BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ GIẤM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN TRÚC VY MSSV: 3113770 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ GIẤM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN TRÚC VY MSSV: 3113770 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Huỳnh Xuân Phong Nguyễn Trúc Vy XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này, cố gắng thân có đóng góp quan trọng nhiều người, mà thiếu ủng hộ giúp đỡ tận tình thành công công việc Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến: Cô Ngô Thị Phương Dung thầy Huỳnh Xuân Phong tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện tốt hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang cô Nguyễn Thị Liên – cố vấn học tập, người bảo giúp đỡ suốt thời gian học đại học Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh anh B i Hoàng Đăng Long - c n phòng thí nghiệm CNSH Thực ph m, qu Thầy Cô anh chị c n c c phòng thí nghiệm Viện NC PT CNSH h tr , đóng góp kiến tạo điều kiện thuận l i để thực tốt đề tài luận văn Xin đư c gửi lời c m ơn chân thành đến tất c c qu Thầy Cô tận tình truyền dạy cho kiến th c h u ích để ph c v đề tài Xin chân thành cảm ơn c c anh chị học viên cao học, c c bạn sinh viên phòng thí nghiệm CNSH Thực ph m nhiệt tình giúp đỡ qu trình thực đề tài Cuối c ng xin bày t lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình người thân động viên, khích lệ ủng hộ m t vật chất c ng tinh thần suốt thời gian qua để v ng tin thực đề tài Tôi xin kính chúc đến qu Thầy Cô c ng c c bạn sinh viên dồi s c kh , công t c tốt Nguyễn Trúc Vy Chuyên ngành Vi Sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt vi sinh vật quan tâm chúng có khả lên men điều kiện nhiệt độ cao giúp tăng hiệu suất trình lên men giảm chi phí điều nhiệt Mục tiêu đề tài phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt độ cao từ nguồn nguyên liệu giấm ăn Giấm ăn chất lỏng có chứa thành phần acid acetic, sản phẩm lên men vi khuẩn acid acetic Tổng cộng thu 15 mẫu giấm ăn, kết phân lập 27 chủng vi khuẩn acid acetic Kết phân loại 27 chủng, giống Acetobacter 24 chủng chủng thuộc giống Gluconobacter Sơ tuyển chủng (BD1.1, BD1.3, CTI2.3, ĐTIII1, KG1, ST1.1, ST1.2 ST2.2) có khả sinh acid mạnh (đường kính vòng phân giải >20 mm) Về khả chịu acid acetic, tất chủng phát triển 0,5%, 1% có chủng phát triển được, 1,5 % có chủng (BD1.1 ST1.1), 2% chủng (ST1.1) Thử nghiệm khả chịu nhiệt, 30oC 37oC, tất chủng phân lập phát triển tốt, nhiệt độ tăng, khả phát triển chủng giảm Ở 43oC, có chủng phát triển (BD1.1, BD1.3, CTI2.3, ĐTIII1, KG1, ST1.1, ST1.2 ST2.2) 45oC, chủng ĐTIII1 ST2.2 phát triển tốt Kết quả, tuyển chọn chủng để tiếp tục thử nghiệm khả lên men acid acetic nhiệt độ khác (30oC, 37oC, 38oC 39oC) Khi lên men môi trường YPGD bổ sung 4% ethanol cho thấy dòng KG1 ST2.2 phát triển sinh acid tốt so với chủng lại Nồng độ acid lên men 37, 38 39oC đạt 0,6% w/v, 1,8% w/v 2,16% w/v chủng KG1 0,84% w/v, 4,84% w/v 5,04% w/v chủng ST2.2 Kết quả, tuyển chọn chủng AAB KG1 ST2.2 có khả chịu nhiệt tốt so với dòng phân lập Từ khóa: Acetobacter, chịu nhiệt, giấm, Gluconobacter, lên m n acid ac tic, vi khu n acid acetic Chuyên ngành Vi Sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM LƯỢC ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH .vi CÁC TỪ VIẾT TẮT vii 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Quá trình lên men từ Vi sinh vật 2.1.1 Bản chất qu trình lên m n từ vi sinh vật 2.1.2 C c yếu tố ảnh hưởng đến qu trình lên men 2.2 Sơ l c giấm ăn 2.2.1 Giấm ăn 2.2.2 Quy trình lên m n giấm 2.3 Acid acetic 2.3.1 Giới thiệu chung acid ac tic 2.3.2 Bản chất qu trình lên m n acid ac tic 2.3.3 Cơ chế phản ng qu trình lên m n acid ac tic 2.3.4 C c yếu tố ảnh hưởng đến qu n trình lên m n acid ac tic 10 2.4 Vi khuẩn acid acetic 11 2.4.1 Đ c điểm vi khu n acid ac tic 11 2.4.2 Một số loài vi khu n acid ac tic nghĩa 12 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Ph ơng tiện nghiên cứu 15 3.1.1 Thời gian địa điểm 15 3.1.2 Nguyên liệu 15 3.1.3 Thiết bị - d ng c hóa chất 15 3.2 Ph ơng pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Phân lập c c chủng vi khu n acid ac tic 16 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2 X c định hình th i, sinh l , sinh hóa c c chủng vi khu n acid ac tic 16 3.2.3 Sơ tuyển c c chủng vi khu n có khả sinh acid ac tic 18 3.2.4 Khảo s t khả chịu acid ac tic AAB 18 3.2.5 Khảo s t khả chịu nhiệt vi khu n acid ac tic 19 3.2.6 Tuyển chọn vi khu n acid ac tic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 19 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn acid acetic 20 4.2 Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn acid acetic 21 4.2.1 X c định hình th i 22 4.2.2 X c định sinh l , sinh hóa 24 4.2.3 Phân loại 25 4.3 Sơ tuyển chủng vi khuẩn có khả sinh acid acetic 26 4.4 Khảo sát khả chịu acid acetic chủng acid acetic 29 4.5 Khảo sát khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 30 4.6 Tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 32 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ VÀ KẾT LUẬN 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC Chuyên ngành Vi Sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng Nh ng đ c điểm kh c biệt gi a c c loài Acetobacter 14 Bảng Kết phân lập vi khu n acid ac tic (AAB) 21 Bảng Hình dạng, kích thước khu n lạc tế bào vi khu n 22 Bảng Đ c điểm sinh l , sinh hóa c c chủng AAB 24 Bảng Kết phân loại đường kính v ng s ng vàng AAB 27 Bảng Kết phân loại đường kính v ng s ng vàng AAB đư c lựa chọn 28 Bảng Kết khả sinh acid ac tic c c nồng độ acid ac tic kh c 30 Bảng Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt c c chủng AAB 32 Bảng PL1 Kết thống kê hàm lư ng acid (% w/v) lên m n 30o C PL2 Bảng PL2 Kết thống kê hàm lư ng acid (% w/v) lên m n 37 o C PL6 Bảng PL3 Kết thống kê hàm lư ng acid (% w/v) lên m n 38 o C PL10 Bảng PL4 Kết thống kê hàm lư ng acid (% w/v) lên m n 39o C PL13 Bảng PL5 Mô tả khu n lạc hình dạng vi khu n c c chủng AAB PL16 Bảng PL6 X c định sinh l , sinh hóa c c chủng AAB PL17 Bảng PL7 Phân loại sơ tuyển chủng AAB có khả sinh acid PL18 Bảng PL8 Kết thí nghiệm khả chịu acid ac tic PL19 Bảng PL9 Thử nghiệm khả chịu nhiệt c c chủng AAB PL20 Bảng PL10 Mật số (OD550nm) chủng AAB lên m n ngày nhiệt độ 30oC, 37oC, 38oC 39oC PL21 Bảng PL11 Hàm lư ng acid hình thành chủng AAB c c nhiệt độ 30OC, 37oC, 38oC 39oC PL22 Chuyên ngành Vi Sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình Qu trình oxy ho rư u thành acid ac tic Hình Acetobacter aceti 13 Hình Acetobacter xylinum 13 Hình Khu n lạc tạo vòng halo môi trường (a b), môi trường đối ch ng có CaCO3 (c) CaCO3 (d) 20 Hình Biến đổi môi trường thị (a b) 26 Hình Biến đổi môi trường chất thị (a b), môi trường đối ch ng (c) 26 Hình Sự ph t triển c c chủng vi khu n môi trường YPGD bổ sung 1,0% acid ac tic (a, b, c, d ) 29 Hình Sự ph t triển c c chủng vi khu n môi trường YPGD bổ sung 1,5% 2,0% acid acetic 29 Hình Sự ph t triển c c chủng vi khu n môi trường YPGD c c nhiệt độ kh c 31 Hình 10 Sự ph t triển chủng AAB 30oC 34 Hình 11 Hàm lư ng acid sinh chủng AAB 30oC 34 Hình 12 Sự ph t triển chủng AAB 37oC 35 Hình 13 Hàm lư ng acid sinh chủng AAB 37oC 36 Hình 14 Sự ph t triển chủng AAB 38oC 37 Hình 15 Hàm lư ng acid sinh chủng AAB 38oC 37 Hình 16 Sự ph t triển chủng AAB 39oC 38 Hình 17 Hàm lư ng acid sinh chủng AAB 39oC 39 Chuyên ngành Vi Sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CÁC TỪ VIẾT TẮT A Acetobacter AAB Acetic Acid Bacteria et al Et alia G Gluconobacter NADH Nicotinamide adenin dinucleotide photphate PL Ph l c YPGD Yeast Polypepton Glycerol D-Glucose Chuyên ngành Vi Sinh vật học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Bảng PL3 Kết thống kê hàm l ng acid (% w/v) lên men 38 oC Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.0036 0.0384 0.042 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.0012 0.25 0.0048 P-Value 0.8592 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 0.04 KG1 0.04 CTI2.3 0.04 ST2.2 0.08 Homogeneous Groups X X X X SD=0,0617914 CV=123,583% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.0036 0.0096 0.0132 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.0012 1.00 0.0012 P-Value 0.4411 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 0.08 KG1 0.12 ST2.2 0.12 CTI2.3 0.12 Homogeneous Groups X X X X SD=0,034641 CV=31,4918% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.0864 0.0096 0.096 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.0288 24.00 0.0012 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean CTI2.3 0.12 BD1.3 0.12 ST2.2 0.24 KG1 0.32 Homogeneous Groups X X X X SD=0,0934199 CV=46,7099% PL10 P-Value 0.0002 Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.1728 0.0096 0.1824 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.0576 48.00 0.0012 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 0.16 CTI2.3 0.24 ST2.2 0.24 KG1 0.48 Homogeneous Groups X X X X SD=0,12877 45,9894% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.2736 0.0384 0.312 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.0912 19.00 0.0048 P-Value 0.0005 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 0.2 CTI2.3 0.2 KG1 0.4 ST2.2 0.56 Homogeneous Groups X X X X SD=0,168415 49,5338% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1.194 0.048 1.242 Df 11 Mean Square F-Ratio 0.398 66.33 0.006 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean CTI2.3 0.16 BD1.3 0.48 KG1 0.6 ST2.2 1.04 Homogeneous Groups X X X X SD=0,336019 CV=58,9508% PL11 P-Value 0.0000 Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 19.5216 0.3072 19.8288 Df 11 Mean Square F-Ratio 6.5072 169.46 0.0384 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean CTI2.3 0.24 BD1.3 0.4 KG1 1.44 ST2.2 3.44 Homogeneous Groups X X X X SD=1,34262 CV=97,291% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 37.8528 0.0192 37.872 Df 11 Mean Square F-Ratio 12.6176 5257.33 0.0024 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK Count Mean CTI2.3 0.24 BD1.3 0.8 KG1 1.8 ST2.2 4.84 Homogeneous Groups X X X X SD=1,85551 CV=96,641% PL12 P-Value 0.0000 Bảng PL4 Kết thống kê hàm l ng acid (% w/v) lên men 39oC Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,0036 ,0096 ,0132 Df 11 Mean Square F-Ratio ,0012 1,00 ,0012 P-Value ,4411 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,0 KG1 ,0 CTI2.3 ,0 ST2.2 ,04 Homogeneous Groups X X X X SD=0,034641 346,41% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,0324 ,0 ,0324 Df 11 Mean Square F-Ratio ,0108 **************** ,0 P-Value , Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,24 KG1 ,24 CTI2.3 ,24 ST2.2 ,36 Homogeneous Groups X X X X SD=0,054272 CV=20,1008% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,042 ,0192 ,0612 Df 11 Mean Square F-Ratio ,014 5,83 ,0024 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,24 CTI2.3 ,32 KG1 ,36 ST2.2 ,4 Homogeneous Groups X XX X X SD=0,0745898 CV=22,603% PL13 P-Value , 206 Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,144 ,0096 ,1536 Df 11 Mean Square F-Ratio ,048 40,00 ,0012 P-Value , Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,24 KG1 ,36 CTI2.3 ,48 ST2.2 ,52 Homogeneous Groups X X X X SD=0,118168 CV=29,542% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,48 ,0192 ,4992 Df 11 Mean Square F-Ratio ,16 66,67 ,0024 P-Value , Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,16 KG1 ,4 CTI2.3 ,48 ST2.2 ,72 Homogeneous Groups X X X X SD=0,21303 CV=48,4159% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares ,5028 ,0192 ,522 Df 11 Mean Square F-Ratio ,1676 69,83 ,0024 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,28 CTI2.3 ,48 ST2.2 ,72 KG1 ,8 Homogeneous Groups X X X X SD=0,217841 CV=38,2177% PL14 P-Value , Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 4,2864 ,0288 4,3152 Df 11 Mean Square F-Ratio 1,4288 396,89 ,0036 P-Value , Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,36 CTI2.3 ,44 ST2.2 1,36 KG1 1,76 Homogeneous Groups X X X X SD=0,626331 CV=63,9114% Ngay ANOVA Table for Ham luong acid by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 44,346 ,1344 44,4804 Df 11 Mean Square F-Ratio 14,782 879,88 ,0168 Multiple Range Tests for Ham luong acid by Dong VK Method: 95,0 percent LSD Dong VK Count Mean BD1.3 ,28 CTI2.3 ,4 KG1 2,16 ST2.2 5,04 Homogeneous Groups X X X X SD=2,01089 CV=102,076% PL15 P-Value , PHỤ LỤC 3: CÁC BẢNG SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM Bảng PL5 Mô tả khuẩn lạc hình dạng vi khuẩn chủng AAB STT Chủng AAB Hình dạng vi khuẩn Mô tả khuẩn lạc BD1.2 Cầu Trắng đ c, nguyên, tròn, nổi, 1mm BD2.1 Que Trắng đ c, nguyên, nổi, tròn, 1mm BD2.2 Que Vàng đ c, nguyên, nổi, tròn, 0,8mm BLI2.1 Qu ngắn kết đôi Trắng đ c, nguyên, tròn, nổi, 1mm BLI2.2 Qu ngắn Trắng đ c, lài, nguyên, tròn, 0,3mm BTI2.1 Qu ngắn kết đôi Vàng đ c, nguyên, nổi, tròn, 0,5mm CTI2.2 Qu ngắn Trắng đ c, lài, nguyên, tròn, 0,2mm CTII1 Que Trắng đ c, nổi, nguyên, tròn, 1mm CTII2.2 Qu dài Vàng đ c, nguyên, nổi, tròn, 0,2mm 10 ĐTI1.2 Qu ngắn kết đôi Trắng đ c, lài, nguyên, tròn, 0,2mm 11 ĐTI2.2 Cầu Trắng đ c, lài, cưa, 1mm 12 ĐTII1 Que Trắng đ c, nổi, nguyên, tròn, 0,5mm 13 ST2.1 Cầu Trắng đ c, nguyên, nổi, tròn, 0,5mm 14 TBI2 Que Trắng đ c, lài, nguyên, tròn, 1mm 15 TBIII2.2 Qu ngắn kết đôi Màu vàng, tròn, nổi, nguyên, 0,8mm 16 VTI2.1 Cầu Trắng đ c, lài, nguyên, tròn, 0,5mm 17 VTI2.2 Cầu Trắng đ c, tròn, nổi, o,4mm, nguyên 18 VTII2 Que Trắng đ c, nổi, nguyên, tròn, 0,5mm PL16 Bảng PL6 Xác định sinh lý, sinh hóa chủng AAB STT Chủng AAB Catalase Oxydase BD1.2 + - BD2.1 + - BD2.2 + - BLI2.1 + - BLI2.2 + - BTI2.1 + - CTI2.2 - - CTII1 + - CTII2.2 + - 10 ĐTI1.2 + - 11 ĐTI2.1 + - 12 ĐTI2.2 + - 13 ĐTII1 + - 14 ST2.1 + - 15 TBI2 - - 16 TBIII2.2 + - 17 VTI2.1 + - 18 VTI2.2 + - 19 VTII2 + - PL17 Bảng PL7 Phân loại sơ tuyển chủng AAB có khả sinh acid Vùng sang (mm) AAB STT Chủng AAB A G 48 72 BD1.2 X 10 10 BD2.1 X BD2.2 X 6 BLI2.1 X 10 BLI2.2 X 5 BTI2.1 X 15 CTI2.2 X CTII1 X 9 CTII2.2 X 11 11 10 ĐTI1.2 X 11 ĐTI2.2 X 8 12 ĐTII1 X 13 13 ST2.1 X 14 TBI2 13 14 15 TBIII2.2 X 15 15 16 VTI2.1 X 11 17 VTI2.2 X 10 10 18 VTII2 X X PL18 Bảng PL8 Kết thí nghiệm khả chịu acid acetic 48h Chủng 72h 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% BD1.2 + - - - - - + - - - - - BD2.1 ++ + - - - - ++ + - - - - BD2.2 + - - - - - + - - - - - BL1 + - - - - - + - - - - - BL2 + - - - - - + - - - - - BT2 + - - - - - + - - - - - CTI2.2 + - - - - - + - - - - - CTII1 + - - - - - + - - - - - CTII2 + - - - - - + - - - - - ĐT1.2 + - - - - - + - - - - - ĐT2.1 + - - - - - + - - - - - ĐT2.2 + - - - - - + - - - - - ĐTII1 + - - - - - + - - - - - ST2.1 + - - - - - + - - - - - TBI2 ++ + - - - - ++ + - - - - TBII2 + - - - - - + - - - - - VTI2.1 + - - - - - + - - - - - VTI2.2 + - - - - - + - - - - - VTII2 + - - - - - + - - - - - Ghi chú: Gi trị bảng gi trị lần l p lại (-) không ph t triển; (+) ph t triển; (++) ph t triển tốt PL19 Bảng PL9 Thử nghiệm khả chịu nhiệt chủng AAB 48h Chủng 72h 37oC 39oC 41oC 43oC 45oC 37oC 39oC 41oC 43oC 45oC BD1.2 + + - - - + + + + - BD2.1 ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ ++ - BD2.2 + + - - - + + + - - BL1 + + + - - + + + + - BL2 + + - + - + + - + - BT2 + + + + - + + + + - CTI2.2 + + + - - + + + - - CTII1 + + + + - + + + + - CTII2 ++ ++ + - - ++ ++ + - - ĐT1.2 ++ + - - - ++ + - - - ĐT2.1 + + - + - + + + + - ĐT2.2 + + + - - + + + + - ĐTII1 ++ ++ + - - ++ ++ + - - ST2.1 ++ ++ ++ - - ++ ++ ++ - - TBI2 ++ ++ + + - ++ ++ + + - TBII2 + - - - - + - - - - VTI2.1 + + + + - + + + + - VTI2.2 ++ + + - - ++ + + - - VTII2 ++ ++ + - - ++ ++ + - - Ghi chú: Gi trị bảng gi trị lần l p lại (-) không ph t triển; (+) ph t triển; (++) ph t triển tốt PL20 Bảng PL10 Mật số (OD550nm) chủng AAB lên men ngày nhiệt độ 30oC, 37oC, 38oC 39oC Nhiệt độ 30oC 37oC 38oC 39oC Chủng BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 Ngày 0,025 0,072 0,019 0,066 0,016 0,080 0,027 0,026 0,059 0,075 0,053 0,087 0,123 0,116 0,112 0,072 0,265 0,270 0,262 0,240 0,263 0,268 0,253 0,257 0,205 0,203 0,223 0,202 0,179 0,205 0,211 0,195 0,805 0,802 0,842 0,294 0,608 0,789 0,473 1,255 1,740 1,674 1,523 1,878 1,428 1,765 1,202 1,010 0,925 0,881 1,020 0,956 0,734 1,112 0,580 0,900 0,229 0,372 1,317 0,402 0,343 0,312 0,328 0,886 1,344 1,329 1,320 0,345 1,257 0,699 1,795 1,563 1,884 1,754 1,658 2,264 1,735 1,861 1,310 1,253 1,145 0,939 1,344 1,168 1,144 1,315 0,804 1,110 0,219 0,392 1,721 0,409 0,590 0,328 1,339 0,774 PL21 1,546 1,714 1,971 0,908 1,681 1,802 2,010 1,814 2,069 1,864 1,775 1,126 1,954 1,827 1,676 1,746 1,633 1,643 1,387 1,516 1,339 2,057 0,833 1,952 0,216 0,655 1,774 0,415 0,634 0,302 1,615 0,745 1,848 1,843 1,990 1,746 1,904 1,509 2,083 1,758 2,030 1,985 2,237 2,321 2,132 2,381 2,176 2,480 1,703 1,852 1,399 1,248 1,339 1,983 0,829 2,030 0,226 0,761 1,757 0,403 0,742 0,311 1,652 0,771 2,074 1,508 2,305 2,155 2,242 1,593 2,286 1,912 1,977 2,107 2,107 2,194 2,117 2,452 2,136 2,347 1,716 1,871 2,034 2,093 1,406 1,995 1,264 2,012 0,225 0,736 1,749 0,387 0,794 0,282 1,646 0,823 1,998 1,814 2,091 2,113 2,105 0,786 2,113 1,744 2,145 2,241 2,261 2,311 2,195 2,343 2,353 2,420 1,718 1,940 1,939 2,039 1,405 1,993 1,314 2,094 0,249 0,784 1,742 0,447 0,876 0,305 1,666 0,984 1,987 1,692 1,889 2,110 1,871 0,760 2,001 1,740 1,838 2,006 2,077 2,298 1,754 1,553 1,993 2,130 1,605 1,852 1,920 2,011 1,418 1,985 1,476 2,126 0,455 0,828 1,758 0,454 0,908 0,306 1,701 1,593 Bảng PL11 Hàm l ng acid hình thành chủng AAB nhiệt độ 30OC, 37OC, 38OC 39OC Nhiệt độ 30oC 37oC 38oC 39oC Chủng BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 BD1.1 BD1.3 CTI2.3 ĐTIII1 KGI1 STI1.1 STI1.2 STI2.2 Ngày 0 0 0 0 0 0,08 0,04 0,04 0 0,04 0,04 0,04 0,04 0 0,08 0,00 0,00 0,00 0 0,04 0,36 0,36 0,12 0,12 0,36 0,12 0,12 0,12 0,24 0,60 0,72 0,48 0,60 0,24 0,60 0,60 0,04 0,08 0,12 0,08 0,12 0,04 0,12 0,12 0,12 0,24 0,24 0,24 0,24 0,16 0,16 0,36 0,72 0,60 0,84 0,60 0,60 0,60 0,48 0,24 0,48 0,48 0,24 0,24 0,24 0,36 0,72 0,72 0,12 0,12 0,12 0,12 0,32 0,12 0,12 0,24 0,24 0,24 0,32 0,24 0,36 0,24 0,2 0,4 PL22 0,48 0,36 0,60 0,60 0,48 0,24 0,36 0,24 0,12 0,24 0,16 0,12 0,12 0,48 0,08 0,24 0,20 0,16 0,24 0,12 0,48 0,48 0,12 0,24 0,16 0,24 0,48 0,24 0,36 0,24 0,24 0,52 0,24 0,12 0,24 0,24 0,24 0,20 0,20 0,36 0,44 0,80 0,24 0,20 0,32 0,40 0,80 0,84 0,28 0,20 0,20 0,12 0,40 0,36 0,12 0,56 0,12 0,16 0,48 0,20 0,40 0,16 0,20 0,72 0,96 1,04 1,16 0,32 0,92 1,52 0,24 1,04 0,28 0,32 0,16 0,24 0,32 0,32 0,24 0,28 0,28 0,48 0,16 0,32 0,60 0,36 0,16 1,04 0,24 0,28 0,48 0,24 0,80 0,24 0,24 0,72 0,20 0,36 1,56 0,48 1,32 0,68 0,88 0,44 0,12 0,20 0,12 0,20 0,12 0,20 0,12 0,16 0,32 0,40 0,24 0,28 1,44 0,40 0,24 3,44 0,24 0,36 0,44 0,24 1,76 0,24 0,24 1,36 0,36 0,36 0,72 0,36 0,48 0,32 0,40 0,40 0,12 0,20 0,08 0,12 0,12 0,12 0,20 0,12 0,36 0,80 0,24 0,32 1,80 0,48 0,32 4,84 0,20 0,28 0,40 0,20 2,16 0,24 0,24 5,04 PHỤ LỤC 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Ph ơng pháp theo dõi tiêu * C ch chu n độ acid tổng số: Chu n bị hóa chất - Dung dịch NaOH 0,8N: cân 4g NaOH khan cho vào 125ml nước cất, hòa tan gi chai thủy tinh có nút mài - Dung dịch chị ph noltaphl in: cân x c 40mg ph noltaphl in cho vào 25ml thanol 70% Gi chai nút thủy tinh có nút kín C ch thực - Lấy 1mL dịch lên m n cho vào ống nghiệm 10mL - Cho vào 10µl dung dịch ph noltaphl in lắc - D ng pip t cho vào lần lư t m i lần 25µl dung dịch NaOH 0,8N, lắc đến có màu hồng nhạt bền khoảng phút Ghi nhận số lần thêm 25µl dung dịch NaOH 0,8N Lư ng acid đư c tính công th c (% w/v): 0,12 x (n-1); n số lần thêm 25µl dung dịch NaOH 0,8N * Mật số vi khu n Lấy 2mL dung dịch nuôi vi khu n m i bình tam gi c Đo OD 550nm, ghi nhận so s nh số liệu phản nh đọ đ c dịch nuôi vi khu n tỷ lệ thuận với mật số vi khu n ph triển làm đ c môi trường Thử nghiệm Catalase C c vi sinh vật hiếu khí kỵ khí t y ch a chu i dẫn truyền điện tử có cytochrom có nzym catalas (trừ Streptococcus spp) Enzym c c thành viên hệ thống c c nzym bảo tế bào kh i c c tổn thương c c dẫn xuất đọc tính cao oxy phân tử tế bào hiếu khí vi hiếu khí C c vi sinh vật có khả biến dưỡng lư ng thành lư ng th o phương th c hô hấp với oxy chất nhận điện tử cuối c ng chu i dẫn truyền điện tử tạo H 2O2 Catalas thủy phân hydrog n p roxid (H2O2) thành H2O O2, ngăn cản tích t phân tử có độc tính cao tế bào Tuy nhiên, catalas , nhiều nzym oxydas kh c hệ thống c c nzym bảo vệ tế bào kh i str ss oxy hóa c ng có khả thủy phân hydrog n p roxid C c nzym c ng diện c c tế bào, PL23 vi sinh vật hiếu khí vi hiếu khí có khả biến dưỡng lư ng th o phương th c hô hấp hiếu Sự thủy phân hydrog n p roxid giải phóng O đư c ghi nhận qua tư ng sủi bọt khí PL24 [...]... quả,…) và số lư ng mẫu giấm đư c phân lập còn hạn chế Do đó chúng tôi đề Chuyên ngành Vi Sinh vật học 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ nghị đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ giấm , với m c tiêu sẽ sưu tập đư c một số chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt có khả năng lên m n acid ac tic tốt, góp phần bổ sung vào... giống vi sinh vật bản địa có đ c tính tốt Qua đó có thể tiến tới một quy trình sản xuất giấm hoàn chỉnh hơn và c c sản ph n lên m n từ AAB mang lại hiệu quả kinh tế cao 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm m c tiêu phân lập và tuyển chọn đư c c c chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt từ giấm ăn có khả năng lên m n ac tic Nội dung thực hiện: - Phân lập và tuyển chọn chủng vi khu n có khả năng sinh acid acetic. .. lạnh tiêu tốn kh nhiều năng lư ng ở vi c gi nhiệt độ Vì vậy, vi c phân lập và tuyển chọn đư c nh ng chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên c u Và như chúng ta đã biết thì acid ac tic là thành phần chủ yếu của giấm, nhưng nh ng nghiên c u gần đây cho thấy (Huỳnh Xuân Phong, 2011 và Đ ng Thị Th y Vân, 2009) AAB đư c phân lập từ nhiều nguồn kh c nhau (sản ph n lên... khả năng sinh acid acetic - X c định hình th i, sinh l , sinh hóa của vi khu n - Tuyển chọn c c chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt, sinh acid mạnh - Khảo s t khả năng chịu acid ac tic của AAB - Khảo s t khả năng lên m n ở c c m c nhiệt độ kh c nhau của c c chủng vi khu n acid acetic đư c tuyển chọn Chuyên ngành Vi Sinh vật học 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014... acid ac tic bởi vi khu n acid acetic Vi khu n Acetobacter là t c nhân chính trong qu trình lên m n acid acetic, m i thơm đ c trưng, màu trắng đ c ho c hơi vàng, giấm có pH từ 2,4-3,4, chủ yếu là acid acetic, ngoài ra còn ch a một ít đường, prot in,… Giấm ăn là một chất l ng có vị chua ch a 3% acid ac tic, đư c hình thành từ sự lên m n của ethanol (C2H5OH) Từ xưa, giấm đã là một nhân tố quan trọng và. .. THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic M c đích là thu thập đư c c c chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt từ giấm ăn sản ph m có ch a thành phần acid ac tic cao, đã thu đư c 15 mẫu ở một số nơi để làm nguồn phân lập Từ dung dịch nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung 4% thanol và đư c tiếp t c cấy lên môi trường thạch YPGD + 2% agar, bổ sung 4% thanol và 0,5% CaCO3 Sau... c và màu vàng - Hình dạng vi khu n: hình cầu, hình qu ngắn, hình qu kết đôi ho c chu i 4.2.1 Xác định hình thái Bảng 3 Hình dạng, kích th ớc khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn STT Chủng phân lập Hình dạng khuẩn lạc Tròn, mô, 1 BD1.1 nguyên, trắng đ c Tròn, mô, 2 BD1.3 nguyên, màu Hình dạng vi khuẩn Hình ảnh tế bào vi khuẩn d ới kính hiển vi Qu ngắn, kết đôi Qu ngắn vàng Tròn, mô, 3 CTI2.3 nguyên, màu vàng... bromocresol green 0,01%) đã chu n bị và ủ ở 30oC - Đo so s nh vòng màu vàng sinh ra xung quanh AAB sau 24 và 48 giờ C c nghiệm th c đư c thực hiện 3 lần để lấy gi trị trung bình C c chủng có khả năng sinh acid mạnh sẽ đư c lựa chọn để thử khả năng chịu nhiệt 3.2.4 Khảo sát khả năng chịu acid acetic của AAB Mục tiêu: Khảo s t khả năng chịu acid acetic của c c chủng AAB đã đư c phân lập Phương pháp tiến hành:... chính nhờ qu trình lên m n của vi khu n acid acetic Thành phần dinh dưỡng bao gồm đường, acid acetic, acid h u cơ, vitamin và muối vô cơ,… rất tốt cho vi c tiêu hóa của cơ thể T y th o v ng nguyên liệu ở m i nước kh c nhau sẽ cho ra c c loại giấm mang hương vị đ c trưng từng v ng miền Giấm pha chế hay còn gọi là giấm hóa học đư c sản xuất dựa trên nguyên liệu chính là acid acetic tinh luyện, pha thêm... u thì vi khu n tiếp t c oxy hóa acid ac tic để tiếp t c thu năng lư ng d ng trong sự sống, vì thế đây là một qu trình có hại Trong sản xuất người ta thường để lại trong môi trường sau lên m n độ rư u 0,30,5% Dir s (1973) cho rằng lư ng rư u sót trong giấm có t c d ng c chế sự tổng h p nzym oxy hóa acid ac tic và muối ac tate 2.4 Vi khuẩn acid acetic 2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn acid acetic Vi khu n acid