.2 Môi trường hoạt hóa giống 21 2.1.5.3 Môi trường nhân giống 21 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp mannitol cao 24 2.3.2 Đánh giá số đặc điểm hình thái, tính chất sinh hoá chủng vi khuẩn lactic lựa chọn 24 2.3.3 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho trình nuôi cấy nhân giống 24 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 56 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon trình lên men sinh tổng hợp mannitol chủng vi khuẩn lactic lựa chọn 25 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ trình lên men sinh tổng mannitol chủng vi khuẩn lactic lựa chọn 25 2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 25 2.4.1 Phương pháp phân tích đường khử phương pháp Graxianop 25 2.4.2 Đo mật độ quang học dịch lên men bước sóng 600nm (OD600nm) 27 2.4.3 Xác định nồng độ chất khô chiết quang kế 27 2.4.4 Xác định lượng đường Mannitol phương pháp so màu Sanchez (1998) 27 2.4.5 Xác định pH máy đo pH Orion Madel 410 (mỹ) 28 2.4.6 Đánh giá phát triển tế bào phương pháp cấy dịch pha loãng thích hợp đĩa thạch đọc khuẩn lạc 28 2.4.7 Xác định hàm lượng glucose, fructose mannitol phương pháp HPLC 28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, TÍNH CHẤT SINH HOÁ VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NHÂN GIỐNG THÍCH HỢP VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MANNITOL CAO 29 3.1.1 Đánh giá khả phát triển chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS 29 3.1.2 Đánh giá khả sinh tổng hợp mannitol chủng vi khuẩn lactic môi trường SP 30 3.1.3 Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp.HF08 32 3.1.4 Một số tính chất sinh hóa chủng Lactobacillus sp.HF08 34 3.1.5 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho trình nuôi cấy nhân giống chủng Lactobacillus sp HF08 36 3.1.5.1 Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho trình nuôi cấy nhân giống chủng vi khuẩn Lactobacillus sp HF08 36 3.1.5.2 Ảnh hưởng tỷ lệ kết hợp nguồn đường môi trường nhân giống đến phát triển chủng Lactobacillus sp HF08 37 3.1.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy nhân giống tới khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối tế bào 38 3.1.5.4 Ảnh hưởng thời gian nhân giống tới khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối chủng Lactobacillus sp.HF08 39 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 57 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.1.5.5 Ảnh hưởng pH môi trường nhân giống đến khả sinh trưởng phát triển tạo sinh khối tế bào chủng Lactobacillus sp HF08 39 3.2 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON VÀ NITƠ TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP MANNITOL BẰNG CHỦNG VI KHUẨN LACTIC ĐÃ LỰA CHỌN 40 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn chất cacbon tỷ lệ chất đến phát triển tế bào khả sinh tổng hợp mannitol 40 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng sử dụng phối hợp chất đến khả sinh tổng hợp mannitol 40 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ phối hợp chất đến trình sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol 41 3.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol 42 3.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn đường đến phát triển khả sinh tổng hợp mannitol 44 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ hữu đến phát triển tế bào khả sinh tổng hợp mannitol 45 3.2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp manniol chủng vi khuẩn lactic 45 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp mannitol 47 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 58 [...]... LUẬN TỐT NGHIỆP Vi n Đại Học Mở Hà Nội - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon trong quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ trong quá trình lên men sinh tổng mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp mannitol cao: Từ... bào bằng phương pháp cấy trên đĩa thạch 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon trong quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn: Dựa vào nguyên lý của quá trình sinh tổng hợp mannitol từ fructose và quá trình trao đổi chất ở vi khuẩn lactic, trên môi trường lên men SP, tiến hành lựa chọn nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình chuyển hoá tạo mannitol và nghiên cứu. .. nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng trong lên men nói chung và lên men sinh tổng hợp mannitol nói riêng, nó ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, sinh tổng hợp của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men mà từ đó sản lượng mannitol được sản xuất ra nhiều hay ít Falguni Patra và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men sản xuất mannitol của các chủng Leuconostoc... 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ trong quá trình lên men sinh tổng mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn: Vai trò của nguồn nitơ góp phần thúc đẩy quá trình sinh trưởng và trao đổi chất ở vi khuẩn lactic làm tăng khả năng lên men chuyển hoá tạo mannitol Trên môi trường lên men thích hợp, tiến hành lựa chọn nguồn nitơ hữu cơ thích hợp từ các nguồn: cao nấm men, cao thịt, cao ngô và casamino... phối hợp cơ chất glucose với fructose trong quá trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hoá tạo mannitol cao Từ đó nghiên cứu tỷ lệ phối hợp cơ chất cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp mannitol Kết quả nghiên cứu được đánh giá bằng hàm lượng mannitol sinh ra sau quá trình lên men và khả năng sinh trưởng được đánh giá bằng đo OD600nm dịch lên men và số lượng khuẩn lạc/ml dịch lên men cấy... dụng nguồn cơ chất kinh tế mà vẫn đạt được năng suất mannitol tinh khiết tối ưu thay thế cho con đường sản xuất tổng hợp hóa học có nhiều hạn chế 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP MANNITOL BẰNG VI KHUẨN LACTIC[ 6,7,8,12,17,15] 1.3.1 Sinh tổng hợp mannitol ở vi khuẩn lactic đồng hình Vi khuẩn lactic có hai kiểu lên men là lên men đồng hình và dị hình Trong đó lên men đồng hình là kiển lên men mà... mannitol sinh ra cũng tăng lên đáng kể, tuy nhiên nếu tăng nhiệt độ cao hơn nữa thì hàm lượng mannitol giảm xuống Một số nghiên cứu khác thì nhiệt độ thường thích hợp nhất cho quá trình lên men chuyển hoá là 370C, điều đó cho thấy hoạt tính của MDH thích hợp nhất ở 370C 1.4.3.2 Ảnh hưởng của pH: pH-một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp mannitol .Trong quá trình lên men sinh tổng hợp. .. nồng độ quá nhiều ảnh làm ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu của vi khuẩn, còn quá ít thì sản lượng sảm phẩm tạo thành không đủ tính kinh tế Vi c tìm ra một nồng độ cơ chất thích hợp là điều vô cùng cần thiết trong lên men 1.5 VI KHUẨN LACTIC – ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỦA SINH TỔNG HỢP MANNITOL 1.5.1 Đặc điểm của vi khuẩn lactic: Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacillisaceae Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương,... thiểu để vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa tối đa hoặc hoàn toàn cơ chất fructose thành manitol Tùy vào từng chủng vi khuẩn lactic mà có thời gian lên men thích hợp, khoảng từ 24-72 giờ Trong nghiên cứu, vi khuẩn lactic chúng tôi sử dụng có thời gian lên men thích hợp là 48 giờ 1.4.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic, nồng độ quá nhiều... một nguồn năng lượng trong khi fructose được sử dụng như một chất nhận electron SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Vi n Đại Học Mở Hà Nội 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP MANNITOL[ 6,8,10,38,39] 1.4.1 Nguồn Cacbon: Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho tế bào vi khuẩn lactic phát triển và sinh tổng hợp mannitol Nồng độ đường có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên