LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình dìu dắt, hướng dẫn bảo suốt thời gian học tâp nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên góp ý giúp đỡ suốt thời gian học tập hoàn thành Luận văn Đồng thời xin cảm ơn anh chị, bạn em Phòng Hóa sinh Vi sinh môi trường nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực Luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người tạo điều kiện vật chất tinh thần giúp đỡ hoàn thành tốt Luâṇ văn Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Quỳnh Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ 11 1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản giới : 111 1.3 Những khó khăn thách thức nghề 12 1.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản :14 1.4.1 Nhiê ̣t đô ̣ 15 1.4.2 Độ pH 15 1.4.3 Độ mặn 16 1.4.4 Oxy hòa tan (DO) 16 1.4.5 COD, BOD 17 1.4.6 Mâ ̣t đô ̣ vi tảo Vibrio spp và vi khuẩn tổng số 17 1.4.7 Nitơ tổng số 18 1.4.8 Photphat (PO43- ) 20 1.4.9 Sulphuahydro 20 1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản 21 1.5.1 Vai trò của các vi sinh vật quá trình làm s ạch nướ c nuôi tôm, cá 21 1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó việc c ải tạo nước đầm nuôi trồng thủy sản 24 1.5.3 Ưu điểm và nhươ ̣c điểm của biê ̣n phấp sử du ̣ng vi sinh vâ ̣t xử lý nước nuôi trồng thủy sản ……… ……… ……… ……… …… ……………….…… …… 31 Chƣơng – ĐỐI TƢ ỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 322 2.1 Đối tượng 32 2.1.1 Chủng giống 32 2.1.2 Hóa chất – thiết bi 32 ̣ 2.1.3 Môi trường 32 2.2 Phương pháp nghiên c ứu 35 2.2.1 Phương pháp phân l ập vi khuẩn 35 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 35 2.2.3 Phương pháp xác đị nh ho ạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn 35 2.2.4 Xác định sinh khối phương pháp đo m ật độ quang học 36 2.2.5 Phương pháp định lượng axit lactic 36 2.2.6 Phương pháp nghiên c ứu khả chuyển hóa các hợ p chất chứa nitơ của tế bào 36 2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng của vi sinh vật 38 2.2.8 Phương pháp xác đị nh một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọ n 39 2.3 Phương pháp ta ̣o chế phẩm 43 2.3.1 Nghiên cứu các điều kiê ṇ thić h hơ ̣p cho lên men xốp 43 2.3.2 Trô ̣n hỗn hơ ̣p giống 41 2.3.3 Bảo quản chế phẩm : 41 2.3.4 Thử nghiê ̣m chế phẩm xử lý nước nuôi trồng thủy sản 41 2.4 Phân lo ại vi sinh vật 42 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUÂṆ 45 3.1 Tuyển cho ̣n các chủng vi sinh vâ ̣t 45 3.1.1 Bacillus 45 3.1.1.1 Phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n 45 3.1.1.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợ p lên khả sinh trưở ng và hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1 46 3.1.1.3 Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu 51 3.1.2 Vi khuẩn Lactic 53 3.1.2.1 Phân l ập và tuyển chọn 53 3.1.2.2 Phân lo ại 53 3.1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợ p chất kháng khuẩn của L plantarum L5 56 3.1.3 Vi khuẩn nitrat hóa 60 3.1.3.1 Phân l ập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 60 3.1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn 62 3.2 Tạo chế phẩm 63 3.2.1 Thử tiń h đối kháng lâñ của các chủng vi khuẩn 63 3.2.2 Nghiên cứu các điều kiê ṇ lên men xốp thích hơ ̣p 64 3.2.2.1 Lưạ cho ̣n môi trường lên men xốp thić h hơ ̣p 64 3.2.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên quá triǹ h lên men xốp 66 3.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp 67 3.2.2.4 Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác 68 3.2.2.5 Ảnh hưởng của độ ẩm 69 3.2.3 Sản xuất chế phẩm 70 3.2.4 Đánh giá khả làm sa ̣ch nước đầm nuôi thủy sản của chế phẩm vừa ta ̣o đươ ̣c 72 3.2.4.1 Giá trị pH 72 3.2.4.2 Ni tơ tổng số 73 3.2.4.3 Amôni 74 3.2.4.4 Nitrit 75 3.2.4.5 COD và BOD 76 KẾT LUẬN 79 KIẾN NGHI ̣ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC 87 DANH MUC̣ KỴ́ HIÊU VÀ CHƢƢ VIẾT TẮT BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa hóa ho c̣ DO Dessolved Oxygen Oxy hòa tan OD Optical Density Mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c QCVN WHO Quy chuẩn Viêṭ Nam World Heath Organi zation Tổ chƣƣc Y tế thế gi ới DANH MUC̣ CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá 15 Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lươ ṇ g nước nuôi trồng thủy sản 21 Bảng 3.1: Ho ạt tính enzym của chủng lựa chọn 45 Bảng 3.2: Ho ạt tính phân giải chất của chủng TL1 loại môi trường 46 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 47 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả sinh trưởng và sinh tổng hợp .48 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 49 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 50 Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu 51 Bảng 3.8: Ho ạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 53 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5 53 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi c ấy đến sinh trưởng và khả tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59 Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân l ập được 60 Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được 61 Bảng 3.15: Hàm l ượng nitrit tạo thành và sinh trưởng của 13 chủng oxy hóa amôni phân lập được 61 Bảng 3.16: Hàm l ượng nitrat t ạo thành và sinh trưởng của 10 chủng oxy hóa nitrit 62 Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 62 Bảng 3.18: Thử tiń h đối kháng lâñ của các chủng vi khuẩn 64 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của môi trường lên men xốp lên Bacillus 65 Bảng 3.20 : Ảnh hưởng của môi trường lên me n xốp lên L plantarum L5: 65 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên Bacillus TL1 66 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên L plantarum L5 67 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1 67 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên L plantarum L5 67 Bảng 3.25: Ảnh hưở ng của nhiê ̣t đô ̣ lên Bacillus TL1 68 Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên L plantarum L5 69 Bảng 3.27: ảnh hưởng của độ ẩm lên Bacillus TL1 69 Bảng 3.28: Ảnh hưởng của độ ẩm lên L plantarum L5 70 Bảng 3.29: Kết quả giá tri pH ̣ sau các ngày thí nghiệm 72 Bảng 3.30: Kết quả giá tri ̣ Nitơ tổng số sau các ngày thí nghiệm 73 Bảng 3.31: Kết quả giá tri NH ̣ sau các ngày thí nghiệm 74 Bảng 3.32: Kết quả giá tri nitrit sau các ngày thí nghiệm 75 ̣ Bảng 3.33: Kết quả giá tri COD và BOD sau các ngày thí nghiệm 76 ̣ Bảng 3.34: Kết quả xử lý nước đầm nu ôi thủy sản của chế phẩm 77 DANH MUC̣ CÁC HÌNH Hình 3.1: Ho ạt tính phân giải chất của chủng TL1 loại môi trường 46 Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 48 Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng TL1 49 Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50 Hình 3.5: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50 Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S của chủng L 50 Hình 3.7: Vị trí phân lo ại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần… 56 Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57 Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58 Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59 Hình 3.11: Sơ đồ quy triǹ h sản xuất chế phẩm da ̣ng rắn 71 Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm 73 Hình 3.13: Giá trị nitơ tổng sau các ngày thí nghiệm 73 Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm 75 Hình 3.15 Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm 76 Hình 3.16 Giá trị COD sau các ngày thí nghiệm 77 Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm 77 MỞ ĐẦU Với đường bờ biển dài tới 3260 km cùng với rất nhiều hòn đảo lớn nho , nhiều đầm phá , eo vinḥ , đă ̣c biê ̣t có tới 250.000 rừng ngâ p̣ mă ̣n và 290.000 bãi triều, Viê ̣t Nam có tiềm lớn về diê ṇ tić h nuôi trồng thủy sản nước lơ ̣ Những năm gần , cấu chuyển dich ̣ kinh tế cùng với các sách của khuyến khích của p hủ, phong trào nuôi trồng thủy sản ven biển ở nước ta ngày càng phát triển mạnh Tuy nhiên, những năm gần ngành nuôi trồng phải đối mặt với những khó khăn có thể dẫn đến nguy thất bại ở nhiều sở nuôi trồng Nguyên nhân là ô nhiễm môi trường nước đầm nuôi , dịch bệ nh và hệ thống sinh thái bị phá hủy Các đầm nuôi trồng thủy sản , đă ̣c biê ̣t là các đầm quảng canh không có hệ thống cấp , thoát nước và xử lí nước thải nên quá trình n uôi, phân sinh vâ ̣t , thức ăn thừa , xác động vật thủy sinh , xác rong , tảo, các loại hóa chất sử dụng quá triǹ h nuôi , các loại vi khuẩn gây bệnh… làm cho nước đầm bị ô nhiêm ̃ Các chất hữu tích tụ lại ở đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh các sản phẩm : NH3, H2S, NO3 … làm cho tôm cá bi sốc̣ hoă ̣c gây ̣i cho tôm cá và các sinh vâ ̣t khác sống đầm Khi đầm nuôi bị ô nhiễm thì những nhóm vi sinh vật có hại có hội phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi bị bệnh Trước đây, người nuôi thườ ng sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưở ng lớn đến môi trường và ngư ời Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây vấn đề về dư lượ ng kháng sinh vật nuôi và vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải vấn đề này Tr ước thực trạng đó, xử lý môi trường quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấp thiết Tại một số nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển với quy mô công nghiệp Mĩ, Nhật, Trung Quốc, Thái Lan,…các biện pháp sinh học được sử dụng thay cho cách dùng hóa chất đã khẳng định được tính an toàn và hiệ u quả nuôi trồng Các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản đã đem lại nhiề u lợi ích cho người và môi trườ ng sống mà các phương pháp khác không có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệu đối với vật chủ, thích hợ p với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả tự nhân lên và ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá Với mong muốn tìm những chủng vi sinh vật có khả làm s ạch môi trường nước nuôi tôm, đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn chủng vi sinh vật tạo chế phẩ m nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản” Mục đić h của đề tài : tạo được chế phẩm có chứa một số chủng vi sinh vâ ̣t hữu ích nhằm xử lý nước nuôi tôm và bước đầu đưa những kết quả thử nghiê ̣m ̃ xử lý nước nuôi trồng thủy sản bi ô ̣ nhiêm ở quy mô phòng thí nghiê ̣m 10 Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm Qua kết quả đươ ̣c trinh ̀ bày ở bảng ̣ và đồ thi ta thấy Ở các bình thí nghiệm , sau 10 ngày thí nghiệm hàm lượng NH ở bình đối chứng thì lượng NH 3 đã giảm từ 1,34 xuống còn 0,07 mg/l Còn giảm không đáng kể , từ 1,34 mg/l xuống 1,32 mg/l sau 10 ngày thí nghiệm 3.2.4.4 Nitrit Bảng 3.32: Kết quả giá tri nitrit ̣ sau các ngày thí nghiệm thông số NO2- đơn vi ̣ mg/l Ngày đầu 0,23± 0,02 Bình thí nghiệm Sau Sau Sau 10 ngày ngày 0,17± 0,13± 0,12± 0,01 0,03 0,01 Ngày đầu 0,23 Bình đối chứng Sau Sau ngày ngày 0,19 0,17 Hình 3.15 Giá trị nitritsau các ngày thí nghiệm Nitrit là chỉ tiêu vê ̣sinh , yếu tố chỉ thi củạ quá trình tư ̣ làm sa ̣ch nước tư ̣ nhiên Dạng nitrit thường vô hại môi trường nướ c mà hàm lươ ṇ g chlorinity thấp thì nitrit gây đô ̣c cho tôm cá Qua bảng ta thấy , ở bình thí nghiệm hàm lượng nitrit giảm rõ rệt sau 10 ngày thí nghiệm : từ 0,23 mg/l ngày xuốn g còn 0,12 mg/l ngày thứ 10 Trong đó ở bình đối chứng , lươ ṇ g nitrit có giảm giảm , ngày đầu là 0,23 mg/l và đến ngày thứ 10 là 0,18 mg/l 75 Sau 10 ngày 0,18 3.2.4.5 COD BOD COD là nhu cầu ox y hóa học cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất hữu nướ c thành CO và H 2O BOD là nhu cầu oxy sinh ho ̣c cần thiết cho vi sinh vâ ̣t tiêu thu ̣ để oxy hóa các chất hữu có nước Trong đầm nuôi trồng thủy sản , hai chỉ tiêu nghiên cứu chất lươ ̣ng nước COD và BOD đươ ̣c dùng để đánh g iá mức độ nhiễm bẩn , phú dưỡng đồng thời còn cho biết sư ̣ phát triển của sinh vâ ̣t thủy vưc ̣ Theo kết quả thí nghiê ̣m có bảng số liê ụ cùng với sơ đồ sau : Bảng 3.33: Kết quả giá tri COD ̣ và BOD sau các ngày thí nghiệm Bình thí nghiệm các thông đơn vi ̣ số COD mg/l BOD mg/l Bình đối chứng Ngày Sau Sau Sau 10 Ngày Sau Sau Sau 10 đầu ngày ngày đầu ngày ngày ngày 15± 11,02± 7,08± 5,10± 0,5 0,49 0,20 0,36 15 14,2 13,9 13,5 8,9± 6,8± 4,7± 3,5± 0,17 0,16 0,20 0,10 8,9 8,2 8,0 7,8 Hình 3.16 Giá trị COD sau các ngày thí nghi ệm 76 Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm Như vâ ̣y , có thể nhận thấy , sau 10 ngày thí nghiệm thì chỉ số BOD và COD ở bình t hí nghiệm đã giảm đáng kể Ở ngày đầu COD là 15 mg/l và BOD là 8,9 mg/l thì đến ngày thứ 10 COD chỉ còn 5,10 mg/l và BOD còn 3,5 mg/ Còn ở bình đối chứng các chỉ số này có giảm giảm chậm và , ngày đầu COD là 15 mg/l thì đến ngày 10 là 13,5 mg/l còn BOD ngày đầu là 8,9 mg/l đến ngày thứ 10 là 7,8 mg/l Đánh giá chung Bảng 3.34: Kết quả xƣƣ lý nƣớc đầm nuôi thủy sản của chế phẩm các Bình thí nghiệm đơn vi ̣ thông số Bình đối chứng Ngày Sau Sau Sau 10 Ngày Sau Sau Sau 10 đầu ngày ngày đầu ngày ngày ngày pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,1 Độ muối ‰ 21 19 19 20 21 20 19 20 Nitơ tổng số mg/l N 6,92 mg/l 4,36± 0,11 0,07± 0,015 0,12± 0,01 6,98 NO2- 5,00± 0,15 0,15± 0,032 0,13± 0,03 7,01 N 5,30± 0,42 0,52± 0,023 0,17± 0,01 7,00 NH3 7,00± 0,30 1,34± 0,21 0,23± 0,02 COD mg/l 15± 0,5 11,02± 0,49 7,08± 0,20 5,10± 0,36 BOD mg/l 8,9± 6,8± 4,7± 3,5± 0,17 0,16 0,20 0,10 77 1,34 1,33 1,35 1,32 0,23 0,19 0,17 0,18 15 14,2 13,9 13,5 8,9 8,2 8,0 7,8 Như vâ ̣y có thể thấy , khả làm nước đầm nuôi tôm cá của chế phẩm vi sinh là rất cao và có hiê ̣u quả rõ r ệt Ở bình thí nghiệm có bổ sung chế phẩm vi sinh , các chỉ số b ất lợi của môi trường đã giảm dần theo thời gian , chất lươ ̣ng nước đươ ̣c cải thiê ṇ đáng kể sau ngày xử lí , các chỉ số môi trường NH3, NO2- giảm mạnh ở trạng thái ô nhiễm nhẹ Sau ngày nước đã đươ ̣c làm sa ̣ch và nằm giới ṇ chiụ đưṇ g của sinh vâ ̣t Sau 10 ngày các chỉ số ở bể thí nghiệm giảm rõ rệt : nitơ tổng giảm 37,7%, amôni giảm 91,8%, NO2- giảm 47,8%, COD giảm 66,0% và BOD giảm 60,6% bể đối chứng (không dùng chế phẩm ) các chỉ số môi trường có giảm không đáng kể , sau 10 ngày thí nghiê m ̣ , nước vâñ ở̀ tinh trã ṇ g ô nhiêm , quá trình tự làm tự nhiên diễn chậm Hàng ngày , các đầm nuôi trồng thủy sản nhất là nuôi công nghiê ̣ p, lươ ̣ng chất thải hữu liên tu ̣c gia tăng thức ăn thừa , phân sinh vâ ̣t , tảo chết , xác đô ̣ng vâ ̣t… để quá tình tư ̣ làm sa ̣ch tư ̣ nhiên thì đòi hoi thời gian rất dài , vâ ỵ thì chất lươ ṇ g nước ngày càng suy thoái , ảnh h ưởng đến s ự phát triển của thủy sản nuôi Khi bổ sung chế phẩm vi sinh vào nước , các vi sinh vật có ích thúc đẩy quá trình phân hủy các hợp chất hữu dư thừa , cải thiện chất lượng nước theo hướng có lơ ̣i cho tôm phát tr iển Kết quả thu đươ ̣c cho thấy dùng chế phẩm xử lí ̃ nước nuôi trồng thủy sản đã bi ô ̣ nhiêm đều có hiê ụ quả nước tư ̣ làm sa ̣ch tư ̣ nhiên 78 KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được rút một số kết luận sau đây: Đã tuyể n chọn được chủng vi sinh vật có khả làm s ạch nước nuôi trồng thủy sản đó là các chủng: TL1, L5, NA7, NT2 - Chủng TL1 được xác đị nh thuộc chi Bacillus - Chủng L5 được xác định thuộc về loài Lactobacillus plantarum có khả sinh bacteriocin, ức chế mạnh với Vibrio parahaemolyticus - Chủng NA7 có khả chuyể n hóa amôni thành nitrit cao - Chủng NT2 có khả chuyển hóa nitrit thành nitrat cao Đã nghiên cứu đ ặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa c ủa chủng Nghiên cứu một số điều kiện lên men xốp thić h hơ ̣p cho viê ̣c ta ̣o chế phẩm vi sinh vâ ̣t của hỗn hơ p̣ chủng Bacillus TL1, L plantarum L5, Nitrosomonas sp NA7 và Nitrobacter sp NT2 Tạo chế phẩm probiotic dạng rắn , thử nghiê m ̣ xử lý nước đầm nuôi tôm ở quy mô ph òng thí nghiệm Chế phẩm đã có tác du ̣ng làm thay đổi kể theo chiều hướng tić h cưc ̣ các chỉ số nước ở đầm nuôi tôm cá , đa ̣t các chỉ tiêu của tiêu chuẩn ngành nuôi trồng thủy sản : sau 10 ngày nitơ tổng giảm 37,7%, amônia giảm 91,8%, NO2- giảm 47,8%, COD giảm 66,0% và BOD giảm 60,6% bể đối chứng ( không dùng chế phẩm ) các chỉ số môi trường có giảm không đáng kể , sau 10 ngày thí nghiệm , nước vân ở̃ tình tra ̣ng̃ ô nhiêm , quá trình tự là m tự nhiên diễn chậm KIẾN NGHI ̣ - Tiếp tu ̣c thử nghiê m ̣ tác du ṇ g của chế phẩm ta ̣i hiê ̣n trường với các phương thức nuôi khác ở quy mô lớn - Tiếp tu ̣c nghiên cứu quy triǹ h lên men ta ̣o sinh khối lớn các chủng vi sin h vâ ̣t để phục vụ việc sản xuất chế phẩm ở quy mô lớn 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Viêṭ : Nguyêñ Tác An (1996), Phương pháp quản lý chất lươṇ g nước phuc ̣ vu ̣ nuôi trồng thủy hải sản, Giáo trình cao học , Đa ̣i ho ̣c thủy sản Nha T rang Nguyêñ Tác An (1998), Báo cáo đề tài “Điều tra trạng môi trường ven biển thành phố Nha Trang đề xuất giải pháp cải thiê ̣n phát triển môi trường”, Nha Trang Bộ khoa học công nghệ và môi trường (2000), Tiêu chuẩn nước sinh hoạt TCVN 6772-2000, tiêu chuẩn nước cho bảo vệ đời sống thủy sinh TCVN 6773-2000, Hà Nội Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ photpho, Nhà xuất bản Khoa học tự nhên và Công nghệ, Hà Nội Lê Văn Cát, Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản: Chất lượng biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội Công ty cổ phần chứng khoán An Biǹ h – Phòng phân tích (2010), Báo cáo Ngành Thủy sản Việt Nam Cục Bảo vệ nguồ n lợi thủy s ản (2000), “Hiện tr ạng s ử dụng thuốc kháng sinh, hóa chất và chế phẩm môi trường nuôi tôm”, Trích tham luận hội nghị phát triển nuôi tôm tạo s ản phẩm vệ sinh thực phẩm khu vực miề n chung và miền nam, Thông tin Khoa học công nghệ, số 9, tr 11-12 Cục Khai thác và Bảo vệ Nguồn lợi thủy sản (2003), Chuyên đề: Tình hình nuôi trồng thủy sản giới vấn đề đáng quan tâm– số / 2003 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyế n, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội 10 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội 11 Hồ Thanh Hải (1999), Tiềm điều kiê ̣n tự nhiên nguồn lơị sinh vât vùng triều cửa sông ven biển cho phát triển thủy hải sản, Báo cáo hội thảo 80 khoa ho ̣c về quản lý và sử du ̣ng bền vững tài nguyên và môi trường đất ngâ ̣p nước cửa sông ven biển , Hà Nội 12 Nguyễn Văn Hảo (2002), Một số vấn đề kĩ thuật nuôi tôm sú công nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh 13 Lại Thúy Hi ền (1998), “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn khử sulphat phân l ập từ mo dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8, tr 37-38 14 Nguyêñ Đức Hô ̣i (1996), Phương pháp thu phân tích mâũ lý – hóa họ c nước, Trung tâm thông tin KHKT và kinh tế thủy sản , Viê ̣n nghiên cứu thủy sản 1, Hà Nội 15 Hoàng Huệ (1996), Xử lý nước thải , Nhà xuất bản Xây dựng , Hà Nội 16 Khoa Thuỷ Sản, trường Đại học Cần Thơ (2000), Cẩm nang ki ̃ thuât nuôi thủy sản nước lợ, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội 17 Lê Văn Khoa (Chủ biên ) (2003), Chỉ thị sinh học môi trường , Nhà xuất bản Giáo dục 18 Tr ần Tường Lưu (1994), “Đánh giá về một số khía cạnh môi trường liên quan đến bệnh tôm ở khu vực phía Nam”, Báo cáo kết nghiên cứu chương trình khảo sát nguyên nhân gây ch ết tôm nuôi khu vực phía Nam biện pháp phòng trừ để phát triển nghề nuôi tôm, Phần I, Việ n nghiên cứu môi trường thủy s ản II, thành phố Hồ Chí Minh 19 “Một số bệnh tôm nuôi và biện pháp phòng chống”, Thông tin khoa học công nghệ thủy sản, số 9/2002 20 Nguyễn Văn Nam, Phạm Văn Ty “Vai trò của chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy s ản”, Tạp chí Thông tin Khoa h ọc Công nghệ - Kinh tế thủy sản, số 3/2007, tr 27 – 28 21 Nguyễn Trọng Nho (1994), Tình hình nuôi tôm giới Việt Nam, số đặc điểm tôm sú, Đại học Thủy sản 22 Nguyêñ Tro ̣ng Nho – Tạ Khắc Thường và ctv (1996), Các tiêu sinh thái chủ yếu ao nuôi tôm tỉnh Nam Trung bô ̣ vấn đề nâng cao 81 suất đây, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ , Nha Trang 23 Nguyêñ Tro ̣ng Nho , Tạ Khắc Cường , ̃ Lục ̣ Minh Diệp , Nguyên Thi Xuyến (1997), Nghiên cứu cải tiến quy trình nuôi tôm sú thi ̣t taị Khánh Hòa đat hiê ̣u kinh tế cao suất ổn ̣nh, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Nha Trang 24 Lương Đức Phẩm (2000) Vi sinh vật lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội 25 Lương Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội 26 Văn Phú (2003), “Bio – niềm tin troṇ ve ̣n người nuôi tôm ”, Tạp chí thủy sản, (12/2002, 1/2003) ̣ ̣ cứu chất lương nước đầm nuôi tôm 27 Lê Thi Phươ ṇ g (2010), Nghiên vùng rừng ngập mặn ven biển huyê ̣n Giao Thủy, tỉnh Nam Định số biê ̣n pháp sinh hoc ̣ làm sac ̣ h nước đầm nuôi tôm, Luâ ̣n án tiến si ̃ sinh ho ̣c 28 Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội 29 Phan Lương Tâm và ctv (1998), “Kết quả bước đ ầu đánh giá nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam”, Tạp chí thủy sản, Hà Nội , tr 149-162 30 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tôm nuôi biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội 31 Đặng Ngọc Thanh (1974), Thủy sản họ c đaị cương , Nhà xuất bản đại học và trung ho ̣c chuyên nghiê ̣p , Hà Nội 32 PGS TS Ngô Tự Thành (2001), “ Sự phân bố, sinh trư ởng và sinh tổng hợ p protease ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội”, Tạp chí sinh học 23, tr 153-157 33 Nguyễn Việt Thắng (1998), “Xác định nguyên nhân gây bệ nh cho tôm ở Đồng sông Cửu Long và các giải pháp tổng hợp”, Các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ thủy sản 1991-1995, Vụ Khoa học công nghệ, Hà Nội, tr 163-173 82 34 Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động của sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu môi trường nước ảnh hưởng đến khả xảy bệ nh đốm trắng, bệnh đàu vàng tôm nuôi ở Khánh Hòa”, Tạp trí thủy sản, 43, Bộ Thủy sản-Trung tâm nghiên cứu thủy sản III, tr 5-15 35 Võ Thị Thứ , La Thi ̣ Nga, Trương Ba Hùng , Nguyêñ Minh Dương , Nguyêñ Liêu Ba (2003), Nghiên cứu taọ chế phẩm Biochie đánh giá tác duṇ g ̣ nghê ̣sinh ho ̣c chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá , Hô ̣i nghi Công toàn quốc 12/2003 36 Phạm Văn Tình (2003), Kĩ thuật nuôi tôm sú thâm canh , Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội 37 Lê Trình (1997), Quan trắc kiểm soát ô nhiêm môi ̃ trường nước , Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật 38 Vũ Thế Tr ụ (1994), Cải tiến kĩ thuật nuôi tôm Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh 39 Artemia Internation LLC (2002), “Sprirulina superfood for ornamental fish”, Technical Information Shrimp Larval and Enrichment Feed s, Dec 40 Block E., Koops H.P., Ahlers B (1991), The biochemistry of nitriflying organisms, In Variations in Autotrophic Life , Academic Press Limited, San Diego, pp 171-177 41 Block E., Sundermeyer-Klinger, Stackebraandt E (1993), New facultative lithoautotrophic nitrite- oxidizing bacteria, Arcg Microbiol, 136, pp.281284 42 Bothe, Jost, Schloter M., Ward B and Witzel (2000), Molecular analysis of ammonia oxidation and denitrification in the natural environments, FEMS Microbiol Rev.,24, pp 673-682 43 Boyd C E and Tucker C S (1998), Pond aquaculture water quality Management, Kluwer Academic Publishers, London, pp 83 44 Chanratchakool P., Turnbull J F and liusuwan C (1995), Health management in shrimp pond, Aquatic animal health research institute kasetsart university campus, Jatujak, Bangkok 10900 Thailand 45 Chiu Liao P (1992), Marine prawn culture industry of Taiwan, In marine shrimp culture principle and practies Elsevier – Amsterdam – London – Newyork – Tokyo, pp 653-674 46 Diana J.S., Lin C.K., Schneeberger P.J (1991), “Relationships amônig nutrient inputs, water nutrient concentration, primary production, and yield of Oroechromis niloticus in pond”, Aquaculture, pp 323-341 47 Emanuel V., Adrian V., Ovidiu P., Gheorghe C (2005), “Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders”, African Journal of Biotechnology , 50(3), pp 403-404 48 FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional 49 Franson (1995), Standard methods for the Examinaition of Water and Wastewater, Publication Office American Public Health AssociationWashington, DC 2005, 19 th Edition, pp 225-227; 240-243 50 Gaudiosa Almazan-Gonzales (1995), Pond limnology and water quality parameters, Aquaculture derpartment southeast fisheries development center training and information division techno-transfer section tigbanan Hoilo city, Philippines 51 Hebe M Dionisi, Alice C Layton, Gerda Harms, Igrid R Gregory, Kevin G Robinson and Gray S Sayler (2002), “Quantification of Nitrosomonas oligotropha - like Ammonia Oxidizing Bacteria & Nitrospira spp from Full-Scale Wastewater Treatment Plants by Competitive PRC” , Application and Evironmental Microbiology, pp 245-253 52 Hung-Hung Sung, Shi-Fang Hsu, Chih-Kun Chemical, Yun-Yuan Tinh, WeiLiang Chao “Relationship between desease outbreak in cultured tiger 84 shrimp (Penaeus monodon) and the composition of Vibrio communites in pond water and shrimp hetopancreas during cultivation”, Inc, Jan 53 Hung-Soo, Mitsuyo, H and Makoto (2005), Characteritics of ammonium removal by heterotrophic nitrification - Aerobic denitrification by Alcalgenes faecali, 100(2), pp 184-191 54 Ian L Brown, Kenneth J Mc Naught, Robert N Ganly, Patric Lynne Conway, Anthony John Evans, David Lioyd, Topping, XinWang (2000),Probiotic compositions, US patent No: 6, 060, 050 55 Kakani (2003), “Probiotics: their role in aquaculture, Energee - American Standard Products”, Inc, Jan 10 56 Keeton Jimmie A, William Diane P (2000) “Probiotic formulation and method for reduction of pathogenic bacteria” US patent No: US 200331049091Nichols, Andrew W (2007) "Probiotics and athletic performance: A systematic review", Current Sports Medicine Reports (Current Medicine Group LLC), pp 269–273 57 Paez-osuna F (2001), “The environmental inpact of Shrimp aquaculture: cause, effects, and mitigating alternatives ”, Environ Manage, 46, pp 65-69 58 Sambasivam S., Chandrran R & Ajmal Khan S (2003), “Role of probiotics on the environment of shrimp pond”, Environ Bio, 34, pp 13-17 59 Shan H., Obbanrd J P (2001), “Ammonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol, 71, pp 24-30 60 Sirirat Dengripat et all (1998), Effects of probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth , In Aquaculture 167 61 Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002), Application of Probiotics in Aquaculture , Ocean University of Chindo, China, May 20, pp 145-147 62 William et all (1994), Bergey’s Manual of detereminative Bacteriology , 9th, edition, pp 559-560 Website: 85 63 http://www.atcvietnam.com.vn 64 http://opac.lrc.ctu.edu.vn 65 http://vi.wikipedia.org/wiki 86 PHỤ LỤC Mô ̣t số hi ǹ h ảnh liên quan đến luâ n ̣ văn : Hình 1: Hình dạng khuẩn l ạc chủng TL1 Hình 2: Ho ạt tính kitinaza của chủng TL1 (D-d=35mm) Hình 3: Ho ạt tính xenlulaza của chủng TL1 (D-d=32mm) Hình 4: Ho ạt tính amylaza của chủng TL1 (D-d=30mm) Hình 5: Hình dạng tế bào chủng TL1 87 Hình 7: Ho ạt tính kháng V parahaemolyticus của chủng L5 Hình 6: Ho ạt tính kháng Vibrio của chủng L5 Hình 8: Nhuộm Gram chủng L5 Màu xanh: tế bào L5 Màu đỏ: tế bào E.coli Hình 9: Hình dạng khuẩn l ạc chủng L5 Hình 10: Chuẩn độ axit lactic theo phƣơng pháp Therner 88 Hình 11: Hình dạng tế bào chủng NA7 Hình 12: Hình dạng tế bào chủng NT2 Hình 13: Định l ƣợng nitrit phƣơng pháp Griss Hình 14: Định l ƣợng nitrat phƣơng pháp Brucine Hình 15: Thí nghiệm xác định tỷ lệ cám : trấu thi ƣch hơ ̣p cho lên men xốp Hình 16: Thí nghiệm xử lý nƣớc TTTS bị ô nhiêm Ƣ chế phẩm 89 [...]... trò ki ê m soát vi sinh vật gây bệnh trong m i trường thì chúng cũng có tác dụng la m gi a m mùi hôi của đ m nuôi Quan trọng hơn cả, sử dụng nho m vi khuẩn này còn có tác dụng hạn chế vi ̣c sử dụng kháng sinh, đa m bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phâ m cho sản phâ m thủy s ản Khi sử dụng nho m vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn t m cá, ngoài mục đích la m cân bằng... m ̣t thạch Để 370C trong 48h trước khi du ṇ g hoă ̣c giữ ở 40C - M i trường nuôi Nitrosomonas: 33 K2HPO4 1g MgSO4 0,2g CaCl2.2H2O 20mg FeSO4.7H2O 50mg MnCl2.4H2O 2,0mg Na2MoO4.2H2O 1mg Nước cất 1 lít pH 8,5 - M i trường nuôi Nitrobacter: K2HPO4 1g MgSO4 0,2g CaCl2 2H2O 20mg FeSO4.7H2O 50mg MnCl2.4H2O 2,0 mg Na2MoO4.2H2O 1mg Nước cất 1 lít 2.1.3.2 M i trường lên men di ̣ch thể (g/l): - M i... sản xuất các chế phâ m nh m c ải thiện m i trường nước, nâng cao hiệu suất kinh tế, hạn chế dịch bệ nh cho t m cá  M c đích của vi ệc sử dụng chế phâ m probiotic Trong nuôi trồng thủy sản s ử dụng chế phâ m probiotic nh m các mục đích: - Gia m độc tố trong ao ở m ́c thấp nhất, gia m mùi hôi thối của nước - Cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong... trò hàng đầu thuộc về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợ p các enzym thủy phân ngoại bào 1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế ph m sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong vi c cải tạo nước đ m nuôi t rồng thủy sản  Định nghĩa vê Probiotic Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới WHO, probiotic là “những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ th ể m t lượng đầy đủ sẽ có lợi cho... cho t m cá ki m 10 ki m manh ̣ > 10 điê m chết đối với t m, cá t m cá không sinh sản hoă ̣c khó sinh sản t m cá không lớn điê m chết đối với t m cá 1.4.3 Độ m ̣n Độ m ̣n được tính dựa trên tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước , có quan hê m ̣ â ̣t thiết với đời sống của thủy sinh vâ ̣t Nhu cầu về đô ̣ m ṇ thay đổi tùy theo từng loa ̣i t m cá và thời điê m trong... 1: Bắp cải - M i trường 2: Cà chua 300g 300g Nước m m 15ml Nước m m 15ml Nước cất 1 lít Nước cất 1 lít - M i trường 3: Giá đỗ - M i trường 4: 300g Khoai tây 300g Nước m m 15ml Nước m m 15ml Nước cất Nước cất 1 lít 1 lít Đun sôi m i trường sau đó đổ 40ml vào biǹ h tam giác 100ml đã đươ ̣c khử o trùng, đem khử trùng ở 121 C trong 30 phút , để nguội m i trường trong... hữu cơ gây ô nhi m nguồn nước nuôi t m, cá góp phần t ạo nên m ̣t m i trường trong s ạch cho t m cá phát triển - Nh m vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song sản phâ m mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4+ quá cao vượt m ́c cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [1] Nho m vi khuẩn nitrat hóa đó là các chi Nitrosomonas, Nitrococus,... nước với các độ m ̣n khác nhau Nho m vi khuẩn này tồn tại trong m i trường nước nuôi như m ̣t thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đ m nuôi nhưng khi gặp điều kiện bất lợi cho t m, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệ nh, vi vậy chúng được xếp vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên t m) [49] Vibrio spp rất phổ biến trong nước m ̣n, m ̣t số loài có... nho m vi khuẩn hữu ích trong m i trường nước nuôi t m cá vi chúng có khả năng chuyển hóa NH4+ thành NO3- (dạng không độc với m i trường và các sinh vật khác trong đ m) M ̣t khác, NO3- do hoạt động c ủa chúng sinh ra lại có thể được đồng hóa trong tổng hợp protein c ủa nhiều sinh vật và tảo Như vậy, nho m vi khuẩn nitrat hóa không chỉ la m gi a m độ độc của nước mà... đô ̣ , pH, m ̣t đô ̣ thả quá dày , sư ̣ thay đổi về đô ̣ m ṇ của nước • Vi khuẩn Vibrio gây bê ̣nh cho t m Các vi sinh vật gây bệnh luôn tồn t ại trong m i trườ ng sinh sống c ủa t m (đất, nước, không khí, thức ăn…) và tồn tại ngay trong cơ thể vật chủ M ̣t trong số các vi khuẩn gây bệnh nguy hại phổ biến cho t m là Vibrio spp Đây là chủng vi khuẩn Gram m, có khả