ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Lai Thành Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Hà Nội - 2010 Nguyễn Thị Hương Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Nguyễn Mộng Hùng nguyên Trưởng phòng Công nghệ tế bào Động vật – Trung tâm nghiên cứu khoa học sống – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy người thu nhận hướng dẫn tôi bắt đầu tiến hành luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lai Thành, Chủ nhiệm môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thầy người trực tiếp hướng dẫn suốt khóa học Thầy tận tình bảo giúp đỡ nhiều thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đào Đức Thà Ths Nguyễn Thị Thoa, Ths Lưu Ngọc Anh đồng nghiệp phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Việt Quỳnh em Phòng Công nghệ Tế bào Động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội đặc biệt thầy cô giáo môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh truyền đạt cho kiến thức suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Cuối muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình tôi, người ủng hộ nguồn động viên lớn lao giúp hoàn thành khóa học Hà Nội tháng 11/2010 Học viên Nguyễn Thị Hương Nguyễn Thị Hương i Cao học K16 Sinh học Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AMP: Adenosine monophosphate BSA: Bovine serum albumin ( Albumin huyết bò) DMSO: Demethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic) eCG: equine chorionic gonadotropin (Huyết thai ngựa) FCS: Fetal calf serum (Huyết bê) FSH: Follicle stimulating hormone (Hóc môn kích thích nang trứng) GV: Germinal vesicle (Túi mầm) hCG: Human chorionic gonadotropin (Chorionic gonadotropin người) ICM: Inner cells mass ( Nút phôi) ICSI: Intracytoplasmic sperm injection IVF: In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm) IVM: In vitro maturation (Nuôi thành thục ống nghiệm) IVC: In vitro culture (Nuôi cấy ống nghiệm) LH: Luteinizing hormone (hóc môn gây rụng trứng) NCSU: North Carolina State University PBS: Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm phot phat) PFF: Porcine follicular fluid (Dịch nang trứng lợn) SOD: Superoxide dismutase TTON: Thụ tinh ống nghiệm ZP: Zona pellucida (Màng sáng) TCN: Tiêu chuẩn nuôi Nguyễn Thị Hương ii Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học MỤC LỤC Trang MỤC LỤC HÌNH iv MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Buồng trứng tạo trứng _3 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng 1.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng 1.2 Cấu tạo hoạt động ống dẫn trứng 11 1.3 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng _13 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng 13 1.3.2 Quá trình sinh tinh .14 1.4 Sự thành thục tế bào trứng ống nghiệm (IVM) vai trò môi trường 15 1.4.1 Sự thành thục tế bào trứng 16 1.4.2 Vai trò tế bào nang 17 1.4.3 Vai trò việc bổ sung dịch nang trứng FCS môi trường nuôi thành thục trứng 18 1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _20 1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng 20 1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro 21 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng .22 1.6 Thụ tinh ống nghiệm 24 1.6.1 Sự thụ tinh 24 1.6.2 Quá trình thụ tinh ống nghiệm 24 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng thụ tinh ống nghiệm 25 1.7 Nuôi phôi ống nghiệm _26 1.7.1 Quá trình phát triển phôi 26 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh .28 1.8 Cất giữ lạnh phôi 29 1.9 Giải đông phôi 32 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng 33 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 33 2.2.1 Thiết bị 33 2.2.2 Hóa chất .33 2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu _35 2.3.1 Phương pháp thu bảo quản buồng trứng từ lò mổ 35 Nguyễn Thị Hương iii Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng .35 2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng .36 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu 36 2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro .37 2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng 37 2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro 38 Tinh trùng sử dụng cho trình thụ tinh tinh đông lạnh cọng rạ bảo quản lạnh nitơ lỏng Sau lấy tinh khỏi bình bảo quản lạnh, để cân không khí 10 giây sau đưa vào bể ổn nhiệt 37oC 20 giây. 38 Cho tinh trùng vào ống vô trùng chứa M199 pH 7,8 sau ly tâm 2000 vòng/phút phút. 38 Sau ly tâm xong, hút bỏ phần dịch bên hòa tan phần cặn 1ml M199 pH 7,8 trộn cách dùng pipet vô trùng hút đẩy nhẹ nhàng. 38 Sau pha loãng chuyển tinh trùng vào đĩa vô trùng sau phủ dầu khoáng ủ tủ nuôi cấy điều kiện 38,5oC, độ ẩm 95% 5% CO2 để chuẩn bị cho thụ tinh. _38 2.3.8 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm 38 2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử ống nghiệm .39 2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi 40 2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi 40 2.3.12 Phương pháp giải đông phôi nuôi cấy phôi sau giải đông 42 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu .43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết thu buồng trứng tế bào trứng 44 3.2 Kết đánh giá, phân loại trứng trước nuôi cấy in vitro _46 3.3 Kết nuôi trứng thành thục 49 3.4 Kết thụ tinh tạo phôi _52 3.4.1 Kết thụ tinh trứng sau nuôi in vitro 52 3.4.2 Kết tạo phôi từ trứng sau nuôi thụ tinh in vitro .53 3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 56 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh 56 3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 57 3.6 Kết thu dịch nang trứng 60 KẾT LUẬN .62 KIẾN NGHỊ .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 MỤC LỤC HÌNH Trang Nguyễn Thị Hương iv Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Hương Khoa Sinh học v Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học MỞ ĐẦU Trong suốt trình phát triển, loài người khai phá thiên nhiên, hóa chọn lọc nhiều loại động vật, giữ lại giống loài tốt, có lợi cho loại thải giống không hiệu Trong loài động vật hóa, lợn loài động vật gắn bó với người từ thuở hoang sơ tận Điều nói lên cần thiết vai trò to lớn lợn đời sống người Vai trò phải kể đến lợn nguồn thực phẩm cần thiết, có giá trị dinh dưỡng cao cho người Theo Harris cs (1956) 100g thịt lợn nạc có 367 Kcal 22 g protein [18] Trong xã hội đại, lợn đóng vai trò vô quan trọng nghiên cứu khoa học Theo nhà nghiên cứu giải phẫu mô học cấu tạo phôi thai lợn người có tương đồng lớn [3] Do nhà nghiên cứu sử dụng phôi thai lợn để tiến hành nghiên cứu cấu tạo, phát triển chế hoạt động phôi thai người Còn theo nhà dinh dưỡng học nhu cầu dinh dưỡng tỷ lệ chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển lợn gần với người Vì mà lợn sử dụng làm đối tượng để tiến hành thí nghiệm dinh dưỡng cho người Cùng với phát triển khoa học lợn giữ nhiều vai trò quan trọng việc phục vụ sức khỏe người Các nhà nghiên cứu sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật, thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn máy sinh học để tạo nguồn dược liệu quí Đặc biệt y học, nhà khoa học tạo mô hình lợn nhiều loại bệnh khác người cách đưa gen gây bệnh người vào hệ gen lợn Mặt khác, cách này, nhà khoa học cố gắng tạo cho phận để chuyển lợn chuyển gen người với khả tương đồng cao mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép quan cho người bệnh Kỹ thuật tạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn kỹ thuật bắt buộc cần có để Nguyễn Thị Hương Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học điều trở thành thực Vì lý mà việc nghiên cứu phôi tạo phôi lợn in vitro nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới Xét phương diện công nghệ sinh học chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu chăn nuôi cách tạo số lượng phôi lớn có chất lượng tốt khả sống cao Ngoài ra, trứng sau nuôi thành thục phục vụ cho nhiều nghiên cứu khác như: ICSI, cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn giống quí hiếm, cá thể giống tốt ngân hàng gen [42], [43], [71] So với việc tạo phôi lợn phương pháp in vivo việc tạo phôi lợn phương pháp in vitro có số ưu điểm vượt trội Đó phương pháp giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ thí nghiệm sử dụng buồng trứng thu từ lò mổ với số lượng lớn Cùng với đó, số lượng trứng thu đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm nhiều chi phí để tạo phôi phương pháp giảm đáng kể Ngoài ra, trước thực tế số giống lợn quí nước ta nằm trước nguy tuyệt chủng nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học giống lợn cần thiết Viện Chăn nuôi thực bảo tồn phương pháp in situ phương pháp tốn không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn phôi đông lạnh Với mục đích trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn phương pháp thụ tinh ống nghiệm” đặt ba nội dung để giải là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất lượng phôi lợn cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro đông lạnh ni tơ lỏng Nguyễn Thị Hương Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học TỔNG QUAN Chương 1.1 Buồng trứng tạo trứng 1.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng Buồng trứng quan tạo giao tử (noãn bào - tế bào trứng) động vật nói chung gia súc nói riêng Không giống tinh hoàn, buồng trứng nằm xoang bụng, sau thận, đỉnh trước khung xương chậu Buồng trứng gồm buồng trứng bên trái buồng trứng bên phải Chức buồng trứng là: tạo tế bào trứng sản xuất hormone sinh dục [33] Buồng trứng tạo trứng thành thục theo tần suất định Ở lợn, chu kỳ rụng trứng tạo khoảng 10-20 tế bào trứng Tế bào trứng nằm nang trứng Các hormone buồng trứng tiết estrogen progesterone Estrogen tiết từ nang trứng progesterone tiết từ thể vàng, hai hormone thuộc nhóm hormone steroid Estrogen có chức năng: kích thích phát triển quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục chịu đực; kích thích phát triển tuyến vú; kích thích đặc tính sinh dục lợn nái Progesterone có vai trò quan trọng việc chuẩn bị tử cung phôi làm tổ; ngăn cản thành thục tế bào trứng khác trình mang thai; trì có chửa kết hợp với estrogen chất khác để kích thích phát triển tuyến vú Buồng trứng gồm có miền, miền tủy bên miền vỏ bên Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh mô liên kết Miền vỏ gồm tế bào lớp mô có nhiệm vụ tạo tế bào trứng hormone Lớp miền vỏ buồng trứng biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt lớp tế bào lập phương bao phủ toàn bề mặt buồng trứng Ngay bên biểu mô bề mặt lớp mỏng, dày đặc mô liên kết, gọi áo trắng buồng trứng Phía áo trắng buồng trứng nhu mô, coi lớp chức chứa nang trứng tế bào phân tiết hormone buồng trứng Nguyễn Thị Hương Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Hình ảnh phôi lợn in vitro thời điểm thu hoạch phôi (Hình 15) Tỷ lệ tạo phôi nang gần giống với kết nghiên cứu Kikuchi cộng [38] Trong nghiên cứu Kikuchi, tỷ lệ tạo phôi nang 25,3% Tuy nhiên kết nghiên cứu ngược lại so với kết nghiên cứu Suzuki cộng [31] Trong nghiên cứu ông, tỷ lệ thụ tinh trứng nuôi môi trường bổ sung 10% FCS thấp trứng nuôi môi trường bổ sung 10% pFF tỷ lệ thụ tinh chất lượng phôi lại tốt Kết nghiên cứu ông cho tỷ lệ tạo phôi nang trứng nuôi môi trường bổ sung pFF FCS tương ứng 17% 19% Điều giải thích chất lượng pFF Chất lượng mẻ pFF thu khác phụ thuộc nhiều yếu tố pFF thu từ tất nang buồng trứng, mà chất lượng dịch nang trứng nang có kích cỡ khác khác Theo nghiên cứu Ito cộng (2008), tỷ lệ từ thành thục thụ tinh tế bào trứng nuôi môi trường bổ sung pFF thu từ nang trứng lớn (5-6mm) lớn so với tế bào trứng nuôi môi trường bổ sung pFF thu từ nang trứng bé (3-4mm) [23] Trong nghiên cứu này, tỷ lệ trứng thành thục, đạt tới giai đoạn metaphase II trứng nuôi môi trường bổ sung pFF thu từ nang trứng lớn 88,3%, môi trường sung pFF thu từ nang trứng bé (3-4mm) đạt 80% Đặc biệt, tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng trứng nuôi môi trường bổ sung pFF thu từ nang trứng lớn (56mm) thấp trứng nuôi môi trường bổ sung pFF thu từ nang trứng bé, tương ứng 31,7% 66,7% Khi lợn bị giết thịt, buồng trứng chúng phát triển theo giai đoạn khác chu kỳ động dục Ở giai đoạn tiền động dục nang trứng quan sát với kích thước lớn số lượng nhiều Trái lại giai đoạn yên tĩnh, xa giai đoạn động dục nang thường nhỏ Do chất lượng dịch nang trứng không ổn định khó kiểm soát Các nguyên nhân gây lên không ổn định kết trứng chín Nguyễn Thị Hương 55 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học lô thí nghiệm khác qua làm ảnh hưởng lớn tới số lượng chất lượng phôi tạo thành 3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh Sau thu hoạch phôi, phân loại phôi chọn phôi thuộc nhóm loại A loại B để tiến hành đông lạnh Các bước thực mô tả mục 2.3.11 Việc đánh giá phân loại phôi dựa việc quan sát hình thái phôi giai đoạn phát triển (Hình 16) Kết đánh giá thể qua Bảng Bảng 7: Phân loại phôi trước đông lạnh Chất lượng phôi Số phôi Loại phôi thí nghiệm Phôi loại A Phôi loại B Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ Phôi dâu 50 30 60% 20 40% Phôi nang 50 40 80% 10 20% Tổng số 100 70 70% 30 30% Phôi loại A phôi phát triển giai đoạn, bất thường hình dạng phôi, tế bào phôi liên kết chặt chẽ tế bào rời rạc Loại B gồm phôi phát triển giai đoạn, có hình dạng nguyên vẹn, nhiên có số tế bào phôi sau giải đông tách khỏi nút phôi Nguyễn Thị Hương 56 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Hình 16: Hình ảnh phôi phân loại trước đông lạnh 3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông Đông lạnh phôi lợn, đến coi vấn đề phức tạp khả chịu lạnh phôi lợn hàm lượng lipid nội bào cao 100 phôi xử lý cất giữ lạnh giải đông Kết đánh giá chất lượng phôi sau giải đông thể qua Bảng Bảng 8: Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông Loại phôi Phôi dâu Phôi nang Chung Tình trạng phôi Phôi phục hồi hình thái (16%) 10 (20%) 18 (18%) Phôi phát triển (4%) (6%) (5%) Phôi chết thoái hóa 40 (80%) 37 (26%) 77 (77%) Trong nghiên cứu này, bước đầu thử nghiệm chưa tập trung nghiên cứu sâu tác động ảnh hưởng trình bảo quản lạnh Nguyễn Thị Hương 57 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Chúng tiến hành giải đông 100 phôi, sau nuôi môi trường nuôi phôi 24 đánh giá chất lượng phôi sau giải đông qua hình thái phôi sau nuôi (Hình 17) Số phôi phục hồi hình thái ban đầu 18 phôi, chiếm tỷ lệ 18%, phôi tiếp tục phát triển sau giải đông phôi, chiếm 5%, lại phôi chết thoái hóa (77%) Tỷ lệ phôi sống thấp so với nghiên cứu bảo quản lạnh phôi giới A B C D Hình 17: Hình ảnh phôi sau giải đông A: Phôi nang chất lượng tốt sau giải đông; B: Phôi dâu chất lượng tốt sau giải đông; C: Phôi nang thoái hóa; D: Phôi dâu thoái hóa Nhiều nghiên cứu gần cho thấy phôi lợn nhạy cảm với thay đổi nhiệt độ khả sống phôi sau đông lạnh Lượng lipid nội bào chứa phôi cho nguyên nhân ảnh hưởng tới khả chịu lạnh phôi lợn Việc loại bỏ lipid nội bào làm thay đổi cấu trúc màng tế Nguyễn Thị Hương 58 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học bào, qua hạn chế bớt chênh lệch pha trình đông lạnh kết làm giảm ảnh hưởng không tốt tới phôi trình đông lạnh [25] Trong nghiên cứu chúng tôi, trình động lạnh phôi tiến hành theo quy trình máy đông lạnh không qua bước ly tâm lượng lipid phôi ảnh hưởng phần đến chất lượng phôi bảo quản lạnh Do đó, có nhiều nghiên cứu tập trung khắc phục yếu tố nhằm nâng cao khả sống phôi lợn sau đông lạnh Để phục vụ mục đích loại bỏ bớt lượng lipid nội bào nhà khoa học tiến hành ly tâm để tập trung giọt lipit lại với giọt lipit sau lấy micropippte, phôi chịu đựng lạnh tốt hơn, phát triển bình thường thành lợn sau giải đông cấy cho nhận [25], [63] Năm 2004, Esaki cộng báo cáo kết tỷ lệ sống phôi đạt sau giải đông có loại bớt lipid 42%, đông lạnh không loại lipid tỷ lệ đạt 9.7% [48] Tuy nhiên, sử dụng micropipet để hút lipid dễ làm tổn thương cho phôi làm ảnh hưởng tới chất lượng phôi sau giải động Li cộng (2008) tiến hành tách lipid không cần dùng dụng cụ vi thao tác cách chuyển phôi vào môi trường có nồng độ thẩm thấu cao sử lý phôi enzyme tripsin để làm tăng khoảng cách màng sáng với khối tế bào phôi tạo khoảng không lớn để thuận lợi cho việc tích tụ giọt lipit nội bào sau li tâm để lipid nội bào tập trung sát màng sáng qua hạn chế ảnh hưởng lipid tới trình đông lạnh [49] Một nghiên cứu gần cải tiến môi trường đông lạnh cách bổ sung cytochalasin-b (cyto-b) vào môi trường đông lạnh Sự có mặt cyto-b môi trường giúp cho màng sinh chất phôi bền vững cho phép lipid qua dễ dàng trinh li tâm phôi [25] Hàm lượng lipid phôi giảm dần theo phát triển phôi Những phôi giai đoạn đầu (2, 4, 8, tế bào) có hàm lượng lipid lớn phôi dâu phôi nang Do đó, khả chịu lạnh phôi lợn phụ thuộc lớn vào giai Nguyễn Thị Hương 59 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học đoạn phát triển chúng Phôi dâu, phôi nang chịu lạnh tốt phôi giai đoạn đầu phát triển Phôi chịu lạnh tốt phôi sẵn sàng hay thoát khỏi màng suốt (đặc biệt phôi vừa thoát màng), có đường kính khoảng 300µm, có màu sáng (chưa chuyển sang màu tối) Tuy nhiên, phôi thoát màng không lớp màng bảo vệ dễ bị nhiễm phân hủy, nên hiệu đông lạnh phôi không cao Do lựa chọn phôi đông lạnh hợp lý quan trọng tỷ lệ sống phôi sau giải động Thí nghiệm chưa thể nuôi phôi đến giai đoạn thoát màng vật tất phôi bảo quản lạnh chưa đến giai đoạn Đây lý dẫn đến việc phôi bảo quản lạnh có chất lượng chưa thật cao Tóm lại, phôi lợn hiệu việc bảo quản lạnh không cao Bởi dù có cải tiến biện pháp đông lạnh cách khác để nâng cao khả sống phôi sau giải đông chất lượng phôi sau giải đông bị giảm sút nhiều Do nên dùng phôi tươi sản xuất chăn nuôi hay nghiên cứu sử dụng đối tượng phôi lợn 3.6 Kết thu dịch nang trứng Dịch nang trứng môi trường bao xung quanh trứng, nang trứng Dịch nang trứng chứa tất thành phần cần thiết cho phát triển thành thục trứng protein thiết yếu, yếu tố tăng trưởng, loại hormone [30], [34] Đặc biệt dịch nang trứng chứa enzyme SOD - loại emzyme có khả quét dọn gốc tự môi trường, bảo vệ trứng khỏi tác nhân oxi hóa [62] Do đó, việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường nuôi trứng in vitro tạo điều kiện cho trứng phát triển tốt, gần với điều kiện tự nhiên Sau để lắng hỗn dịch trứng dịch nang, tiến hành hút phần dịch nang bên trên, ly tâm, thu phần dịch bảo quản lạnh để dùng dần Thể tích dịch nang trứng thu phụ thuộc vào số nang trứng buồng trứng kích thước nang trứng Buồng trứng có nhiều nang kích Nguyễn Thị Hương 60 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học thước nang lớn thu nhiều dịch nang Kết thu dịch nang trứng thể Bảng Bảng 9: Kết thu dịch nang trứng Thể tích dịch Phương pháp thu Số buồng trứng Thể tích dịch nang trung nang bình /buồng trứng Giải phẫu buồng trứng Chọc hút buồng trứng Tổng số 112 41,5 94 34 75,5 206 0,359±0,018 0,37±0,009 Với tổng số 206 buồng trứng, thu 75,5 ml dịch nang hai phương pháp để thu trứng dịch nang trứng Phương pháp thu giải phẫu buồng trứng, tiến hành thu 112 buồng trứng, thu xi lanh 94 buồng trứng thể tích dịch nang thu tương ứng 41,5 ml 34ml dịch nang Trung bình thể tích dịch nang trứng thu buồng trứng tương ứng hai phương pháp 0,359 ml/ buồng 0,37 ml/buồng Kết cho thấy sai khác có ý nghĩa thống kê kết thu dịch nang hai phương pháp Do đó, theo với mục đích thu dịch nang trứng nên tiến hành thu xi lanh với kim 18G dịch nang thu hơn, thời gian lắng đọng nhanh rút ngắn thời gian thao tác Nguyễn Thị Hương 61 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học KẾT LUẬN Đã thu nuôi tế bào trứng lợn, tạo phôi dâu phôi nang lợn in vitro Các phôi thu sau nuôi có hình thái thời gian phát triển tương ứng với phôi phát triển điều kiện tự nhiên Môi trường có bổ sung dịch nang trứng làm gia tăng số phôi phát triển tới giai đoạn phôi dâu nang so với trứng nuôi môi trường bổ sung FCS Hai phương pháp thu trứng dịch nang trứng cho kết tương đương, nhiên tùy mục đích thí nghiệm số lượng mẫu cần tiến hành mà sử dụng phương pháp cho phù hợp Đông lạnh phôi sau giải đông tỷ lệ thấp có phôi có khả phát triển (4% phôi dâu 6% phôi nang) Nguyễn Thị Hương 62 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học KIẾN NGHỊ Tiếp tục hoàn thiện qui trình tạo phôi thụ tinh in vitro nhằm nâng cao tỷ lệ phôi dâu phôi nang Được thử nghiệm cấy phôi thụ tinh in vitro vào lợn để kiểm tra giai đoạn phát triển Ứng dụng qui trình đông lạnh siêu nhanh vi giọt để nâng cao tỷ lệ phôi sống sau giải đông Sử dụng phương pháp đánh giá chất lượng trứng, phôi mức độ tế bào để thu kết xác Nguyễn Thị Hương 63 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Mộng Hùng (1993) Bài giảng Sinh học phát triển Nguyễn Văn Lý (2006) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến kết thụ tinh ống nghiệm bò Việt Nam Tiếng anh Allen, C and V Harper, Edison Community College Fetal Pig Dissection Guide Human/Pig Comparisons 2003 Atabay, E.C., Takahashy, Y., Katagiri, S., Nagano, M., Koga, A., Kanai, Y , Vitrification of bovine oocytes and its application to intergenetic somatic cell nucleus transfer 2004, Theriogenology p 15-23 Bearden, H.J., J.W Fuquay, and S.T Willard, Applied animal reproduction 6th ed 2004, Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice Hall xvi, 427 p Bijttebier J, V.S.A., Meyer E, Mateusen B, Maes D, Preovulatory follicular fluid during in vitro maturation decreases polyspermic fertilization of cumulus-intact porcine oocytesIn vitro maturation of porcine oocytes, Theriogenology p 715-742 Brown, C and W Cheng, (1985), "Limited proteolysis of the porcine zona pellucida by homologous sperm acrosin" Reproduction 74(1): p 257 Daen, F., E Sato, K Naito, and Y Toyoda, (1994), "The effect of pig follicular fluid fractions on cumulus expansion and male pronucleus formation in porcine oocytes matured and fertilized in vitro" Reproduction 101(3): p 667 Daya, S., R Gwatkin, and H Bissessar, (1987), "Separation of motile human spermatozoa by means of a glass bead column" Gamete research 17(4): p 375-380 10 Dekel, N and W Beers, (1980), "Development of the rat oocyte in vitro: Inhibition and induction of maturation in the presence or absence of the cumulus oophorus* 1" Developmental Biology 75(2): p 247-254 11 Diez, C., Duque, P., Gomez, E., Hidalgo, C.O., Tamargo, C., Rodriguez, A., Fermandez, L., De La Varga, S Fernandez, A., F©Cl, N And Carbajo, M , Bovine oocyte vitrification before or after meiosis arrest: effects on ultrastructure and developmental ability 2005, Theriogenology p 317-333 12 Ding, J and G Foxcroft, (1992), "Follicular heterogeneity and oocyte maturation in vitro in pigs" Biology of reproduction 47(4): p 648 13 Ebert, K and V Papaioannou, (1989), "In vivo culture of embryos in the immature mouse oviduct" Theriogenology 31(2): p 299-308 Nguyễn Thị Hương 64 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 14 First, N and R Prather, (1991), "Production of embryos by oocyte cytoplast-blastomere fusion in domestic animals" J Reprod Fertil Suppl 43: p 245-254 15 Fukui, Y., M Fukushima, and H Ono, (1983), "Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures" Theriogenology 20(6): p 651-660 16 Geisert, R., R Renegar, W Thatcher, R Roberts, and F Bazer, (1982), "Establishment of pregnancy in the pig: I Interrelationships between preimplantation development of the pig blastocyst and uterine endometrial secretions" Biology of reproduction 27(4): p 925 17 Hak Hyun Ka, W.H.W., Kyung Soon Im, Koji Niwa 1, (1997), "Effects of Fetal calf serum, Pig follicular fluid, and Gonadotropins an maturation of pig oocytes cultured in different media" J Mamm Ova Res 14 18 Harris, G., J Orear, and S Taylor, (1956), "Heavy Meson Fluxes at the Cosmotron" Physical Review 101(3): p 1214 19 Herrmann, H and W Holtz, (1985), "Storage of pig embryos in the ligated rabbit oviduct and its effect on the viability after re-transfer to synchronized gilts" Animal Reproduction Science 8(1-2): p 159-170 20 Hunter, M and T Wiesak, (1990), "Evidence for and implications of follicular heterogeneity in pigs" Journal of reproduction and fertility Supplement 40: p 163 21 Ian, G., Laboratory production of cattle 1994, Cab International 22 Isobe, N and T Terada, (2001), "Effect of the factor inhibiting germinal vesicle breakdown on the disruption of gap junctions and cumulus expansion of pig cumulus-oocyte complexes cultured in vitro" Reproduction 121(2): p 249 23 Ito, M., H Iwata, M Kitagawa, Y Kon, T Kuwayama, and Y Monji, (2008), "Effect of follicular fluid collected from various diameter follicles on the progression of nuclear maturation and developmental competence of pig oocytes" Animal Reproduction Science 106(3-4): p 421-430 24 Jiang, S., Yang, X., Chang, S., Heuwieser, W And Foote, R.H , Effect of sperm capacitation and oocyte maturation procedures on fertilisation and development of bovine oocytes in vitro 1991, Theriogenology p 218 25 Jonh R Dobrinsky, H.N., Cryopreservation of swine embryos 2003, The united states of America as represented by the secretary of Agriculture 26 Katayama, M., M Koshida, and M Miyake, (2002), "Fate of the acrosome in ooplasm in pigs after IVF and ICSI" Human Reproduction 17(10): p 2657 27 Katska, L., (1984), "Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle" Anim Reprod Sci 7(5): p 461-463 Nguyễn Thị Hương 65 Luận văn Thạc sỹ 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Khoa Sinh học Kazuhiro Kikuchi, Y.K., (2000), "Medium preparation and general protocols for in vitro production of porcine embryos" Keller, L.R.K.J.H.E.T.C.S., Experimental developmental biology : a laboratory manual 1999, Academic press, cop Khatir, H., C Carolan, P Lonergan, and P Mermillod, (1997), "Characterization of calf follicular fluid and its ability to support cytoplasmic maturation of cow and calf oocytes" Reproduction 111(2): p 267 Kikuchi, K., A Onishi, N Kashiwazaki, M Iwamoto, J Noguchi, H Kaneko, T Akita, and T Nagai, (2002), "Successful piglet production after transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system" Biology of reproduction 66(4): p 1033 Kim, N., H Funahashi, L Abeydeera, S Moon, R Prather, and B Day, (1996), "Effects of oviductal fluid on sperm penetration and cortical granule exocytosis during fertilization of pig oocytes in vitro" Reproduction 107(1): p 79 Kojima, T., (1998), "Manual on Pig Embryo transfer procedures " thesis Liu, R., Y Li, L Jiao, X Wang, H Wang, and W Wang, (2002), "Extracellular and intracellular factors affecting nuclear and cytoplasmic maturation of porcine oocytes collected from different sizes of follicles" Zygote 10(03): p 253-260 Longergan, P., Factors affecting in-vitro maturation and fertilisation of the bovine oocyte 1990, University College, Dublin Lu, K., I Gordon, M Gallagher, and H Mcgovern, (1987), "Pregnancy established in cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilisation of oocytes matured in vitro" The Veterinary Record 121(11): p 259 Mazur, P., The role of intracellular freezing in the deaths of cells cooled at supraoptimal rates 1977, Cryobiology p 251-272 Misae Suzuki, K.M., Manabu Ozawa, Junko Noguchi, Hiroyuki Kaneko and D.-I.F Katsuhiko Ohnuma, Akira Onishi, Masaki Iwamoto, Norio Saito , Takashi Nagai, Kazuhiro Kikuchi, Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum 2006, Theriogenology p 374-386 Mori, E., S Kashiwabara, T Baba, Y Inagaki, and T Mori, (1995), "Amino acid sequences of porcine Sp38 and proacrosin required for binding to the zona pellucida" Developmental Biology 168(2): p 575583 Nagao, Y., Saeki, K., Hoshi, M And Kainuma, H , Effetcs of oxygen concentration and oviductal epithelian tissue on the development of in vitro matured and fertilized bovine oocytes cultured in protein free medium 1994, Theriogenology p 681-687 Nguyễn Thị Hương 66 Luận văn Thạc sỹ 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Khoa Sinh học Naito, K., Y Fukuda, and Y Toyoda, (1988), "Effects of porcine follicular fluid on male pronucleus formation in porcine oocytes matured in vitro" Gamete research 21(3): p 289-295 Nakai, M., H Kaneko, T Somfai, N Maedomari, M Ozawa, J Noguchi, J Ito, N Kashiwazaki, and K Kikuchi, (2010), "Production of viable piglets for the first time using sperm derived from ectopic testicular xenografts" Reproduction 139(2): p 331 Onishi, A., M Iwamoto, T Akita, S Mikawa, K Takeda, T Awata, H Hanada, and A Perry, (2000), "Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei" Science 289(5482): p 1188 Papaioannou, V and K Ebert, (1988), "The preimplantation pig embryo: cell number and allocation to trophectoderm and inner cell mass of the blastocyst in vivo and in vitro" Development 102(4): p 793 Perry, J and I Rowlands, (1962), "Early pregnancy in the pig" Reproduction 4(2): p 175 Rall, W.F.a.F., G.M., Ice-free cryopresevation of mouse embryo at -1960C by vitrification 1985, Nature p 573-575 Rath, D., H Niemann, and T Tao, (1995), "In vitro maturation of porcine oocytes in follicular fluid with subsequent effects on fertilization and embyo yield in vitro" Theriogenology 44(4): p 529-538 Ritsuko Esaki, H.U., Mayuko Kurome, Kazumasa Hirakawa, Ryo Tomii, Hiroki Yoshioka, Hitoshi Ushijima, Masashige Kuwayama, and Hiroshi Nagashima, Cryopreservation of Porcine Embryos Derived from In VitroMatured Oocytes 2004, BIOLOGY OF REPRODUCTION p 432-437 Rongfeng Li, C.N.M., Lee Spate, David Wax, Clay Isom, August Rieke, Eric M Walters, Melissa Samuel and Randall S Prather , Production of Piglets after Cryopreservation of Embryos Using a Centrifugation-Based Method for Delipation Without Micromanipulation 2009, BIOLOGY OF REPRODUCTION p 563-571 Rosenkrans, C.F.a.F., N.L, Culture of bovine zygotes to the blastocyst stage: effects of amino acids and vitamins 1991, Theriogenology p 266 Saitoh, N., Kanagawa, H And Shimihira, I, Manual of bovine embryo transfer 1995, Japan Livestock Technology association Schroeder, A., R Schultz, G Kopf, F Taylor, R Becker, and J Eppig, (1990), "Fetuin inhibits zona pellucida hardening and conversion of ZP2 to ZP2f during spontaneous mouse oocyte maturation in vitro in the absence of serum" Biology of reproduction 43(5): p 891 Shimada, M., N Kawano, and T Terada, (2002), "Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media" Reproduction 124(4): p 557 Nguyễn Thị Hương 67 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 54 Shimada, M and T Terada, (2001), "Phosphatidylinositol 3-kinase in cumulus cells and oocytes is responsible for activation of oocyte mitogenactivated protein kinase during meiotic progression beyond the meiosis I stage in pigs" Biology of reproduction 64(4): p 1106 55 Sofie Tanghe *, A.V.S., Hans Nauwynck 2, Marc Coryn 1, Aart De Kruif, Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization, Molecular Reproduction and Development p 414-424 56 Spicer, L., S Echternkamp, S Canning, and J Hammond, (1988), "Relationship between concentrations of immunoreactive insulin-like growth factor-I in follicular fluid and various biochemical markers of differentiation in bovine antral follicles" Biology of reproduction 39(3): p 573 57 Stagemiller, R.B.a.M., R.M , Effects of follicle cells on the maturation and developmetal competence of ovine oocytes matured ouside the follicle 1984a, Gamete Research p 221-229 58 Stagemiller, R.B.a.M., R.M , In vitro maturation of extrafollicular ovine oocytes 1984b, Proceedings of the Tenth International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination p 43 59 Sutovsky, P., (2004), "Visualization of sperm accessory structures in the mammalian spermatids, spermatozoa, and zygotes by immunofluorescence, confocal, and immunoelectron microscopy" METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN TOTOWA- 253: p 59-78 60 Suzuki, M., K Misumi, M Ozawa, J Noguchi, H Kaneko, K Ohnuma, D Fuchimoto, A Onishi, M Iwamoto, and N Saito, (2006), "Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum" Theriogenology 65(2): p 374386 61 Tamás, S., (2004), "SYNCHRONIZATION OF IN VITRO MATURATION OF PORCINE OOCYTES" UNIVERSITY OF WESTHUNGARY FACULTY OF AGRICULTURE AND FOOD SCIENCES 62 Tatemoto, H., N Muto, I Sunagawa, A Shinjo, and T Nakada, (2004), "Protection of porcine oocytes against cell damage caused by oxidative stress during in vitro maturation: role of superoxide dismutase activity in porcine follicular fluid" Biology of reproduction 71(4): p 1150 63 Toshiyuki Kojima, P.D., Manual on Pig Embryo transfer procedures 1998 64 Utsumi, K., Kato, H And Iritani, Developmental ability of bovine follicular oocytes matured in culture and fertilised in vitro 1988, Theriogenology p 320 Nguyễn Thị Hương 68 Luận văn Thạc sỹ 65 66 67 68 69 70 71 72 Khoa Sinh học Utsumi, K., Kato, H And Iritani, A, Full-term development of bovine follicular oocytes matured in culture and fertilised in vitro 1991, Theriogenology p 695-703 Verma, P., Z Du, L Crocker, R Faast, C Grupen, S Mcilfatrick, R Ashman, I Lyons, and M Nottle, (2000), "In vitro development of porcine nuclear transfer embryos constructed using fetal fibroblasts" Molecular reproduction and development 57(3): p 262-269 Wang, W., L Abeydeera, T Cantley, and B Day, (1997), "Effects of oocyte maturation media on development of pig embryos produced by in vitro fertilization" Reproduction 111(1): p 101 Yamashita, Y., M Shimada, T Okazaki, T Maeda, and T Terada, (2003), "Production of progesterone from de novo-synthesized cholesterol in cumulus cells and its physiological role during meiotic resumption of porcine oocytes" Biology of reproduction 68(4): p 1193 Yoshida, M., K Ishigaki, T Nagai, M Chikyu, and V Pursel, (1993), "Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig oocytes: relevance to the ability of oocytes to form male pronucleus" Biology of reproduction 49(1): p 89 Yoshida, M., Y Ishizaki, H Kawagishi, K Bamba, and Y Kojima, (1992), "Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and developmental capacity in vitro" Reproduction 95(2): p 481 Yun Qian, W.Q.S., Jia Tong Ding, Jia Hao Aha, Bi Qin Fan 1, (2003), "Predictive Value of the area of expand cumulus mass on development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro" Journal of reproduction and development 49(2) Zimmerman, E.R., K.R Robertson, H Kim, E.Z Drobnis, and S.T Nakajima, (1994), "Semen preparation with the Sperm Select System versus a washing technique" Fertil Steril 61(2): p 269-75 Nguyễn Thị Hương 69 [...]... việc nghiên cứu điều khiển sự liên kết của tinh trùng với màng sáng của trứng trong quá trình thụ tinh nhằm hạn chế sự xâm nhập của nhiều tinh trùng vào một trứng làm giảm hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng [67] Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tinh tại thời điểm thụ tinh, chất lượng trứng mang thụ tinh và môi trường thụ tinh [32], [59], [26] 1.7 Nuôi phôi trong. .. của tinh trùng lên phôi 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm Trong suốt quá trình tạo phôi lợn in vitro, trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Khi nhiều tinh trùng cùng vào trứng, sẽ cùng tham gia vào quá trình dung hợp nhân và kết quả là hình thành lên các thể lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm làm cho hợp tử tạo. .. hoạt lực trong nghiên cứu của họ [50] Sử dụng phương pháp ly tâm Đây là phương pháp cơ bản nhất trong các phương pháp trên Phương pháp này sử dụng phù hợp khi số lượng tinh trùng lớn và chất lượng tinh trùng là khá tốt Cọng rạ chứa tinh trùng đông lạnh sau khi lấy ra khỏi bình bảo quản lạnh được hóa lỏng trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 37 oC Tinh trùng được pha loãng trong trong môi trường rửa tinh trùng... phức tạp trong tế bào trứng để chuẩn bị cho các bước phát triển tiếp theo [61] 1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm Chuẩn bị tinh trùng: Một số nghiên cứu cho thấy tinh thanh ngăn cản sự kiện toàn năng lực thụ tinh và chứa một số chất ức chế hoạt động tinh trùng nên phải loại bỏ tinh thanh trước khi thụ tinh Trong trường hợp sử dụng tinh đông lạnh thì tinh trùng đã được làm sạch và bảo quản trong. .. cho môi trường nuôi phôi ở giai đoạn đầu in-vitro Rõ ràng là mối quan hệ giữa phôi - ống dẫn trứng đặc biệt quan trọng và những hệ thống nuôi trong ống nghiệm nào nhận biết được mối quan hệ này đều thành công trong việc nuôi phôi trong ống nghiệm Dựa trên sự hiểu biết về tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta đã tổng hợp nên các môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm [55] Nguyễn... Khoa Sinh học Phôi nang thoát màng Giai đoạn này bắt đầu sau khi phôi đã thoát khỏi 7 màng sáng 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh Trong lịch sử nghiên cứu, phôi tạo ra trong phòng thí nghiệm được chuyển vào bộ phận sinh sản của con nhận nuôi phôi khác Prather và cộng sự (1991) đã đưa phôi lợn giai đoạn sớm vào đoạn thắt ống dẫn cừu kết quả thu được 83% phôi phát triển tới giai đoạn phôi nang [14]... những tinh trùng khỏe sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm tạo khối kết tủa, phần không cần thiết sẽ hòa tan trong dịch nổi bên tên Việc ly tâm giúp loại bỏ hoàn toàn các chất bảo vệ lạnh sử dụng để bảo quản tinh trùng, loại bỏ tinh thanh, những mảnh vụn tế bào, vi khuẩn và cả những tinh trùng kỳ hình [72] Nguyễn Thị Hương 23 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học 1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm 1.6.1 Sự thụ tinh Thụ tinh. .. nhà nghiên cứu Nhật Bản sử dụng thành công, để vượt qua giai đoạn đầu của hoạt hoá tinh trùng bằng cách tăng trực tiếp lượng Ca ++ của tế bào và gây phản ứng thể đỉnh 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng Các phương pháp sàng lọc tinh trùng được tiến hành để chuẩn bị cho quá trình thụ tinh trong ống nghiệm Những kỹ thuật này có thể nâng cao chất lượng tinh trùng, loại bỏ tinh. .. đó trong quá trình thụ tinh cần phải sử dụng lượng tinh trùng rất lớn Điều này dẫn tới xác suất xảy ra hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng tăng, ngoài ra còn có thể ảnh hưởng không tốt tới sự hình thành và phát triển phôi Xác tinh trùng còn lại sau thụ tinh: Sự hiện diện xác tinh trùng trong môi trường sau khi thụ tinh ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của phôi [66] Sau khi thụ tinh cần chuyển tế... phát triển bình thường [67] Phôi với những tế bào chứa nhân đa bội có thể phát triển bình thường tới một giai đoạn nhất định sẽ thoái hóa và chết dần [5] Do đó hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng sẽ làm giảm tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi tạo ra Phản ứng vỏ và màng noãn hoàng có tác dụng ngăn cản hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng xảy ra ở lợn với tần số cao hơn các