MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, dịch cúm gia cầm virus A/H5N1 vấn đề quan tâm giới, đặc biệt nước châu Á Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm gây tử vong cho hàng trăm người Cả giới lo sợ trước nguy xảy đại dịch cúm người virus A/H5N1 giống vụ đại dịch cúm xảy kỷ 20 Các nước giới tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại đại dịch cúm H5N1 xảy tương lai mua thuốc thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành phương án phòng chống dịch, thực chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy hầu hết tỉnh thành toàn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết tiêu hủy Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đứng thứ giới (sau Indonesia) số người nhiễm tử vong virus A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 virus có khả biến đổi gen nhanh chóng hình thành nên chủng virus nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt hiệu cao Ở Việt Nam nay, dịch cúm A/H5N1 liên tục xảy gia cầm người, mức độ không trầm trọng giai đoạn trước không phát có biện pháp dập dịch kịp thời dịch trở nên bùng phát Khi có dịch cúm gia cầm, phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy xác cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng cộng đồng Để phát virus cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm người gia cầm, hầu hết phòng xét nghiệm áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát virus với độ xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 thực Realtime RT-PCR 12-24 thực RT- PCR điện di gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: phản ứng để xác định virus cúm A, phản ứng xác định subtype H5 phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm tiết kiệm chi phí người ta ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 với phản ứng RT-PCR thay phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế xây dựng quy trình thực kỹ thuật multiplex RT-PCR phức tạp nên hầu hết phòng xét nghiệm nước chưa áp dụng kỹ thuật chẩn đoán cúm A/H5N1 Chính vậy, thực ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: Thiết kế lựa chọn mồi phù hợp để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ thời gian gắn mồi, nồng độ mồi, Thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người gia cầm Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Phân loại học danh pháp 1.1.1.1 Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm type A, B C Chúng virus có vật liệu di truyền RNA sợi đơn âm [32] Sự phân biệt virus cúm A, B C dựa khác đặc tính kháng nguyên nucleoprotein (NP) protein M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệ gen virus cúm A B có đoạn RNA virus cúm C có đoạn RNA [36] Trong type type A virus có giới hạn vật chủ rộng, lưu hành phổ biến gia cầm số động vật có vú lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… người [32] Virus cúm A loại có độc lực mạnh nhất, có khả biến đổi gen lớn nguyên nhân chủ yếu gây vụ đại dịch cúm kỷ qua Dựa vào khác biệt đặc tính kháng nguyên hai glycoprotein haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA), virus cúm A chia thành 16 subtype HA (H1-H16) subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp subtype HA NA, mặt lý thuyết tạo nhiều subtype khác độc tính khả gây bệnh [2] Tất subtype HA NA diện chủng virus lưu hành loài thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, có số subtype định thường xuyên lưu hành người H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] Cúm A/H5N1 subtype có khả gây nhiễm cao virus cúm Các chủng virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi người Virus cúm B virus cúm C lưu hành chủ yếu người gây vụ dịch mức độ vừa nhỏ 1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 phân biệt với subtype virus cúm A khác dựa khác biệt đặc tính kháng nguyên HA NA Do có khả biến đổi di truyền nhanh chóng nên chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), clade/subclade có đặc điểm di truyền đặc trưng [2] Các genotype virus cúm A/H5N1 Trong năm gần virus cúm A/H5N1 có biến đổi di truyền phân chia thành nhiều nhóm dựa vào khác biệt kiểu gen (genotype) Kiểu gen virus cúm A/H5N1 thể đặc điểm di truyền virus hình thành kết hợp phân đoạn gen Trên sở gen H5 N1 chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 phân chia thành kiểu gen khác với đặc điểm di truyền hình thành tái tổ hợp gen lại từ nguồn khác Các kiểu gen khác virus cúm A/H5N1 xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z Z+ [26] Trong số kiểu gen này, có số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, X 0) lưu hành năm, chứng tỏ chúng thích nghi để tồn [22] Kiểu gen Z kiểu gen lưu hành phổ biến Indonesia, Thái Lan, Việt Nam phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến [14] Các clade virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) FAO (Food and Agriculture Organization) xây dựng hệ thống danh pháp thống để xác định clade A/H5N1 [50] Hiện nay, hệ thống danh pháp chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, clade phân thành subclade (phân dòng) [5, 46] Hiện có virus thuộc clade 0, 1, lây nhiễm cho người Clade gồm số subclade khác lưu hành tiếp tục hình thành subclade [5] Kể từ 2008, clade A/H5N1 lưu hành gây bệnh người gồm có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), (Campuchia) (Trung Quốc) [51] 1.1.1.3 Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế giới (WHO) quy định thống danh pháp virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B C), vật chủ (có thể bỏ qua vật chủ người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus năm phân lập Nếu virus cúm A phải thêm kí hiệu kháng nguyên HA kháng nguyên NA đặt dấu ngoặc đơn Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) chủng virus cúm A người, phân lập Hong Kong, mã số chủng 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA H5 kháng nguyên NA N1 A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) chủng virus cúm A phân lập gà Việt Nam năm 2005, mã số chủng G62, kháng nguyên HA H5 kháng nguyên NA N1 1.1.2 Hình thái cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cúm H5N1 là một subtype của virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridea Virus cúm A/H5N1 mang các đặc điểm của virus cúm A (hình 1.1) Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A http://thefutureofthings.com/news/6684/ human-antibodies-neutralize-avian-flu.html Virus cúm A virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm Vỏ bọc virus lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô Các cấu trúc kháng nguyên bề mặt virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, chất glycoprotein HA, NA M2 nằm xen kẽ với Sự phân bố kháng nguyên bề mặt hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1 Bên màng lipid lót lớp protein M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36] Vật chất di truyền (hệ gen) virus cúm A RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, gồm phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 11 protein virus (tùy theo từng chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB1-F2) Bên hạt virus, phân đoạn liên kết với nucleoprotein (NP) tiểu đơn vị enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, PA) hình thành nên phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37] 1.1.3 Hệ gen protein virus A/H5N1 H5N1 có hệ gen RNA sợi đơn âm bao gồm phân đoạn gen mang tên từ 1-8 với kích thước phân tử giảm dần gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 M2) NS (NS1 NEP) (hình 1.2) Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Đặc điểm phân đoạn gen virus cúm A/H5N1 sau: Các phân đoạn mã hóa cho kháng nguyên bề mặt virus (đặc trưng theo chủng virus): - Phân đoạn (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein HA, kháng nguyên bề mặt virus cúm có chất glycoprotein Kháng nguyên có vai trò việc giúp cho virus gắn với tế bào vật chủ vận chuyển vật liệu di truyền vào bên tế bào vật chủ Quá trình bị chặn lại có kháng thể đặc hiệu gắn kết với kháng nguyên bề mặt virus Protein HA kháng nguyên bề mặt quan trọng virus cúm A, kích thích thể sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với subtype HA, tham gia vào phản ứng trung hòa virus HA protein vừa định tính kháng nguyên, vừa định độc lực virus, đích bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn xâm nhiễm virus thể nhiễm, sở điều chế vaccine phòng cúm Một đặc điểm di truyền để phân biệt virus cúm gia cầm virus cúm người là: virus cúm gia cầm gắn với thụ thể alpha 2-3 sialic acid virus cúm người gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid tế bào chủ Ở số động vật (lợn, gà ) có loại thụ thể nên bị nhiễm virus cúm gia cầm cúm người [24] Người ta phát đột biến số vị trí gen HA làm cho virus cúm gia cầm gắn với tế bào người gây bệnh cho người [11] Một số nghiên cứu thời gian gần cho thấy người có thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ thấp gia cầm có thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ thấp [28] Người ta nhận thấy đột biến xảy vị trí gen HA tương ứng với axit amin 182 192 virus gắn với thụ thể người gia cầm [10, 27] - Phân đoạn (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen mã hóa cho neuraminidase, kháng nguyên bề mặt virus, có vai trò enzyme cắt đứt liên kết gốc sialic acid màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate protein HA, giải phóng hạt virus khỏi tế bào vật chủ Ngoài ra, NA phân cắt liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô thoát khỏi chất ức chế không đặc hiệu Giống kháng nguyên HA, NA đích chủ yếu chế bảo vệ miễn dịch thể chủ, sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA chủng virus nhễm Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA NA virus sở điều chế vaccine phòng cúm cho người gia cầm hạn chế lây truyền sang người [2] Các phân đoạn mã hóa cho protein thành phần enzyme polymerase virus, có độ dài ổn định có tính bảo tồn cao, gồm: - Phân đoạn (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, tiểu đơn vị thành phần phức hợp enzyme polymerase virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2] Nghiên cứu thấy rằng, PB2 tất virus cúm gia cầm có axit amin vị trí 627 glutamine, PB2 chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine vị trí 627 Sự có mặt lysine vị trí 627 PB2 tạo thuận lợi cho virus phát triển đường hô hấp đường hô hấp động vật có vú, nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29] - Phân đoạn (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 PB1-F2 PB1 tiểu đơn vị xúc tác phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5] PB1-F2 liên quan đến độc lực virus có vai trò quan trọng việc xác định mức độ nguy hiểm dịch cúm [43] Khi so sánh chủng virus vụ dịch Hong Kong năm 1997, người ta nhận thấy biến đổi axit amin asparagine vị trí 66 thành serine (N66S) PB1-F2 liên quan đến độc lực virus Sự thay đổi axit amin N66S phát PB1-F2 virus cúm gây đại dịch cúm năm 1918 [17] - Phân đoạn (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, tiểu đơn vị enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trình tổng hợp RNA virus [40] Các phân đoạn mã hóa protein chức khác virus, chúng có kích thước tương đối ổn định chủng virus cúm A, gồm: - Phân đoạn (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA nhân bào tương tế bào chủ NP có đặc tính kháng nguyên biểu theo nhóm virus, tồn hạt virus dạng kết hợp với phân đoạn RNA - Phân đoạn (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein M1 M2 virus Các protein kết hợp với kháng nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid virus Hai protein tạo từ phân đoạn RNA với khung đọc mở khác Protein M1 gắn với RNA virus M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc virus để giải phóng phân đoạn RNA vào tế bào chất tế bào chủ M2 protein xuyên màng có chất kênh ion, cần thiết cho trình xâm nhiễm virus [36] Sự thay axit amin vị trí 31 serin thành asparagine protein M2 số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin virus [25] - Phân đoạn (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho protein không cấu trúc virus NS1 NEP (nuclear export protein) (thường gọi protein NS2) Độc lực virus liên quan đến protein NS [39] NS1 protein có vai trò việc ghép nối, dịch mã vận chuyển RNA qua màng tế bào NEP có vai trò trung gian trình vận chuyển ribonucleoprotein virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ 1.1.4 Chu trình tái virus cúm A/H5N1 Chu trình tái virus cúm xảy chủ yếu tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa thể nhiễm (hình 1.3) Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A Khởi đầu chu trình gắn kết virus với thụ thể có chứa nhóm sialic acid bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA Khi virus bám gắn với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome) Túi thực bào giảm dần pH để giúp cho trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào giải phóng phức hợp RNP virus vào tế bào chất tế bào chủ Sau đó, các phức hợp RNP được vận chuyển vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA Sợi dương RNA làm khuôn để mã tạo mRNA tái sợi âm RNA virus mRNA đưa tế bào chất để tổng hợp protein virus Quá trình tổng hợp protein tái hệ gen virus trình phức tạp điều hoà nhiều yếu tố virus tế bào Các protein PB1, PB2, PA NP virus sau tổng hợp đưa vào nhân tế bào kết hợp với RNA virus hình thành phức hợp RNP phức hợp đưa tế bào chất Các protein khác (HA, NA M2) glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất phức hệ golgi tế bào Sau hoàn thiện, protein đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép mật độ đủ lớn phức hợp RNP protein M1 tập hợp lại màng để hình thành hạt virus hệ gắn bề mặt tế bào nhờ liên kết HA với nhóm sialic acid glycoprotein màng tế bào Các hạt virus sau giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid enzyme neuraminidase 10 (B) (C) Hình 3.16: Kết quả thử nghiệm phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm A: RT-PCR phát gen M; B: RT-PCR phát gen HA; C: RT-PCR phát gen NA M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: Mẫu bệnh phẩm Trong 30 mẫu bệnh phẩm thử nghiệm, kỹ thuật multiplex RT-PCR RT-PCR phát mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14) Kết kỹ thuật multiplex RT-PCR phát đồng thời gen có độ nhạy độ đặc hiệu không thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt Độ đặc hiệu phản ứng 100%, độ nhạy cao, phát phản ứng có từ 10 virus trở lên Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RTPCR mẫu bệnh phẩm Kỹ thuât xét nghiệm Dương tính Âm tính Tổng Multiplex RT-PCR 21 30 RT-PCR 21 30 Tỷ lệ 30% 70% 100% 64 So sánh thời gian chi phí làm xét nghiệm kỹ thuật multiplex RTPCR RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ngàn đồng; thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ngàn đồng Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm tích kiệm chi phí hoá chất đến nửa so với phản ứng RT-PCR Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hoá chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR Xét nghiệm Các bước làm xét nghiệm RT-PCR Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Multiplex Thời gian (giờ) Chi phí (ngàn đồng) 150 420 1.5 9.5 30 600 150 140 1.5 6.5 30 320 Thảo luận Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 đã xảy ở nhiều nước, đặc biệt là các nước khu vực Đông Nam Á Không chỉ gây bệnh gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn lây nhiễm và gây bệnh người với tỉ lệ tử vong rất cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam là nước có số người tử vong cúm A/H5N1 đứng thứ thế giới, sau Indonesia Ở nước ta, dịch cúm gia cầm A/H5N1 vẫn xảy và có thể bùng phát bất cứ lúc nào Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng vô quan trọng Do đó, việc xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác virus cúm A/H5N1 là hết sức cấp thiết để sàng lọc số lượng lớn loại virus Trong kỹ thuật phân tử chẩn đoán virus cúm, phản ứng multiplex RT-PCR xem tốt cho kết nhanh, nhạy xác tiết kiệm chi phí hoá chất cho 65 xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007) Trong nghiên cứu chúng tôi, kỹ thuật multiplex RT-PCR với cặp mồi cho phép phát hiện đồng thời cả trình tự đặc hiệu của virus cúm A (trên gen M), subtype H5 (trên gen HA) và subtype N1 (trên gen NA) đã được xây dựng thành công Kỹ thuật multiplex RT-PCR thực theo phương pháp bước (phản ứng phiên mã ngược phản ứng khuếch đại thực tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy ngoại nhiễm Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT PCR thực tube riêng biệt) kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt Kết thử nghiệm cho thấy kỹ thuật multiplex RT-PCR chỉ đặc hiệu với virus cúm A/H5N1 và có độ nhạy cao, có khả phát hiện mẫu thử có từ 10 bản virus trở lên So với kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt, đô nhạy độ đặc hiệu phản ứng multiplex không bị giảm Thử nghiệm 14 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (8 mẫu thu thập từ gia cầm và mẫu từ người), phản ứng multiplex RT-PCR đều khuếch đại thành công gen H5, N1 và M của virus Như vậy, kỹ thuật này có thể ứng dụng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 cả người và gia cầm Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA NA chủng virus cúm phân lập từ vật chủ khác nên kỹ thuật multiplex RTPCR dùng để phát nhiễm cúm A/H5N1 số động vật có vú khác Kỹ thuật multiplex RT-PCR được thiết kế với cặp mồi có những ưu điểm vượt trội như: đơn giản hóa các bước quá trình xét nghiệm, giảm thời gian làm xét nghiệm và tiết kiệm được khoảng 50% chi phí hóa chất phục vụ cho xét nghiệm Tuy phản ứng multiplex realtime RT-PCR cho kết nhanh, nhạy xác yêu cầu có máy móc đại chi phí tốn Do vậy, kỹ thuật multiplex RT-PCR xây dựng thuận tiện cho nhiều phòng thí nghiệm nước ta 66 Kết luận Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu với gen M, HA NA dùng để phát virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm phản ứng mutiplex RT-PCR Đã xây dựng thành công kỹ thuật multiplex RT-PCR cho phép phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và có thể áp dụng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 ở gia cầm và người Kỹ thuật multiplex RT-PCR chỉ đặc hiệu với virus cúm A/H5N1, không có phản ứng chéo với các loài khác Kỹ thuật có khả phát hiện mẫu thử có từ 10 bản RNA trở lên Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm gia cầm người, đề xuất kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RT-PCR vào phát virus cúm A/H5N1 số lượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm người bị bệnh vụ dịch cúm Ứng dụng quy trình multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh môi trường nơi có dịch cúm xảy để đánh giá lưu hành virus cúm gia cầm 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm Việt Nam, Hội nghị phòng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(1): 1-18 Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86 Tô Long Thành (2004), “Bệnh cúm loài chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 53-58 Tiếng Anh Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N Engl J Med, 358, pp 261-73 Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp 1321- Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalklength of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture” Virus Res, 79(1-2): 177-185 Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans”, Arch Virol., 119, pp 37-42 Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp 1374- 85 10 Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to Faster Human Spread, Published 11 Butler D (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp 248-9 12 CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and respirators in health care settings during an influenza pandemic 68 13 Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64 14 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 2845- 50 15 Chen, H., G Deng, Z Li, G Tian, Y Li, and P Jiao (2004), “ The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA, 101: p 10452-10457 16 Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human disease from influenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp 201- 17 Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single Mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp 1414-21 18 De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP, Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma”, N Engl J Med, 352, pp 686-91 19 De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp 1203- 07 20 De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection”, N Engl J Med, 353, pp 2667-72 21 Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90(9): 4171-4175 22 Duan L, Bahl J, Smith G, et al (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996-2006”, Virology, 380, pp 243-54 23 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al (2006), “Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses”, Virology; 344:432-438 69 24 Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research 25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21), pp 8156-61 26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 8950–5 27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to human-type receptors”, Nature, 444(7117), pp.378-82 28 Harder T C and Werner O (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006 29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper Respiratory Tracts of Mice, PLoS Pathog 30 Hoa, L.T., D.D Khang, P.V Chi, N.V Hai, T.N Hai, N.T.B Nga, and L.T Binh (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p 68-71 31 Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection”, Respirology, 13(suppl 1):S10-S13 32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009), Orthomyxoviridae, In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version B#chen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA 33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus infections”, Purified hemagglutinin in subtype-specific diagnosis, J Vir.Methods 10, 75-84 34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al (2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005” N Engl J Med, 355, pp 2186-94 70 35 Katz JM, Lim W, et al (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp 1763-70 36 Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication”, Fields Virology, 4th Edition, (D.M Knipe and P.M Howley, eds), pp 1487-1531 37 Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug R M, editor The influenza viruses 1st ed New York, N.Y: Plenum Press 38 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki, Y Suzuki, and Y Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of drugresistant H5N1 virus” Nature, 437(7062): p 1108 39 Lee C W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal of Virology, 79(6), pp 3692-3702 40 Luong, G and P Palese (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop, 2: p 77-81 41 Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1 detection”, Emerg Infect Dis., 11, pp 1303-5 42 Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al (1999), Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp 937- 43 43 Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12 number 44 Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H and Webster, RG (1996), “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential”, Avian Diseases, 40: 425-437 71 45 Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn Ames, IA: Blackwell Publishing Professional 46 Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, Sakai-Tagawa Y, Macken C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in Indonesia from 2003-2007”, Virology, 390, pp 13-21 47 Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp 1179-88 48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712 49 WHO inter-country-consultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila, Philippines, 6-7 May 2005 50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses 51 Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian influenza A (H5N1) virus infection in China”, Science, 52, pp 407–11 52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses human-type receptors”, Nature, 444(7117): 378-382 72 MỤC LỤC 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 .3 1.1.1.1 Phân loại virus cúm 1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1 .4 1.1.1.3 Danh pháp virus cúm Virus cúm A tương đối nhạy cảm với tác nhân vật lí hay hóa h ọc Các hạt virus tồn thích hợp khoảng pH từ 6.5 đến 7.9 Ở pH acid hay kiềm, khả lây nhiễm virus bị giảm mạnh L ớp v ỏ virus chất lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy dung môi hòa tan lipid, ch ất t ẩy r ửa chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng hydroxylamine Virus bị bất hoạt ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn 15 ngày ánh sáng th ường, tia tử ngoại bất hoạt virus không phá h ủy kháng nguyên virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu di ệt hoàn toàn 100oC 60oC/30 phút, tồn nh ất tháng nhi ệt độ th ấp (trong phân gia cầm), tới hàng năm nhiệt độ bảo qu ản (-70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn 25-30 ngày nh ưng ch ỉ t ồn - ngày nhiệt độ thể người (37oC); nước, virus có th ể sống tới ngày nhiệt độ 30oC 15 1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 16 1.2.2.1 Các phương pháp xét nghiệm phát cúm A/H5N1 17 1.2.2.2 Chẩn đoán .23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Chọn mẫu .28 Cách chọn mẫu: 28 73 Khi códich ̣ cum ́ xaỷ ra, đôí vơí môĩ đaǹ gia câm ̀ chung ́ se ̃choṇ ngâũ nhiên t ừ2-3 gia câm ̀ chêt́ hoặc bị bênh ̣ để lâý mâu ̃ Mâũ bênh ̣ phâm ̉ thu thâp̣ co ́thê ̉ m ẫu mô (khí quản, phổi, ruột, lách, thận, não, gan, tim) ho ặc d ịch ngoáy h ọng, ổ nh ớp B ệnh ph ẩm được thu thập vòng ngày đầu sau gia c ầm m ắc b ệnh s ẽ có m ật độ virus cao 28 2.2.2 Kỹthuâṭ lâý mâu, ̃ baỏ quan̉ vàvâṇ chuyên̉ mâũ 29 Cách lấy mẫu: 29 2.2.3 Tach ́ chiêt́ RNA mẫu bệnh phẩm 29 2.2.4 Thiêt́ kếmôì .31 2.2.8 Điêṇ di vàphân tich ́ kêt́ qua.̉ 41 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A… 10 Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên khả lây nhiễm loài vật chủ virus cúm A 13 Bảng 2.1: Các thành phần PCR 33 74 phản ứng RT- Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .37 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR 38 Bảng 3.1: Cặp mồi phát gen M virus cúm A 43 Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát gen M virus cúm A .43 Bảng 3.2: Cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5N1 44 Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5 .45 Bảng 3.3: Cặp mồi phát gen NA virus cúm A/H5N1 46 Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát gen NA virus cúm A/N1 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi lựa chọn để thực phản ứng RT-PCR… 47 Hình 3.4 Ảnh điện di kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt 49 Hình 3.5 Ảnh kết điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RTPCR .50 Hình 3.6 Ảnh điện di kết tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51 Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD RNA gen M, HA NA 51 Hình 3.7 Ảnh điện di đánh giá độ nhạy phản ứng RT- PCR 52 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen M 53 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen M .54 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 75 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 Hình 3.8: Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR 56 Hình 3.9 Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR 57 Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR 58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR 59 Hình 3.12: Thử nghiệm đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR… .59 Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplexRT-PCR .60 Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .60 Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61 Hình 3.14: Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm dương tính………………………………………………………………………………… 62 Hình 3.15: Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm………………………………………….63 Hình 3.16: Kết quả thử nghiệm phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm………………………………………………….…64 Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm……………………………………………………………………… 64 Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hoá chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR……………………………………………………………… 65 76 CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water DNA: Deroxi ribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid HA (H): Haemagglutinin LB: Luria-Bertani media M: Matrix protein NA (N): Neuraminidase NP: Nucleoprotein NS: Non-structural protein PA: Polymerase A protein PB: Polymerase B protein RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA vRNP: Viral ribonucleoprotein 77 LỜI CẢM ƠN! Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn hướng dẫn tận tình, chu đáo GS.TS Lương Xuân Hiến - Trường Đại học Y Thái Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Nam Thắng thầy cô Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật Y dược - Trường Đại học Y Thái Bình giúp đỡ tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh học -Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học Cuối xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, thầy cô Bộ môn Sinh học- Trường Đại học Y Thái Bình, gia đình, bạn bè tạo điều kiện cho học động viên suốt trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2011 Học viên Trần Thị Tình 78 [...]... xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1 Với đặc điểm cấu tạo và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ thuật xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệm phải nhanh [34] Các kỹ thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA của virus bằng kỹ thuật RT-PCR, realtime RT-PCR và phát hiện sự tăng... thể trong huyết thanh bệnh nhân Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đang bùng phát thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiều mẫu bệnh phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng 17 Phương pháp phân lập virus Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như: giải trình. .. Assay): Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên virus Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể có gắn enzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp Nếu có kháng nguyên virus trong mẫu bệnh phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm. .. thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997 để phát hiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể phát hiện được 14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35] Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng H5N1 ở người nhưng do sử dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3 Kỹ thuật trung... kết quả nên kỹ thuật realtime RT-PCR hạn chế được hiện tượng dương tính giả do nhiễm sản phẩm PCR Kỹ thuật này cho kết quả nhanh và chính xác nhưng chi phí cao, tốn kém Kỹ thuật multiplex RT-PCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3 gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng Kỹ thuật này khắc phục được nhược điểm của hai kỹ thuật trên nhưng để xây dựng được phản ứng multiplex. .. hòa virus và virus không thể gây nhiễm tế bào Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA Hiện nay, kỹ thuật MN là kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng H5N1 tốt nhất Nhược điểm là kỹ thuật áp dụng với mẫu virus sống nên phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3 So với kĩ thuật trung hoà virus. .. Nam [1] 26 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Mẫu vật - Để thiết kế mồi chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng các trình tự gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm đã công bố trên Ngân hàng gen (GenBank) - Để nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng RNA virus cúm A/H5N1 do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp... tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn do thời gian xét nghiệm nhanh là: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay): Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus 18 được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Kỹ thuật miễn... của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứng vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một số chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52] Dựa vào khả năng gây bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được... luận là nhiễm virus cúm A, không xác định được có phải là A/H5N1 hay không Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp nhận được khi áp dụng trong chẩn đoán cúm mùa ở người, tuy nhiên để chẩn đoán cúm A/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34] Hiện nay một số bộ sinh phẩm phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị trường và đang được thử nghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm Phương pháp phát hiện kháng