ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đinh Văn Hân PGS TS Ngô Giang Liên Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Đinh Văn Hân PGS TS Ngô Giang Liên – người thầy tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức mà em nhận giảng đường hành trang giúp em vững bước tương lai Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn cô chú, anh chị bạn đồng nghiệp Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị Bỏng – Viện Bỏng Quốc Gia quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân yêu động viên, khích lệ, giúp đỡ em trình học tập để em hoàn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 16 tháng 08 năm 2014 Học viên Đoàn Hoàng Thu MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng Khả tạo dòng tế bào tách từ mô mỡ (n=5) Error: Reference source not found Bảng Khả tạo CFU-F theo hệ tế bào (n=5) .Error: Reference source not found Bảng Ảnh hưởng tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợi Error: Reference source not found Bảng Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lượng có tế bào gốc Error: Reference source not found Bảng Tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau trypsin Error: Reference source not found Bảng Ảnh hưởng tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừng Error: Reference source not found Bảng Ảnh hưởng tế bào gốc tới di cư tế bào sừng Error: Reference source not found DANH MỤC HÌNH Hình Sơ đồ tăng sinh nguyên bào sợi giai đoạn khác trình liền vết thương .Error: Reference source not found Hình Mô thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mô mỡ phương pháp đồng nuôi cấy Error: Reference source not found Hình Tạo vết thương in vitro Error: Reference source not found Hình Tách mô mỡ enzym collagenase .Error: Reference source not found Hình Đĩa tế bào sau 48h nuôi cấy Error: Reference source not found Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found Hình Tế bào gốc mỡ kính hiển vi đảo ngược 50X(A) 100X(B) Error: Reference source not found Hình Hình thái tế bào gốc mỡ sau nhuộm Giemsa (100X) Error: Reference source not found Hình Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ (50X) Error: Reference source not found Hình 10 Tế bào gốc mỡ tạo colony ngày thứ 10 20 (50X) .Error: Reference source not found Hình 11 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa Error: Reference source not found Hình 12 Biểu đồ so sánh số lượng tế bào thu thí nghiệm đồng nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ngày thứ Error: Reference source not found Hình 13 Tác động tế bào gốc mô mỡ lên tăng sinh nguyên bào sợi (50X) Error: Reference source not found Hình 14 Sự gia tăng số lượng nguyên bào sợi theo thời gian Error: Reference source not found Hình 15 So sánh số lượng tế bào thu thí nghiệm đồng nuôi cấy tế bào gốc với tế bào sừng Error: Reference source not found Hình 16 Tác động tế bào gốc mô mỡ lên tăng sinh tế bào sừng .Error: Reference source not found Hình 17 Tế bào sừng độ che phủ đạt 100% , tế bào sừng hình ovan đa diện mọc dày xếp khít trước tạo vết cạo để đồng nuôi cấy với tế bào gốc mỡ nguyên bào sợi (50X) Error: Reference source not found Hình 18 Ảnh hưởng tế bào gốc mỡ lên di cư biệt hóa tế bào sừng (50X) Error: Reference source not found Hình 19 So sánh hình thái tế bào gốc mô mỡ…………………………….Error: Reference source not found DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh ADSCs Adipose-Derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ DMEM Dubeco’s Modified Eagle Medium EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum - Huyết bào thai bê FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi HGF Hepatocyte Growth Factor IL Interleukin ITS-X Insulin, Transferin, Selen - X KGF Keratinocyte Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng MCS Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô P Passage- Cấy chuyển PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphat PDGF Pletelet-Derived Growth Factor TB Tế bào TGF Transforming Growth Factor VEGF Vessle Endothelial Growth Factor ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc lĩnh vực sinh học lôi Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc y học giới lựa chọn liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi số bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xương khớp…Trên giới, có số nguồn tế bào gốc đưa vào ứng dụng tế bào gốc tủy xương tế bào gốc máu cuống rốn, tế bào gốc từ nguồn chủ yếu tế bào gốc tạo máu nên ứng dụng nghiên cứu điều trị bệnh máu, bệnh cần có tái tạo thuộc hệ thống trung mô ứng dụng Trong đó, bệnh trung mô lại thường gặp vết thương, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác kỳ vọng nhiều tế bào gốc phôi, có tiềm lớn việc nghiên cứu sử dụng khó khăn công nghệ đặc biệt bị cản trở vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy phôi vốn trở thành người) Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác tế bào gốc từ phần phụ thai bánh rau, dây rốn Thành công công nghệ tách nhân lên tế bào gốc có bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh có hy vọng dùng nguồn tế bào gốc Hiện nay, có số lượng người lưu giữ dây rốn hay bánh rau sau sinh ra, đồng thời chi phí tốn xác suất người lưu trữ mô lại có bệnh cần điều trị tế bào gốc cao Tế bào gốc mỡ quần thể tế bào vạn năng, chúng biệt hóa thành nhiều dòng khác Mô mỡ loại mô có sẵn với số lượng lớn dễ dàng thu hồi nên nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo tương lai sử dụng để ghép tự thân đặc biệt không gặp phải vấn đề y đức Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực nhiều khâu pha tăng sinh trình liền vết thương Tế bào gốc trung mô nghiên cứu tách từ mô mỡ thành phần tế bào tách nhiều dạng tế bào khác bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định xác cần sử dụng tế bào cần thiết tế bào hỗn dịch tế bào tách đủ lần ghép điều trị vết thương Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách tinh lọc tế bào gốc trung mô Nếu tế bào gốc trung mô tách lại có tác dụng kích thích tăng sinh di cư loại tế bào chủ yếu da sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ lâm sàng định hướng cho nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học phục vụ điều trị tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt vết thương vết bỏng Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương ghép tế bào gốc lớn, cụ thể Mỹ với 260 triệu dân hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang vết thương mạn tính Hàng năm miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 người cần điều trị da nhân tạo Riêng Đức có khoảng triệu người bị loét chi phí lên tới tỷ Euro dành cho điều trị Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn bỏng [8] Tuy chưa có số thống kê cụ thể tính riêng Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị nhu cầu ghép da chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào gốc mỡ, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập tăng sinh tế bào gốc mỡ điều kiện nuôi cấy invitro Đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy nuôi cấy tế bào gốc trung mô có TGF-β1 chất có hoạt tính sinh học gọi cytokin yếu tố có vai trò đa dạng liền vết thương, bao gồm việc kích thích biểu mô, tân tạo mạch, tạo sẹo lắng đọng đệm gian bào [20] Đặc biệt, TGF-β1 kích thích di trú nguyên bào sợi [60] tế bào sừng [47] Thành phần dịch ngoại bào đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh tế bào di cư [45] Hầu hết số collagen typ I, yếu tố kết dính di cư nguyên bào sợi, tế bào sừng Kết chúng tôi, dịch chiết ngoại bào tế bào gốc mỡ có hàm lượng protein cao chứa collagen dạng hòa tan, điều góp phần làm tăng di cư tế bào sừng Trong thí nghiệm đồng nuôi cấy tiếp xúc, tác dụng ảnh hưởng tới phân bào tế bào gốc mô mỡ đồng nuôi cấy qua đĩa nuôi transwell dịch chiết ngoại bào tế bào gốc mô mỡ đạt thông qua tác động số cytokine protein đệm gian bào, xác trách nhiệm yếu tố thí nghiệm chưa làm sáng tỏ Thí nghiệm cho thấy: Mật độ tế bào sừng ngày đồng nuôi cấy thứ hai lô có tế bào gốc tăng lên so với tế bào gốc lại đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi da Nhưng thí nghiệm đánh giá di cư tế bào sừng đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ lại thấy, khả di cư chúng tốt so với đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi hay tế bào Ngày thứ 4, vết cạo gần liền hoàn toàn, khoảng cách bờ mép hẹp so với lô tế bào sừng đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi Trong lô tế bào vết cạo rộng Ngày thứ 5, vết cạo lô có tế bào tế bào gốc mô mỡ lô có nguyên bào sợi liền hoàn toàn lô tế bào loại khoảng cách rõ rệt Tổng hợp kết đây, tế bào gốc mô mỡ không làm tăng sinh mạnh tế bào sừng mô hình nuôi cấy lại làm tăng di cư làm liền vết thương in vitro tăng biệt hóa tạo lớp tế bào sừng 4.4 Chế phẩm tế bào gốc giá đỡ Thực tế, tế bào gốc mỡ chức tế bào đầu dòng cho việc tái sinh mỡ in vivo mà có khả sử dụng cho nhiều mục đích khác Giá đỡ chuyên biệt hệ thống tín hiệu cảm ứng cốt lõi cho việc biệt hóa tế bào gốc thành tế bào khác tùy theo yêu cầu mục đích sử dụng Với mục đích giải tổn khuyết mô mỡ cần giá đỡ chiều để nuôi cấy tế bào gốc mỡ Những vi chuỗi hạt collagen giá đỡ thích hợp cho tế bào gốc mỡ cho phép chúng có khả tăng sinh ex vivo biệt hóa từ mô có kích thước đủ nhỏ để tiêm [64] Người ta chứng minh mô mỡ tạo từ công nghệ mô với tế bào gốc mỡ giá đỡ collagen typ I sử dụng cho việc điều trị tổn khuyết mô [49] Điều khẳng định nghiên cứu khác gần đây, tế bào gốc mỡ có khả dính, tăng trưởng tăng sinh tốt giá đỡ collagen typ I vốn nguyên liệu có biểu tính tương hợp tế bào tuyệt vời sử dụng tá dược công nghệ mô [83] Việc nuôi cấy in vitro tế bào gốc mỡ đệm màng ối loại bỏ tế bào giá đỡ acid hyaluronic liên kết chéo mô tả Các tế bào kết dính đệm màng ối thúc đẩy khả tăng sinh khả sống, khí đó, tế bào không kết dính gel acid hyaluronic liên kết chéo lại tăng khả biệt hóa [29], [30] Altman cộng mô tả cách nuôi cấy tế bào gốc mỡ giá đỡ Fibril Chitosan cho thấy tế bào gốc mỡ người cấy dạng giá đỡ có tác dụng thúc đẩy trình liền vết thương chúng tăng biệt hóa thành nguyên bào sợi, tế bào nội mô tế bào biểu mô mô khôi phục [16] Trong nghiên cứu trước đây, cách sử dụng tế bào da tạo thành tế bào mà tế bào có liên kết với tạo thành tế bào với hỗ trợ loại giá đỡ khác Với cách thức này, tế bào có đặc tính ổn định khả sống phân chia chúng môi trường nuôi cấy labo Trong điều kiện đó, tế bào ghép lên vết thương chúng vừa có khả thực chức liền vết thương vừa có khả che phủ bảo vệ vết thương Cách thức thuận lợi cho người thực thao tác kỹ thuật chúng ghép vết thương ghép da thông thường Đối với nghiên cứu này, thiết kế nghiên cứu cấy tế bào số loại giá đỡ polymer để xác định khả tế bào gốc trung mô phát triển tốt nhằm tạo tế bào phục vụ ghép vết thương Đề tài nghiên cứu trước chế tạo thành công nguyên bào sợi cách cấy nguyên bào sợi nuôi cấy lớp màng vật liệu che phủ vết thương có chất polyurethan [6] Tuy nhiên loại tế bào khác khả bám sống chúng loại vật liệu khác Với thiết kế nghiên cứu truyền thống nghiên cứu đặc tính nuôi cấy tế bào trung mô, tiến hành thí nghiệm nhiều loại vật liệu khác nhận thấy vật liệu có chất polyurethan (tegaderm) vật liệu polymer có tráng collagen cho phép tế bào nuôi cấy bám phát triển Chúng thí nghiệm xác định khả bám, phát triển tế bào transwell Transwell loại đĩa nuôi cấy tế bào có sẵn lớp màng dễ dàng tách khỏi đĩa nuôi cấy Lớp màng có vi lỗ cho phép trao đổi dinh dưỡng không cho phép tế bào chui qua, với đặc tính lớp màng có khả che phủ vết thương Quan sát kính hiển vi đảo ngược thấy tế bào gốc trung mô nuôi cấy đĩa transwell có thời gian để tế bào bám sống sau cấy nhanh có thời gian tồn đĩa lâu Chúng thí nghiệm đến ngày thứ tế bào đĩa transwell bám tốt Thí nghiệm tiếp tục nhiều ngày thấy khả sống phát triển tế bào tốt tới ngày thứ 10-15 sau cấy Thông thường tế bào gốc trung mô phát triển đạt 100% chồng lớp lên nhau, khả tăng sinh phát triển tế bào gốc tượng biệt hóa xảy Để đảm bảo tế bào gốc mỡ tình trạng chưa biệt hóa có tốc độ nhân lên giữ nguyên, chế tạo tế bào với mật độ phủ kín bề mặt nuôi cấy 90% Số lượng tế bào đạt 90% độ che phủ xác định là: 5,3 ± 1,2 x 104/cm2 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị bỏng -Viện Bỏng Quốc Gia, thu kết rút kết luận sau: Chúng phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ - Số lượng tế bào phân lập đạt 2,46 ± 1,4x10 6TB/gram mô - Các tế bào có khả tạo colony, colony tế bào gốc mô mỡ thuộc dạng CFU-F Tỷ lệ tạo CFU-F tế bào phân lập 14,6% Sau tinh lọc tế bào đến p5, tỷ lệ tạo CFU-F 17,3% Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ có ảnh hưởng tích cực tới tế bào da nuôi cấy - Tế bào gốc mô mỡ làm tăng sinh nguyên bào sợi da nuôi cấy Ngày thứ đồng nuôi cấy TBG mô mỡ với nguyên bào sợi da số lượng NBS thu 6,8±0,5x104 tế bào/giếng 10cm2 Trong lô chứng TBG mô mỡ đồng nuôi cấy, số lượng NBS thu từ 4.6±0,6 – 5,5±0,9x10 tb/giếng 10cm2 - Tế bào gốc mô mỡ không làm tăng sinh tế bào sừng có tác động tăng di cư biệt hóa tế bào sừng điều kiện nuôi cấy Ngày thứ 5, tỷ lệ liền vết cạo đồng nuôi cấy TBG mô mỡ với tế bào sừng 98,1±4,5% Nhưng lô chứng TBG mô mỡ tỷ lệ tiền vết cạo đạt 75,0±12,4% - Tác động tích cực tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy thông qua khả sống tế bào gốc yếu tố ngoại bào KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cấy ghép TB gốc mỡ điều trị vết thương, vết bỏng Tiếp tục nghiên cứu để chế tạo sinh phẩm từ TB gốc ứng dụng điều trị vết thương, vết bỏng TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trịnh Bình, Phạm Phan Địch, Đỗ Kính (2002), Mô học, Nhà xuất y học, Hà Nội Phùng Quốc Đại, Phạm Mạnh Hùng (1997), “Sự thay đổi globulin miễn dịch bệnh nhân bỏng”, Thông tin bỏng, 2, tr 27-28 Trần Văn Hanh (1997), “Quan điểm mô học đại trình liền vết thương”, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr 141-156 Đinh Văn Hân, Nguyễn Thị Hương (2014), “Nghiên cứu chế tạo hỗn dịch tế bào da tự thân không qua nuôi cấy dể điều trị vết thương vết bỏng”, Tạp chí y học thảm học & Bỏng, 3, tr 40 - 48 Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tiến Dũng (2013) “Đánh giá tác dụng dung dịch chiết nguyên bào sợi da nuôi cấy điều trị vết thương mạn tính”, Tạp chí y học thảm hoạ & Bỏng, 2, tr 47 – 54 Nguyễn Văn Huệ, Đinh Văn Hân CS (2006), Hợp tác nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi điều trị vết thương vết bỏng, Đề tài cấp nhà nước Nghị định thư hợp tác với Liên Bang Nga Nguyễn Văn Huệ, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Hải An (2000), “Nhận xét giảm bạch cầu máu ngoại vi trẻ em bỏng nặng”, Tạp chí thông tin y dược, 10, tr 92-96 Nguyễn Viết Lượng (2009), “Tình hình bỏng Việt Nam năm 2005 -2007”, Tạp chí y học thảm hoạ & bỏng, 1, tr 26 Phạm Quang Ngọc (1990), “Màng ối đông khô diệt khuẩn tia gama dùng làm băng sinh học để điều trị vết bỏng”, Tạp chí Y học thực hành, (2)285, tr 23 10 Phạm Đình Phú (1994), “Ghép da đồng loại lần góp phần cứu sống bệnh nhân bỏng sâu diện rộng”, Thông tin bỏng, 2, tr 17 11 Nguyễn Hữu Phùng, Dương Ngọc (1994), “Sử dụng da ếch màng ối đông khô điều trị bỏng nặng”, Thông tin bỏng, 2, tr 15-16 12 Đỗ Quang, Đỗ Quang Hùng (1995), “Sử dụng lâm sàng màng ối đơn người làm băng sinh học chữa bỏng bệnh da”, Thông tin bỏng, 1, tr 16-18 13 Lê Thế Trung (2003), Bỏng kiến thức chuyên ngành, NXB Y Học 14 Trần Ngọc Tuấn, Đặng Tất Hùng (1996), “Ứng dụng ghép da mắt lưới kết hợp da tự thân với da dị loại bệnh nhân bỏng sâu diện rộng”, Thông tin bỏng, 3, tr 17-20 B Tiếng Anh 15 Akino K, Mineda T, Akita S (2005), “Early cellular changes of human mesenchymal stem cells and their interaction with other cells”, Wound Repair Regen, 13, pp 434–440 16 Altman AM, Yan Y, Matthias N, et al (2008) IFATS Series: “human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model”, Stem Cells 17 Alvarez-Diaz C, Cuenca-Pardo J, Sossa-Serrano A (2000), “Burns treated with frozen cultured human allogeneic epidermal sheets”, J Burn Care Rehabil, 21, pp 291–299 18 Armour A, Scott P.G, Tredget E.E, (2007), “Cellular and molecular pathology of HTS: basis for treatment, Wound Repair Regen, 15 (Suppl 1), S6–S17 19 Ayyappan T, Chadha A, Shaikh MF et al (2004) “Topically applied autologous bone marrow in healing of chronic non-healing raw areas-a pilot study”, Indian J Burns 2004, 12, pp 42-7 20 Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko M.S, Brem H, Tomic-Canic M (2008), “Growth factors and cytokines in wound healing”, Wound Repair Regen, 16, pp 585–601 21 Brem H, Golinko MS, Stojadinovic O et al (2008), “Primary cultured fibroblasts derived from patients with chronic wounds: a methodology to produce human cell lines and test putative growth factor therapy such as GMCSF”, Journal of Translational Medicine 75(6) 22 Chen L, Tredget E.E, Wu P.Y, Wu Y (2008), “Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing”, PLoS ONE 3, e1886 23 Clark Richard A.F (1993), “Basic of cutaneous wound repaire”, J Dermatol surg Oncol, 19(12), pp 116-122 24 Cohen I.K, Diegelman R.F, Crossland M.C, (1994), Wound care and wound healing, Sprnciples of Surgery, 1, pp 279-304 25 Diegelmann R.F, Evans M.C (2004), “Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing”, Front Biosci, 9, pp 283–289 26 Falanga V, Iwamoto S, Chartier M, Yufit T, Butmarc J, Kouttab N, Shrayer D, Carson P (2007), “Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray cceleratehealing in murine and human cutaneous wounds, Tissue Eng”, 13, pp 1299–1312 27 Falkenberg F.W, Weichert M, Krane H, Bartels I, Palme M, Nagels H.O, Fiebig H (1995), “In vitro production of monoclonal antibodies in high concentration in a new and easy to handle modular minifermenter”, J Immunol Meth, 179, pp 13–29 28 Fitzpatrick RE, Rostan EF (2003), “Reversal of photodamage with topical growth factors: a pilot study”, J Cosmet Laser Ther, 5, pp 25—34 29 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (2007) “Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adiposederived stem cells”, Biomaterials 2007, (28), pp 34-42 30 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (4/2008) “Proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds”, Biomaterials, (29), pp 1862-71 31 Friedenstein A.J, Chailakhyan R.K, Latsinik N.V, Panasyuk A.F (1974) “Keiliss-Borok, Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues Cloning in vitro and retransplantation in vivo”, Transplantation, 17, pp 331–340 32 Han S.K, Yoon T.H, Lee D.G et al (2005) “Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing in vitro”, Ann Plast Surg 2005, 55, pp 41-49 33 Hansbrough JF, Mozingo DW, Kealey GP, Davis M, Gidner A, Gentzkow GD (1997), “Clinical trials of a biosynthetic temporary skin replacement, Dermagraft- Transitional Covering, compared with cryopreserved human cadaver skin for temporary coverage of excised burn wounds", J Burn Care Rehabi 1997 Jan-Feb, 18 (1 Pt1), pp 43-51 34 Hehenberger K, Kratz G, Hansson A, Brismar K (1998), “Fibroblasts derived from human chronic diabetic wounds have a decreased proliferation rate, which is recovered by the addition of heparin”, J Dermatol Sci, 16, pp 144–151 35 Herndon D.N, Barrow R.E, Rutan R.L, Rutan T.C, Desai M.H, Abston S (1989), “A comparison of conservative versus early excision Therapies in severely burned patients”, Ann Surg, 209, pp 547–5528 discussion 552–543 36 Hu R, Ling W, Xu W, Han D (2014), “Fibroblast-Like Cells Differentiated from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells for Vocal Fold Wound Healing”, PLoS ONE 9(3): e92676 37 Humpert PM, Bastsch U et al (2005), “Locally applied mononuclesr bone marrow cells restore angiogenesis and promote wound healing in a type fiabetic patient”, Exp Clin Endocrinol Diabetes 2005, 113, pp 538-40 38 Hunt T.K (1990), “Basic principles of wound healing”, J Trauma ,30(12), pp 122-128 39 Hyoju Kim, Kyuseok Choi, Oh-Kyeong Kweon, Wan Hee Kim (2012), “Enhanced wound healing effect of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with low-level laser therapy in athymic mice”, Journal of Dermatological Science, 68, pp 149–156 40 John F Hasbrough, Hans Oliver Rennekampff (1998), “Cultured skin cell for wound closure and for promoting wound healing Growth factor and wound healing basic science and potential clinical application”, Serono Symposia USA Norwell, Massachusetts, pp 37-55 41 Jurgens WJ, Oedayrajsingh-Varma MJ, Helder MN, et al (6/2008), “Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies”, Cell Tissue Res, (26), pp 332:415 42 Khachemoune A, Bello Y.M, Phillips T.J (2002), “Factors that influence healing in chronic venous ulcers treated with cryopreserved human epidermal cultures”, Dermatol Surg, 28, pp 274–280 43 Kim W.S, Lee JJ, Jung DY, Jeon J, Heo HS, Kang HC, et al (2006), “Profiling of differentially expressed genes in human stem cells by cDNA microarray”, Mol Cells, 21, pp 343—55 44 Kiristy CP, Lynch AB, Lynch SE (1993), “Role of growth factors in cutaneuos wound healing: a review”, Crit Rev Oral Bio Med, 4, pp 729-760 45 Lauffenburger D.A, Horwitz A.F (1996), “Cell migration: a physically integrated molecular process”, Cell, 84, pp 359–369 46 Lerman O.Z, Galiano R.D, Armour M, Levine J.P, Gurtner G.C (2003), “Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia”, Am J Pathol, 162, pp 303–312 47 Li Y, Fan J, Chen M, Li W, Woodley D.T (2006), “Transforming growth factor-alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte migration”, J Invest Dermatol, 126, pp 2096–2105 48 Loots M.A, Lamme E.N, Mekkes J.R, Bos J.D, Middelkoop E (1999), “Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity (non-insulin-dependent diabetes mellitus) show disturbed proliferation”, Arch Dermatol Res, 291, pp 93–99 49 Lu F, Gao JH, Ogawa R, et al (2006 Dec), “Adipose tissues differentiated by adipose-derived stem cells harvested from transgenic mice”, Chin J Traumatol, 9, pp 359-64 50 MacNeil S (2007), “Progress and opportunities for tissue-engineered skin”, Nature 445, pp 874–880 51 Martin M.J et al (2005), “Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid”, Nat Med, 11(2), pp 228-32 52 Masakazu Ishii, Chika Koike et al (2005), “Molecular markers distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 332, pp 297–303 53 McFarlin K, Gao X, Liu Y.B, Dulchavsky D.S, Kwon D, Arbab A.S, Bansal M, Li Y, Chopp M, Dulchavsky S.A, Gautam S.C (2006), “Bone marrowderived mesenchymal stem cells accelerate wound healing in the rat”, Wound Repair Regen, 14, pp 471–478 54 Midwood K.S, Williams L.V, Schwarzbauer J.E (2004), “Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix”, Int J Biochem Cell Biol, 36, pp 1031–1037 55 Papini R (2004), “Management of burn injuries of various depths”, BMJ 329, pp 158–160 56 Pereira R.F, Halford K.W, O’Hara M.D, Leeper D.B, Sokolov B.P, Pollard M.D, Bagasra O, Prockop D.J (1995), “Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice”, Proc Natl Acad Sci USA, 92, pp 4857–4861 57 Phan TT, et al (2005), “Evaluation of cell culture on the polyurethane-based membrane (Tegaderm): implication for tissue engineering of skin”, Cell Tissue Bank, 6(2), pp 91-7 58 Phinney D.G, Prockop D.J (2007), “Mesenchymal stem/multipotent stromal cells; the state of transdifferentiation and modes of tissue repair — current views”, Stem Cells, 25, pp 2896–2902 59 Ponec M (2002), “Skin constructs for replacement of skin tissues for in vitro testing”, Adv.Drug Deliv Rev, 54 (Suppl 1), S19–S30 60 Postlethwaite A.E, Keski-Oja J, Moses H.L, Kang A.H (1987), “Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor beta”, J Exp Med, 165, pp 251–256 61 Purdue G.F, et al (1997), “A Multi-center Clinical Trial of a Biosynthetic Skin Replacement, Dermagraft-TC, Compared with Cryopreserved Human Cadaver Skin for Temporary Coverage of Excised Burn Wounds”, Journal of Burn Care and Rehabilitation, 18(1), 52-57 62 Reckhenrich A.K, Kirsch B.M, Wahl E.A, Schenck T.L, Rezaeian F, et al (2014), “Surgical Sutures Filled with Adipose-Derived Stem Cells Promote Wound Healing”, PLoS ONE 9(3): e91169 63 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, et al (2004) “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation, 109, 1292—8 64 Rubin JP, Bennett JM, Doctor JS, et al (2007 Aug), Plast Reconstr Surg, 120:414-24 65 Sasaki M, Abe R, Fuita Y, Ando S, Inokuma D, Shimizu H (2008), “Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type”, J Immunol, 180, pp 2581–2587 66 Schade R, Pfister C, Halatsch R, Henklein P (1991), “Polyclonal IgY Antibodies from Chicken Egg Yolk—An Alternative to the Production of Mammalian IgG type Antibodies in Rabbits”, Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments, ATLA, Nottingham, pp 403–419 67 Schaffer CJ, Narrey LB (1996), “Cell biology of wound healing”, Int Rev Cytol, 169, pp 151-181 68 Seibold J.R, Uitto J, Dorwart B.B, Prockop D.J (1985), “Collagen synthesis and collagenase activity in dermal fibroblasts from patients with diabetes and digital sclerosis”, J Lab Clin Med, 105, pp 664–667 69 Sheng-Ping Huang, Chun-Hsiang Huang, Jia-Fwu Shyu, Herng-Sheng Lee4, Shyi-Gen Chen, James Yi-Hsin Chan and Shih-Ming Huang (2013), “Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model”, Journal of Biomedical Science, pp 20-51 70 Sheridan R.L, Tompkins R.G (1999), “Skin substitutes in burns”, Burns 25, pp 97-103 71 Smith A.N, Willis E, Chan V.T, Muffley L.A, Isik F.F, Gibran N.S, Hocking A.M (2010), “Mesenchymal stem cells induce dermal fibroblast responses to injury”, Exp Cell Res, 316, pp 48–54 72 Supp D.M, Boyce S.T (2005), “Engineered skin substitutes: practices and potentials”, Clin Dermatol, 23, pp 403–412 73 Togel F, Weiss K, Yang Y, Hu Z, Zhang P, Westenfelder C (2007), “Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury”, Am J Physiol Renal Physiol , (292), F1626–F1635 74 Vacanti C.A, Mikos A.G (1995), Tissue Eng, 1, pp 1–2 75 Valbonesi M, Giannini G, et al (2004), “Cord blood (CB) stem cells for wound repaire”, Transfus Apher Sci 2004, 30:153-6 76 Wahl LM, Wahl SM (1992), Inflamation In: Cohen IK, Diegelmann RF, Lindblad WJ, et all Wound Healing Biochemical and Clinical Aspects, Philadelphia, PA: WB Saunders Company, pp 40-60 77 Wainwright D.J (1995), “Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns”, Burns, 21, pp 243– 248 78 Wall S.J, Sampson M.J, Levell N, Murphy G (2003), “Elevated matrix metalloproteinase-2 and -3 production from human diabetic dermal fibroblasts”, Br J Dermatol, 149, pp 13–16 79 Werner S, Richard G (2003), “Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines”, Physiol Re, 83, pp 835-870 80 Woodley D.T, Peterson H.D, Herzog S.R, Stricklin G.P, Burgeson R.E, Briggaman R.A, Cronce D.J, O'Keefe E.J (1988), “Burnwounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils”, JAMA, 259, pp 2566–2571 81 Won-Serk Kim, Byung-Soon Park, Jong-Hyuk Sung, Jun-Mo Yang, SeokBeom Park, Sahng-June Kwak, Jeong-Soo Park (2007), “Wound healing effect of adipose-derived stem cells: A critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts” Journal of Dermatological Science, 48, pp 15— 24 82 Wu Y, Chen L, Scott P.G, Tredget E.E (2007), “Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis”, Stem Cells, 25, pp 2648–2659 83 Zhang YS, Gao JH, Lu F, et al (2007 Feb), ‘‘Cellular compatibility of type collagen I scaffold and human adipose-derived stem cells”, Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 27:223-5 84 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al (2002), “Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells”, Mol Biol Cell, 13:4279—95 85 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, et al (2001), “Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies”, Tissue Eng, 7:211—28 [...]... là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xương Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng được ứng dụng rộng rãi trong sửa chữa và tái tạo mô Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thương da, chúng tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tương tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của. .. giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ bằng phương pháp đồng nuôi cấy Tế bào gốc mô mỡ được cấy trên insert chứa màng polycarbonate của đĩa transwell, màng polycarbonate có kích thước lỗ là 0,45micromet và được tráng collagen, nguyên bào sợi và tế bào sừng được cấy ở khoang phía dưới Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mỡ đến hai loại tế bào da nuôi cấy này được đánh giá qua sự tăng sinh tế bào da và khả năng. .. 2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và di cư của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng được đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các loại tế bào nhưng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán Hình 2 Mô... vào bề mặt nuôi cấy Sau đó tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh Tế bào gốc mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm 2 và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80%-90% độ che phủ Tấm tế. .. mô mỡ Tế bào gốc mô mỡ được xác định là tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô lần đầu tiên được mô tả là dạng tế bào từ tủy xương có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy [31] mà có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn và tế bào xương [56] Sau đó , chúng được xác định là có mặt ở rất nhiều mô cơ quan khác nhau như cơ, não, và mô mỡ [52] Ngày nay, tế bào gốc trung mô từ tủy xương và. .. bào gốc mô mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào xương, tế bào tiết insulin, tế bào sụn [45], [84], [85] Tác giả Xu W (9-2014) đã biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào dạng nguyên bào sợi để điều trị vết thương ở thanh quản [36] Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế. .. loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm sàng, một số tế bào được nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là: Tế bào sừng (Keratinocyte) Trong vài thập niên trở lại đây, cấy ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy đã được triển khai tại các trung tâm điều trị bỏng lớn ở Anh, Mỹ, Nhật Việc cấy ghép tế bào sừng lên vết thương. .. nghiên cứu thiết lập quy trình chuẩn và có hiệu quả tách tế bào cao nhất, các tế bào cần được tinh lọc và thể hiện tính gốc như khi chúng tồn tại trong cơ thể người Việc đánh giá tác động của nguồn tế bào gốc sau khi tách tới sự tăng sinh và di cư của cả 2 loại tế bào da gồm nguyên bào sợi và tế bào sừng là cơ sở tiếp tục cho việc định hướng và chế tạo chế phẩm điều trị vết thương trong tương lai Tế. .. tế bào trong điều trị vết thương vết bỏng, các tấm tế bào da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt nhiều kết quả tốt góp phần cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện rộng hoặc tổn thương khuyết da rộng hoặc những bệnh nhân vết thương mạn tính lâu liền Viện Bỏng Quốc Gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương và vết bỏng Tuy nhiên, việc nuôi. .. cư của chúng theo cách thức mô tả dưới đây 2.2.5.1 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104 TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm DMEM/1%FBS/1%AB Nguyên bào sợi được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh Tế bào MSC được cấy