Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 MỞ ĐẦU Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa chủ đề “Chống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đe dọa toàn cầu Chống kháng kháng sinh vấn đề mới, trở nên cấp bách, đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh Cho đến nay, giải pháp đưa nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh chưa phát huy tác dụng mong đợi Trong hướng phát triển loại kháng sinh tình trạng bế tắc, nhà khoa học tìm nguồn kháng sinh tự nhiên đầy tiềm năng, peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, AMPs) Trong số peptide này, cecropin chủ yếu tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng khuẩn rộng có nhiều tiềm ứng dụng nên thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Để sản xuất AMPs nói chung cecropin nói riêng, có ba đường tiếp cận (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ axit amin theo đường hóa học (3) biểu protein tái tổ hợp Tuy nhiên, với yêu cầu thu lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu có giá thành cao khó áp dụng điều kiện phòng thí nghiệm nước phát triển Việt Nam Vì vậy, với mong muốn giảm chi phí chủ động việc sản xuất cecropin phân lập từ côn trùng Việt Nam cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành đề tài “Tách dòng biểu cecropin hệ vector khác nhau” Đây hướng nghiên cứu Việt Nam hứa hẹn nhiều triển vọng Đề tài thực Phòng thí nghiệm Sinh Y Phòng Genomic, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình kháng kháng sinh 1.1.1 Thực trạng kháng kháng sinh Kháng kháng sinh tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) có khả vô hiệu hóa tác dụng thuốc kháng sinh mà trước chúng mẫn cảm [63, 79] Khi loại thuốc tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh tồn phát triển khiến bệnh lây lan nhanh cộng đồng thành dịch bệnh khó kiểm soát Đặc biệt nước nghèo nước phát triển phải đối mặt với hậu vô nghiêm trọng gánh nặng điều trị bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh đắt tiền Thực trạng kháng kháng sinh đã, vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân loại Điều Tổng giám đốc WHO Margaret Chan nhận định nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một mối quan ngại hàng đầu việc chăm sóc sức khỏe y tế tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh Đây nguy hàng đầu gây thách thức công tác chăm sóc y tế kiểm soát bệnh truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng” Năm 1928 coi mốc quan trọng đánh dấu cho công tìm kiếm thuốc kháng sinh Alexander Fleming (1881-1955) phát penicillin [72, 75] Tuy nhiên, 60 năm sau phát gần 50 năm sau penicillin đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, giới xuất 95% chủng Staphylococcus aureus kháng lại penicillin 60% kháng lại dạng dẫn xuất methicillin [7] Ngày nay, vi khuẩn không kháng lại penicillin mà kháng nhiều loại kháng sinh khác trở thành mối đe dọa thực sức khoẻ nhân loại Theo thống kê năm 2006 WHO, vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao Klebsiella (15.1%), E coli (13.3%), P aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 (9.9%) S aureus (9.3%) Nhóm thuốc cephalosporin hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao đặc biệt từ 66-83%, nhóm kháng sinh aminosid fluoroquinolon có tỷ lệ kháng xấp xỉ 60% Báo cáo WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng thuốc tăng từ 58 năm 2010 lên 69 năm 2011 Mỗi năm, giới có khoảng 440,000 ca nhiễm lao đa kháng thuốc, 150,000 ca tử vong loại vi khuẩn [79] Tính riêng nước thuộc liên minh châu Âu EU năm có khoảng 25,000 người chết loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80] Các kháng sinh hệ đắt tiền, chí số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” dần hiệu lực [1] Bằng chứng lây lan chủng vi khuẩn kháng carbapenem (NDM-1) số nước châu Âu châu Á Loại “siêu vi khuẩn kháng thuốc” tiết enzyme NDM-1 kháng lại hầu hết loại thuốc kháng sinh, kể nhóm kháng sinh mạnh carbapenem [7, 79] Các nhà khoa học lo ngại “siêu vi khuẩn” lan khắp giới, đồng thời khẳng định tương lai gần chưa có loại thuốc có khả tiêu diệt Kháng kháng sinh không ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà tác động sâu sắc đến kinh tế Theo ước tính WHO, Mỹ năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $; với khối EU 1.5 tỉ € [80] Vì vậy, kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính toàn cầu Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh Việt Nam diễn biến phức tạp Theo báo cáo Bộ Y tế năm 2008 nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong cao thứ hai (16.7%) sau bệnh tim mạch (18.4%) Báo cáo kết nghiên cứu 19 bệnh viện Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Hải Phòng hai năm (20092010) tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E coli Klebsiella Hầu hết kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … bị kháng Theo báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Nam” nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10 năm 2010 tình trạng kháng kháng sinh nước ta đáng báo động [1] Bằng chứng tỷ lệ chủng Streptococcus pneumoniae, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp, kháng penicillin là 71.4%, kháng erythromycin là 92.1% Đây tỉ lệ kháng cao số 11 nước mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001 Năm 2009 tỷ lệ chủng vi khuẩn Gram âm kháng với ceftazidime là 42%, kháng với gentamicin là 63% kháng với axit nalidixic là 74% bệnh viện cộng đồng Xu hướng gia tăng tình trạng kháng kháng sinh thể rõ rệt Những năm 1990, thành phố Hồ Chí Minh, có 8% chủng pneumococcus kháng với penicillin Đến năm 1999-2000, tỉ lệ tăng lên 56% [1] Chính tình trạng kháng kháng sinh ngày có xu hướng tăng lên mà Việt Nam bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao giới (WHO, 2008) Thực trạng phức tạp không đặt cho ngành y tế Việt Nam nhiều thách thức mà đòi hỏi xã hội phải hành động để làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh 1.1.2 Nguyên nhân giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh Để hiểu rõ nguyên tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo WHO ngày sức khỏe giới 7/4/2011 tổng kết nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh cao sau [79]: Thứ nhất, kháng thuốc tượng tiến hóa tự nhiên Khi vi sinh vật tiếp xúc với chất có khả tiêu diệt chúng, vi sinh vật “may mắn” sống sót tự tạo chế tự vệ tránh tác dụng chất Từ hệ vi sinh vật kháng thuốc hình thành Không thế, gen kháng thuốc Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 truyền ngang từ cá thể sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày nhiều Nguyên nhân quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn Tuy nhiên, nguyên nhân lại xuất phát chủ yếu từ phía người Đó là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa, kiểm soát bệnh lây truyền yếu thiếu hệ thống giám sát Chính nguyên nhân thúc đẩy nguyên nhân diễn nhanh góp phần không nhỏ dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm xuống phải có hành động tích cực ngày hôm Nguyên nhân cuối dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày trầm trọng công cụ chống lại kháng thuốc ngày cạn kiệt Các loại thuốc kháng sinh dần tác dụng Trong đó, phát triển loại kháng sinh hệ ngày thu hẹp Hình Lịch sử phát thuốc kháng sinh Nhìn vào Hình thấy hàng loạt thuốc kháng sinh tìm chủ yếu khoảng từ năm 1940 đến năm 1970 Có thể nói thời đại hoàng kim Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 thuốc kháng sinh Tuy nhiên, từ năm 1980 trở lại số lượng thuốc kháng sinh Điều đặt mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh cạn kiệt? Thêm vào tình trạng kháng kháng sinh ngày gia tăng liệu hệ tương lai hưởng lợi ích mà kháng sinh mang lại? Đây mối băn khoăn đưa Ngày sức khỏe giới năm Một giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh mới là khai thác các peptide kháng khuẩn AMPs (antimicrobial peptides) [7, 79] Hàng loạt nghiên cứu thể sinh vật mang hệ thống peptide có khả kháng khuẩn [22, 30] Chúng có đầy đủ tiềm để trở thành nguồn nguyên liệu quý người khai thác “thời đại kháng kháng sinh” [28, 49] 1.2 Peptide kháng khuẩn (AMPs) 1.2.1 Giới thiệu chung AMPs Tất thể đa bào tiến hóa qua hàng triệu năm môi trường có nhiều loại vi sinh vật Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với mầm bệnh qua đường khác nhiều loài sinh vật bảo vệ kháng thể tế bào miễn dịch [30, 57] Lý mà chúng tồn nhờ hệ miễn dịch bẩm sinh tạo hàng loạt AMPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20, 28] Một thực tế quan trọng mầm bệnh vi sinh vật dường không hình thành tính kháng với peptide Đây lý để nhà nghiên cứu hãng dược phẩm tin tưởng AMPs trở thành liệu pháp chữa bệnh thay cho loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại [22, 45, 70] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.1.1 Hoạt tính sinh học AMPs AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng [20, 28, 37, 48] Tùy thuộc vào loại AMPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu, phổ tác dụng rộng hay hẹp Ngoài ra, số loại AMPs có hoạt tính kháng viêm, diệt tế bào ung thư đảm nhiệm chức định hệ thống miễn dịch bẩm sinh hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30] 1.2.1.2 Sự đa dạng AMPs AMPs tìm thấy nhiều mô quan khác tất giới, ngành sinh vật, từ prokaryote người [28, 60] Tuy nhiên, nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn Đến có khoảng 800 loại AMPs khác tìm thấy sinh vật nhân chuẩn [37] Dựa vào mức độ tương đồng độ tích điện, trình tự, chức cấu trúc không gian, AMPs chia thành nhóm sau [4, 9]:  Nhóm peptide phân đoạn protein lớn hơn: Các peptide tạo protein lớn bị phân cắt enzyme Trong số peptide thuộc nhóm này, peptide quan tâm nhiều lactoferricin tạo lactoferrin (một protein có hoạt tính kháng khuẩn, tiết chủ yếu mô nhầy) bị phân cắt enzyme pepsin Các nghiên cứu cho thấy lactoferricin peptide có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng [62]  Nhóm peptide tích điện âm: Lần vào năm 1992, nhà khoa học phân lập peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae [8] Đến nhà nghiên cứu tìm nhiều loại peptide kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011  Nhóm peptide tích điện dương: Đây nhóm peptide nghiên cứu nhóm lớn nhất, có mặt động vật lẫn thực vật phần lớn phân lập từ loài côn trùng [5] Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện dương điển cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9] 1.2.1.3 Tiềm ứng dụng AMPs Cho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay dần loại kháng sinh bị kháng, AMPs hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư đầy hiệu [42, 58, 64] Hơn nữa, các gen mã cho AMPs nguồn gen quan trọng để tạo nên sinh vật chuyển gen có khả kháng lại mầm bệnh Thực tế cho thấy hàng loạt loại thực vật động vật chuyển gen mã cho AMPs tạo [27, 47] Riêng lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh hệ từ AMPs thu kết khả quan Rất nhiều loại AMPs hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử nghiệm số loại thương mại hóa (Bảng 1) [22] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bảng Các loại AMPs tương tự AMPs sản xuất thương mại [22] Tên hãng sản xuất Tên thuốc Giai đoạn phát triển Sử dụng y học AM-Pharma (Phần Lan) hLF-1-11 (petide nhỏ có nguồn gốc từ lactoferrin người) Phase II Các nhiễm trùng liên quan đến cấy ghép tủy xương loài Ceragenix (Denver) CSA-13 (steroid tích điện dương bắt chước peptide thuộc hệ thống bảo vệ thể) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Helix Biomedix (USA) HB-50 (peptide tổng hợp tự nhiên bắt chước cecropin) HB-107 (đoạn dài 19 axit amin cecropin B) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Tiền thử nghiệm lâm sàng Chữa lành vết thương Inimex (Canada) IMX942 (peptide dài axit amin) Trong trình tối ưu hóa Điều chỉnh hệ miễn dịch; điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính bệnh nhân hoá trị liệu Lytix Biopharma (Na Uy) Chưa công bố Phát minh Chống nhiễm khuẩn ung thư Novacta Biosystems Ltd (Anh) Mersaxitin (bacteriocin) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng vi khuẩn Gram dương Novozymes A/S (Đan Mạch) Plectasin (defensin nấm) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng loại vi khuẩn Gram dương, đặc biệt trường hợp nhiễm phế cầu khuẩn khuẩn liên cầu Pacgen (Canada) PAC113 (dựa đoạn hoạt động histatin 5protein tìm thấy nước bọt người) Được phê chuẩn loại thuốc nghiên cứu Thuốc uống điều trị chứng sưng tấy nấm lan âm đạo, ruột, miệng da Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.2 Peptide kháng khuẩn tích điện dương (CAMPs) cecropin 1.2.2.1 Giới thiệu chung CAMPs CAMPs định nghĩa peptide có từ 12-50 axit amin với điện tích +2 đến +9 có đuôi lysine arginine có tới 50% axit amin kỵ nước [11, 38] Trong số nhóm peptide kháng khuẩn trình bày nhóm quan tâm nhiều đặc điểm: (1) có mặt hầu hết loài sinh vật; (2) có phổ kháng khuẩn rộng; (3) vi sinh vật khó hình thành tính kháng (4) có mức độ đa dạng cao sinh vật Đặc điểm giúp CAMPs có tiềm phát triển thành loại thuốc khác [14, 28, 63] Đến nay, có khoảng 600 CAMPs phát từ vi sinh vật người [38] Từ năm 1990, hãng dược phẩm lớn giới Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA), XOMA (Santa Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics Pharmaceuticals (Mountain View, CA), … nhận thấy nhóm CAMPs mang nhiều triển vọng tập trung phát triển để sản xuất thành thuốc thương mại (Bảng 2) [7] Bảng Một số sản phẩm từ CAMPs công ty sản xuất phát triển phục vụ điều trị bệnh [7] Công ty sản xuất Sản phẩm Giai đoạn phát triển Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA) Pexiganan, loại CAMPs có nguồn gốc Hoàn thành từ da ếch phase III Micrologix Biotech (Vancouver, BC, Canada) Đoạn 12 axit amin loại CAMPs loài động vật có vú có khả chống nhiễm khuẩn máu Phase II XOMA Corporation (Santa Monica, CA) CAMPs BPI dùng để kháng Neisseria meningitidis Phase III Dựa vào đặc điểm cấu trúc cuộn gấp, CAMPs phân thành lớp: lớp peptide dạng phiến gấp nếp β làm bền đến cầu disulfit (ví dụ α, Ngô Thị Hà 10 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 M làm tan nửa GST-cecropin làm tan His+GST-cecropin Kết khẳng định vai trò Tag đến trạng thái biểu cecropin đồng thời đặt thách thức cho muốn có lợi sử dụng đồng thời hai loại Tag His GST trình bày Sử dụng chất biến tính khác Sarcozyl, Guanidine phải thay đổi điều kiện biểu hướng nghiên cứu mà mong muốn thu His+GST-cecropin dạng tan Khi sử dụng hệ thống vector biểu pET-32b-cecropin với loại Tag Trx thu cecropin dung hợp trạng thái tan Đây loại Tag đánh giá có khả giúp protein biểu dạng tan cao [33, 66] Nhiều nghiên cứu biểu AMPs dung hợp với loại Tag thu kết khả quan Điển nghiên cứu Xu cs thu nhận cecropin Mdmcec dung hợp với Trx Tag dạng tan [66] Tuy nhiên, Lu cs không thành công biểu Trx-Mdc-hly (một peptide lai cecropin (Mdc) với lysozyme người (hly)) E coli BL21 (DE3) Protein dung hợp Trx-Mdc-hly thu toàn dạng thể vùi [36] Kết lần khẳng định việc lựa chọn Tag để thu AMPs dung hợp trạng thái tan phụ thuộc nhiều vào loại peptide nghiên cứu 4.3 Phương pháp thu nhận cecropin dung hợp dạng hòa tan cách thức tinh ảnh hưởng tới hiệu suất tinh Trong nghiên cứu này, sử dụng phương thức biến tính không biến tính để thu nhận dạng hòa tan cecropin dung hợp Trường hợp protein dung hợp biểu dạng tan không cần xử lý biến tính nên sử dụng trực tiếp để tinh Điển hình trường hợp GST-Md-Cec tinh cột sắc ký lực Glutathione Sepharose 4B [34] Trong đó, phương thức biến tính tiến hành protein dung hợp biểu dạng thể vùi Để thu protein dung hợp dạng hòa tan cho khâu tinh phải sử dụng đến chất biến tính ure, Ngô Thị Hà 68 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 sarkozyl, guanidine, DTT, Đây trường hợp biểu protein Mdc-hly (loại protein lai cecropin từ Musca domestica lysozyme người) Protein dung hợp Trx-6His-Mdc-hly dạng thể vùi làm tan ure M; protein dung hợp sau tinh HisTrap kit (GE Healthcare) [36] Trong nghiên cứu mình, nhận thấy kết tinh cecropin dạng hòa tan theo phương thức biến tính không biến tính có khác biệt rõ rệt Lượng cecropin dung hợp GST-cecropin tinh thu nhờ làm tan biến tính ure hẳn so với Trxcecropin làm tan phương pháp không biến tính Kết phần sau GST-cecropin làm tan ure, phải tiến hành loại bỏ ure thẩm tách trước tinh qua cột Tuy nhiên, sau thẩm tách nửa GSTcecropin trở dạng không tan Chính mà lượng GST-cecropin lại để dùng cho tinh hẳn ban đầu Kết cho thấy có mặt chất biến tính ure GST-cecropin dạng tan, loại bỏ ure phần lớn cecropin dung hợp lại trở dạng không tan Chúng thay đổi hướng tinh từ không biến tính (tức ure bị loại bỏ trước tiến hành tinh sạch) sang biến tính (giữ nguyên ure tiến hành tinh sạch) Tuy nhiên, thay đổi không thành công sau tinh theo hướng biến tính thu băng GST-cecropin Khi sử dụng loại chất biến tính ure SDS để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, kết cho thấy có khác biệt mức độ ảnh hưởng loại chất biến tính đến cấu trúc cecropin dung hợp Mặc dù xử lý với SDS 0.5% giúp GSTcecropin tan nhiều so với ure M kết tinh thu hoàn toàn ngược lại Sau xử lý với SDS 0.5% dù tiến hành tinh theo hướng không biến tính (loại SDS trước tinh sạch) hay biến tính (giữ nguyên SDS) không thu GST-cecropin Như vậy, GST-cecropin dù làm tan ure hay SDS mà tinh theo hướng biến tính không thu kết Điều giải thích GST điều kiện biến tính với SDS không giữ cấu trúc để liên Ngô Thị Hà 69 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 kết với glutathione cột gel sắc ký lực nên dẫn đến tinh GST-cecropin Khi sử dụng ure M để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, sau loại bỏ ure trước tinh thu GST-cecropin dù hiệu suất không cao Điều chứng tỏ sau loại bỏ ure, GST giữ cấu trúc đủ để liên kết với glutathione cột gel Kết cho thấy có khác biệt rõ rệt sử dụng SDS ure để xử lý thể vùi GST-cecropin Điều đặt cho câu hỏi liệu có phải SDS làm biến tính hoàn toàn cấu trúc GST-cecropin hồi tính lại hay nguyên nhân khác? Để kiểm tra giả thiết biểu GST (không dung hợp với cecropin) việc biến nạp vector pGEX-4T-1 vào chủng E coli BL21 (DE3) Chúng đồng thời tiến hành xử lý GST với SDS 0.5% với ure M theo quy trình tiến hành với protein dung hợp GST-cecropin Sau xử lý, tiến hành thẩm tách loại bỏ hai loại chất biến tính tinh qua cột Kết thu cho thấy GST xử lý với ure tinh tốt với hiệu suất cao GST xử lý với SDS không tinh Kết chứng minh giả thiết đặt Với mục đích sản xuất AMPs nói chung cecropin nói riêng, nhà nghiên cứu mong muốn thu protein dung hợp dạng tan nhằm giữ toàn vẹn hoạt tính, giảm thời gian, chi phí tinh đạt hiệu suất tinh cao Kết cho thấy cecropin biểu dạng tan tiến hành tinh theo hướng không biến tính hiệu suất tinh cao hẳn so với dạng không tan tinh theo hướng biến tính Khi tiến hành biểu tinh đồng thời cecropin nhận thấy khác biệt sử dụng hệ thống biểu hiện, Tag dung hợp khác mà cecropin có khác Trường hợp sử dụng loại Tag dung hợp, hệ thống biểu hiện, phương pháp xử lý xong mức độ biểu hiệu suất tinh cecropin có khác Cụ thể số Ngô Thị Hà 70 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 cecropin cecT biểu khó tinh hẳn so với loại lại Điều đặt cho câu hỏi liệu khác biệt có phải hoạt tính khác cecropin có nguồn gốc khác gây hay không? Bởi lẽ nhiều nghiên cứu cecropin hoạt tính loại cecropin khác có khác biệt [5, 26, 35] Vì vậy, để trả lời câu hỏi trên, hướng nghiên cứu cần thu lượng lớn cecropin tinh loại bỏ Tag tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn để có kết luận cụ thể xác Ngô Thị Hà 71 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 KẾT LUẬN Tổng hợp kết thu được, đưa số kết luận sau: Thiết kế thành công hệ thống vector biểu cecropin: hệ thống pGEX4T-1 (pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT); hệ thống pET-28a với có mặt đồng thời loại Tag (pET-28a-cecH, pET-28a-cecN, pET-28a-cecT) hệ thống pET-32b (pET-32b-cecH, pET-32b-cecN, pET-32b-cecT) Biểu thành công: • CecH, cecN cecT dạng dung hợp với GST chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3) E coli JM109 • CecH cecN dạng dung hợp với Tag His+GST chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3) • CecH, cecN cecT dạng dung hợp với Trx chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3) Xác định trạng thái biểu cecropin dung hợp: • GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT; His+GST-cecH, His+GST-cecN dạng thể vùi • Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT dạng tan Làm tan thành công cecropin dung hợp với GST dạng thể vùi SDS 0.5% ure M Tinh thành công cecropin dung hợp với Trx (Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT) cecropin dung hợp với GST (GST-cecH, GST-cecN, GST- Ngô Thị Hà 72 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 cecT) sau làm tan ure M Hiệu suất tinh cecropin dung hợp với Tag Trx cao hẳn so với Tag GST Bước đầu xử lý cecropin H dung hợp với GST protease thrombin KIẾN NGHỊ Những kết luận thu đặt phương hướng nghiên cứu cho thời gian tới sau: Chuẩn hóa điều kiện giải phóng loại cecropin khỏi GST Trx protease tương ứng thrombin enterokinase Loại bỏ GST Trx để thu cecropin tinh Thử hoạt tính kháng khuẩn loại cecropin: cecH, cecN cecT chủng vi sinh vật kiểm định Từ đánh giá khác biệt hoạt tính kháng khuẩn cecropin khác biệt hoạt tính cecropin theo hai cách làm tan biến tính không biến tính Ngô Thị Hà 73 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt GARP-Nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hường (2011), Tách dòng cecropin từ nhộng Bombyx mori biểu cecropin tái tổ hợp Escherichia coli, Luận văn cử nhân Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Tiếng Anh Arnau J., Lauritzen C., Petersen G E., Pedersen J (2006), “Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins”, Protein Expression and Purification, 48, pp 1-13 Boman H G (1995), “Peptide antibiotics and their role in innate immunity”, Annual Review of Immunology, 13, pp 61-92 Boman H G., Faye I., Gan R., Gudmundsson G H., Lidholm D A., Lee J Y., Xanthopoulos K G (1987), “Insect immunity-a gene system for antibacterial proteins”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 82(3), pp 115-124 Bondos S E., Bicknell A (2003), “Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification”, Analytical Biochemistry, 316, pp 223-231 Breithaupt H (1999), “The new antibiotics”, Nature Biotechnology, 17, pp 1165-1169 Brogden K A (1992), “Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum”, Infection and Immunity, 60, pp 5182-5189 Ngô Thị Hà 74 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Brogden K A (2005), “Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?”, Nature, 3, pp 238-250 10 Brogden K A., Ackermann M., McCray P B., Jr., Tack B F (2003), “Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences”, International Journal of Antimicrobial Agents, 22, pp 465-478 11 Brown K L., Hancock R E W (2006), “Cationic host defense (antimicrobial) peptides”, Current Opinion in Immunology, 18, pp 24-30 12 Bulet P., Charlet M., Hetru C (2003), Innate Immunity, Humana Press, Totowa, pp 89-107 13 Bulet P., Stöcklin R (2005), “Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation”, Protein and Peptide Letters, 12, pp 3-11 14 Bulet P., Stöcklin R., Menin L (2004), “Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates”, Immunological Reviews, 198, pp 169-184 15 Callaway J E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S P (1993), “Modification of the C terminus of cecropin is essential for broad-spectrum antimicrobial activity”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 37(8), pp 1614-1619 16 Chen Y Q., Zhang S Q., Li B C., Qiu W., Jiao B., Zhang J., Diao Z Y (2008), “Expression of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using two fusion partners”, Protein Expression and Purification, 57, pp 303-311 17 Cromwell M E M., Hilario E., Jacobson F (2006), “Protein aggregation and bioprocessing”, The AAPS Journal, 8(3), pp E572-E579 18 Fei D., Wei X., Xueyin D., Xianxiu X (1999), “The terminal structure plays an important role in the biological activity of cecropin CMIV”, Science in China, 42(5), pp 494-500 Ngô Thị Hà 75 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 19 20 21 Ganz T (1999), “Defensins and host defense”, Science, 286, pp 420-421 Ganz T (2003), “The role of antimicrobial peptides in innate immunity”, Integrative and Comparative Biology, 43, pp 300-304 Hancock R E W (1997), “Peptide antibiotics”, Lancet, 349, pp 418-422 22 Hancock R E W., Sahl H G (2006), “Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies”, Nature Biotechnology, 24(12), pp 1551-1557 23 Holak T A., Engstrom A., Kraulis P J., Lindeberg G., Bennich H., Jones T A., Gronenborn A M., Clore G M (1988), “The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study”, Biochemistry, 27(20), pp.7620-7676 24 Hong R W., Shchepetov M., Weiser J N., Axelsen P H (2003) “Transcriptional profile of the Escherichia coli response to the antimicrobial insect peptide Cecropin A”, Antimicrobia agents and Chemotherapy, 47(1), pp 1-6 25 Hongbiao W., Baolong N., Mengkui X., Lihua H., Weifeng S., Zhiqi M (2005), “Biological activities of cecropin B-thanatin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 66(6), pp 382386 26 Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman H G (1982), “Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and fourminor antibacterial components from cecropia pupae”, European Journal Biochemistry, 127, pp 207217 27 Jan P S., Huang H Y., Chen H M (2010), “Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide Cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases”, Applied and Environmental Microbiology, 76(3), pp 769-775 Ngô Thị Hà 76 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 28 Jenssen H., Hamill P., Hancock R E W (2006), “Peptide antimicrobial agents”, Clinical microbiology reviews, pp 491-511 29 Jin F., Xu X., Zhang W., Gu D (2006), “Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 49(1), pp 39-46 30 Kamysz W., Okrój M., Lukasiak J (2003), “Novel properties of antimicrobial peptides”, Acta Biochimica Polonica, 50(2), pp 461-469 31 Kang C S., Son S Y., Bang I S (2008), “Biologically active and C-Amidated HinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli”, The Journal of Microbiology, 46(6), pp 656-661 32 Li L., Wang J X., Zhao X F., Kang C J., Liu N., Xiang J H., Li F H., Sueda S., Kondo H (2005), “High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 39, pp 144-151 33 Li Y (2009), “MINIREVIEW Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 54, pp 1-9 34 Liang Y., Wang J X., Zhao X F., Du X J., Xue J F (2006), “Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly (Musca domestica), and its expression in Escherichia coli”, Developmental and Comparative Immunology, 30, pp 249-257 35 Liu Z., Zhang F., Cai L., Zhao G., Wang B (2003), “Studies on the properties of Cecropin-XJ expressed in yeast from Xinjiang silkworm”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 43(5), pp 635-641 Ngô Thị Hà 77 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 36 Lu X M., Jin X B., Zhu J Y., Mei H F., Chu F J., Wang Y., Li X B (2010), “Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(6), pp 2169-2178 37 McDermott A M (2004), “Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface”, Ocul Surf., 2(4), pp 229-247 38 Mookherjee N., Hancock R E W (2007), “Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections”, Cellular and molecular life sciences, 64(7-8), pp 922-933 39 Melo M N., Ferre R., Castanho M A (2009), “Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concentrations”, Nature Reviews, Microbiology, 7, pp 245-250 40 Mercado-Pimentel M E., Jordan N C., Aisemberg G O (2002), “Affinity purification of GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression”, Protein Expression and Purification, 26, pp 260-265 41 Moore A J., Beazley W D., Bibby M C., Devine D A (1996), “Antimicrobial activity of cecropins”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 37, pp 1077-1089 42 Moore A J., Devine D A., Bibby M C (1994), “Preliminary experimental anticancer activity of cecropins”, Peptide research, 7(5), pp 265-269 43 Nakajima Y., Qu X.M., Natori S (1987), “Interaction between liposomes and sarcotoxin IA, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, The Journal of Biological Chemistry, 262, pp 1665-1669 44 Pryor K D., Leiting B (1997), “High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein double-affinity fusion system”, Protein Expression and Purification, 10, pp 309-319 Ngô Thị Hà 78 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 45 Sallum U W., Chen T T (2008), “Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the AMPs Cecropin B”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 52(9), pp 3006-3012 46 Sambrook J., Russel D W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Habor laboratory Press, New York 47 Sarmasik A., Warr G., Chen T T (2002), “Production of transgenic Medaka with increased resistance to bacterial pathogens”, Marine Biotechnology, 4, pp 310-322 48 Sato H., Feix J B (2006), “Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides”, Biochimica et Biophysica Acta, 1758, pp 1245-1256 49 Schmitt P., Mercado L., Díaz M., Guzmán F., Arenas G., Marshall S H (2008), “Characterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide (CECdir-CECret) from inclusion bodies after expression in Escherichia coli”, Peptides, 29, pp 512-519 50 Serón J M., Contreras-Moreno J., Puertollano E., Cienfuegos G A., Puertollano M A., Pablo M A (2010), “The antimicrobial peptide cecropin A induces caspaseindependent cell death in human promyelocytic leukemia cells”, Peptides, 31, pp 1494-1503 51 Shahravan S H., Qu X., Chan I., Shin J A (2008), “Enhancing the specificity of the enterokinase cleavage reaction to promote efficient cleavage of a fusion tag”, Protein Expression and Purification, 59(2), pp 314-319 52 Shen L., Ding M., Zhang L., Jin F., Zhang W., Li D (2010), “Expression of Acc-Royalisin gene from Royal Jelly of Chinese Honeybee in Escherichia coli and its antibacterial activity”, Journal of agricultural and food chemistry, 58, pp 22662273 Ngô Thị Hà 79 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 53 Shen Y., Lao X G., Chen Y., Zhang H Z., Xu X X (2007), “High-level expression of cecropin X in Escherichia coli”, International Journal of Molecular Sciences, 8, pp 478-491 54 Shin S Y., Kang J H., Hahm K S (1999), “Structure-antibacterial, antitumor and hemolytic activity relationships of cecropin A-magainin and cecropin Amelittin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 53(1), pp 82-90 55 Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H G (1981), “Sequencec and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity”, Nature, 292, pp 246-248 56 Steinmetz E (2011), “Expresso® Cloning and Expression Systems: Expressioneering™ Technology streamlines recombinant protein expression”, Nature methods, 8(6), pp iii-iv 57 Strominger J L (2009), “Animal Antimicrobial Peptides: Ancient Players in Innate Immunity”, Journal of Immunol, 182, pp 6633-6634 58 Suttmann H., Retz M., Paulsen F., Harder J., Zwergel U., Kamradt J., Wullich B., Unteregger G., Stöckle M., Lehmann J (2008), “Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells”, BioMed Central Urology, pp 1-7 59 Tian Y., Zhang J., Chen Z., Peng T., Xu X., Jiang W., An J (2006), “Expression, purification of DENV-2 nonstructural protein (NS3) and production of the polyclonal antibody for NS3”, Dengue Bulletin, 30, pp 146-156 60 Ueno S., Kusaka K., Tamada Y., Minaba M., Zhang H., Wang P C., Kato Y (2008), “Anionic C-terminal proregion of Nematode antimicrobial peptide Cecropin P4 precursor inhibits antimicrobial activity of the mature peptide”, Bioscience Biotechnology Biochemistry, 72(12), pp 3281-3284 Ngô Thị Hà 80 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 61 Wachinger M., Kleinschmidt A., Winder D., Pechmann N.V., Ludvigsen A., Neumann M., Holle R., Salmons B., Erfle V (1998), “Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus by suppressing viral gene expression”, Journal of General Virology, 4, pp 731-740 62 Wakabayashi H., Takase M., Tomita M (2003), “Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin”, Current Pharmaceutical Design, 9(16), pp 1277- 1287 63 Wilcox S (2004), “The new antimicrobials: Cationic peptides”, BioTeach Journal, 2, pp 88-91 64 Xiaobao J., Hanfang M., Xiaobo L., YanMa, Ai-hua Z., Yan W., Xuemei L., Fujiang C., Qiang W., Jiayong Z (2010), “Apoptosis-inducing activity of the antimicrobial peptide cecropin of Musca domestica in human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 and the possible mechanism”, Acta Biochim Biophys Sin, pp 259-265 65 Xie W., Qiu Q., Wu H., Xu X (1996), “Expression of cecropin CMIV fusion protein in E coli under T7 promoter”, Biochemistry and molecular biology international, 39(3), pp 487-492 66 Xu X., Jin F., Yu X., Ji S., Wang J., Cheng H., Wang C., Zhang W (2007), “Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide, cecropin, from Escherichia coli”, Protein Expression and Purification, 53, pp 293-301 67 Yamada K., Nakajima Y., Natori S (1990), “Production of recombinant sarcotoxin UA in Bombyx mori cells”, Biochemistry Jounal, 272, pp 633-636 68 Yang W., Cheng T., Ye M., Deng X., Yi H., Huang Y., Tan X., Han D., Wang B., Xiang Z., Cao Y., Xia Q (2011), “Functional Divergence among Silkworm Antimicrobial Peptide Paralogs by the Activities of Recombinant Proteins and the Induced Expression Profiles”, PloS One, 6(3), pp e18109 Ngô Thị Hà 81 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 69 Yu F., Wang J., Zhang P., Hong Y., Liu W (2010), “Fusion expression of cecropin B-like antibacterial peptide in Escherichia coli and preparation of its antiserum”, Biotechnology Letters, 32, pp 669-673 70 Zasloff M (2002), “Antimicrobial peptides of multicellular organisms”, Nature, 415, pp 389-395 Trang Web 71 http://cancer.med.unc.edu/vandykelab/protocols/miscellaneous/dialysis_tubing_ preparation.pdf 72 http://history1900s.about.com/od/medicaladvancesissues/a/penicillin.htm 73 http://www.blueskybiotech.com/cellCulture-insectExp.html 74 http://www.globeimmune.com/technology/ 75 http://www.historylearningsite.co.uk/alexander_fleming_and_penicillin.htm 76 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Protein-ExpressionSystems-and-Vectors/Protein-Expression-Systems.html 77 http://www.nhandan.com.vn/cmlink/nhandandientu/thoisu/khoa-hoc/khoa-h-c/baong-tinh-tr-ng-khang-thu-c-khang-sinh-1.292643#y2iCFxHSBTzz 78 http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-andapplications-guide/protein-expression/ 79 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ 80 www.who.int/world-health-day/2011/presskit/WHD2011-QA-EN.pdf Ngô Thị Hà 82 K18 Sinh học [...]... các vector nhân dòng sang vector biểu hiện Các gen cecH, cecN và cecT được chuyển trực tiếp từ vector nhân dòng sang các vector biểu hiện hoặc chuyển thông qua vector nhân dòng trung gian pBS Cụ thể các bước chuyển được trình bày trong Hình 10 Ngô Thị Hà 32 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 10 Sơ đồ thiết kế các hệ thống vector biểu hiện cecropin 2.2.1.2 Biểu hiện các cecropin dưới... côn trùng ở Việt Nam vào các vector biểu hiện và (2) nghiên cứu để biểu hiện các loại cecropin này trong hệ thống vi khuẩn E coli Như vậy, với việc nghiên cứu về cecropin được phân lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam, đồng thời với phương pháp thu nhận peptide mong muốn bằng con đường sản xuất protein tái tổ hợp, đề tài Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau mang nhiều ý nghĩa... khoa học 2009-2011 cecropin vào công nghệ sinh học trong chăn nuôi và trồng trọt [27] Hướng sản xuất cecropin tái tổ hợp cũng được tiến hành trong các hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn [16, 31, 34, 66], nấm men [29, 32] và côn trùng [67] Đặc biệt hệ thống biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E coli được rất nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn Năm 2006, Liang và cs đã tách dòng gen cecropin phân lập từ... học Quốc gia Hà Nội đã phân lập một số gen cecropin từ nhộng, muỗi, ruồi giấm của Việt Nam [2] Tiếp tục sử dụng các gen cecropin đó để biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E coli là hướng nghiên cứu cần thiết Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau Ngoài ra, đề tài còn nghiên cứu với gen cecropin B được tổng hợp nhân tạo (theo dữ... chọn được hệ thống biểu hiện tức là nơi sản xuất protein tái tổ hợp Việc này phụ thuộc rất nhiều vào loại protein, mục đích sử dụng protein cũng như điều kiện của từng phòng thí nghiệm Hình 7 minh họa các hệ thống biểu hiện đang được dùng trong biểu hiện protein tái tổ hợp hiện nay Trong đó, hệ thống vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để biểu hiện protein cũng như AMPs trong đó có cecropin Các "nhà... thế hệ mới cần cho cuộc chiến chống kháng kháng sinh đã và đang được công nghệ sinh học quan tâm đặc biệt 1.2.2.2.4 Các phương pháp thu nhận cecropin Để thu nhận được lượng lớn cecropin, có ba con đường tiếp cận chính như sau: (1) tách chiết từ tự nhiên; (2) tổng hợp trực tiếp theo con đường hóa học và (3) biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong vi khuẩn hay các hệ thống biểu hiện khác Tách chiết cecropin. .. cho các kết quả rất khác nhau Biểu đồ ở Hình 8 cho thấy rõ sự khác biệt về hiệu quả biểu hiện khi sử dụng các Tag khác nhau với AMPs ở E coli [33] Trong đó, 3 loại Tag: GST, His và Trx có ưu thế nổi bật về hiệu suất sử dụng Ngô Thị Hà 23 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình 8 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ (%) các đuôi protein dung hợp (Tag) được sử dụng để biểu hiện AMPs ở E coli [33] Hiện. .. Mặt khác, các Tag này thường là các protein có ái lực nhất định với 1 cơ chất hay phân tử nào đó, do đó quá trình tinh sạch protein dung hợp trở nên dễ dàng và có hiệu quả nhờ phương pháp sắc ký ái lực Với nhiều ưu điểm như trên nên hiện nay các vector biểu hiện thường có một hay nhiều Tag để phù hợp với các loại protein khác nhau Tuy nhiên, các protein khác nhau khi dung hợp với các Tag khác nhau. .. Stratagene - Vector biểu hiện: Vector pGEX-4T-1 của hãng GE Healthcare, vector pET28a và vector pET-32b của hãng Novagen Thông tin về các hệ thống vector được trình bày ở phần Phụ lục 1 2.1.2 Các chủng vi khuẩn - Chủng tế bào E coli DH5α dùng cho việc duy trì các vector tái tổ hợp - Chủng tế bào E coli BL21 (DE3) và E coli JM109 dùng cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp Thông tin của các chủng tế... [36, 53, 65] 1.3.2 Lựa chọn hệ thống vector biểu hiện Để biểu hiện được lượng lớn protein tái tổ hợp, việc thiết kế vector biểu hiện phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm của hệ thống biểu hiện, bản chất của protein nghiên cứu cũng như mục đích sử dụng protein cho các nghiên cứu tiếp theo Lựa chọn được Ngô Thị Hà 22 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 vector biểu hiện phù hợp là điều kiện quyết