ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    - NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Tú PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trịnh Hồng Thái, người thầy quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập thực luận văn Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, nhận giúp đỡ TS Đỗ Minh Hà anh chị, bạn sinh viên làm việc Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên Tôi xin chân thành cảm ơn Trong q trình thực luận văn, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội Tơi xin chân thành cảm ơn Trong q trình học tập thực luận văn, Ban lãnh đạo bạn bè đồng nghiệp Bệnh viện 19-8 tạo điều kiện cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên ln bên suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Học Viên Nguyễn Thị Ngọc Tú MỤC LỤC Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ bp Base pair (cặp bazơ) CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt tiến triển mãn) cs Cộng DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng biến tính hiệu cao) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid KSS Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre) LHON Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) LS Leigh syndrome (Hội chứng Leigh) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với biểu tương tự đột quỵ) MERRF Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co giật có sợi đỏ nham nhở) mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể) NARP Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, điều hịa thối hóa võng mạc) ND3 NADH dehydrogenase PCR Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng) SDS Sodium dodecyl sulfate SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ TBE Tris borate EDTA TNM Tumor−Node−Metastasis Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ DANH MỤC CÁC BẢNG Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ DANH MỤC CÁC HÌNH Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ MỞ ĐẦU Ty thể bào quan phổ biến tế bào nhân chuẩn Ty thể coi trung tâm lượng tế bào, diễn trình chuyển hóa hợp chất hữu thành lượng mà tế bào sử dụng ATP Ngồi ra, ty thể cịn đóng vai trị quan trọng nhiều q trình chuyển hóa khác apoptosis (q trình tự chết tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển trình trao đổi chất tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] Cho đến nay, người ta thống kê 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác ADN ty thể định Các bệnh rối loạn ADN ty thể thường biểu đa dạng, chúng liên quan đến rối loạn q trình mã hóa protein đơn đột biến thay đổi nucleotide [57] Trong vài năm trở lại đây, rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể xem mục tiêu nghiên cứu di truyền học y học Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể thị sinh học phát triển nhanh chóng nhiều lĩnh vực khác liên quan đến bệnh chuyển hóa gặp, lão hóa, xác định đặc tính di truyền quần thể sử dụng dấu chuẩn di truyền mẹ… Trong số lĩnh vực phải kể đến ung thư – đề tài thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Ung thư đại trực tràng loại ung thư phổ biến giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản nam giới ung thư vú nữ giới Trên giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp phát [79] Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng chiếm tỷ lệ cao, đứng thứ hai tỷ lệ mắc bệnh ung thư đường tiêu hóa, đứng sau ung thư dày Để đạt hiệu điều trị tốt bệnh nhân cần chẩn đoán sớm tốt Với phát triển khoa học, ngày Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ nghiên cứu mức độ phân tử, có nghiên cứu đột biến ADN ty thể, ngày góp phần vào cơng tác chẩn đốn điều trị bệnh có hiệu Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng” với mục đích: − Phát đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng kỹ thuật PCR-RFLP − Đánh giá mối liên quan đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng người Việt Nam Đề tài thực phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ 59 Taniike M and Yanagihara F H (1992), "Mitochondrial tRNA(Ile) mutation in fatal cardiomyopathy", Biochemical and Biophysical Research Communications, 186, pp 47-53 60 Taylor R W and Turnbull D M (2005), "Mitochondrial DNA mutations in human disease", Nature Reviews Genetics, 6, pp 389-402 61 Theodoratou E., Din F V N., and Farrington S M (2006), "Association between comon mtDNA variants and all-cause or colorectal cancer mortality", Carcinogenesis, 31, pp 296-301 62 Torroni A., Schurr T G., and Cabell M F (1993), "Asian affinities and continental radiation of the four founding Native American mtDNAs", The American Journal of Human Genetics, 53(3), pp 563-590 63 Tseng L M et al (2006), "Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in breast cancer", Genes, Chromosomes and Cancer, 45, pp 629-638 64 Tuppen H A., Blakely E L., and Turnbull D M (2010), "Mitochondrial DNA mutations and human disease", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Bioenergetics, 1797(2), pp 113-128 65 Van der Walt J M et al (2004), "Analysis of European mitochondrial haplogroups with Alzheimer disease risk.", Neuroscience Letters., 365(1), pp 28-32 66 Van der Walt J M., Nicodemus K K., and Martin E R (2003), "Mitochondrial Polymorphisms Significantly Reduce the Risk of Parkinson Disease", The American Journal of Human Genetics, 72(4), pp 804-811 67 Wallace D C and Lott M T (2002), Mitochondrial Genes in Degenerative Diseases, Cancer, and Aging, London, Churchill Livingstone 68 Wallace D C et al (1988), "Mitochondrial DNA mutation accociated with Leber's hereditary optic neuropathy", Science, 242(1427-1430) 73 Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ 69 Wang Y., et al (2006), "Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression", British Journal of Cancer, 95, pp 1087-1091 70 Warburg O (1930), "The metabolism of tumors", London Constable Co Ltđ 71 Webb E., Broderick P., and Chandler I (2008), "Comprehensive analysis of common mitochondrial DNA variants and colorectal cancer risk", British Journal of Cancer, 99, pp 2088-2093 72 Wu C W et al (2005), "Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer", Genes, Chromosomes and Cancer 44, pp 19-28 73 Ye C., Shu X., and Wen W (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Research Treatment 108, pp 427-434 74 Yeh J J., Lunetta K L., and van Orsouw N J (2000), "Somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in papillary thyroid carcinoma and differential mtDNA sequence variants in case with thyroid tumour", Oncogene, 19, pp 2060-2066 Tài liệu World wide web 75 http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Code4.html 76 http://suckhoedoisong.vn/201012280936443p0c44/khong-chu-quan-voidau-hieu-ban-dau.htm 77 https://www.c3life.com/ostomy/ostomybasics/colorectal-cancer/ 78 http://www.medicinenet.com/colon_cancer/article.htm 79 http://www.cancer.gov/cancertopics/types/colon-and-rectal 74 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân đặc điểm lâm sàng Bệnh viện K, Tam Hiệp ST T Mã số 8702 10200 Tuổi Giới tính Vị trí khối u Kích thước u (cm) Số hạch Kích thước hạch (cm) Vị trí hạch Kiểu ung thư Lê Văn S 31 Nam Trực tràng 4x5cm 1.5 Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến Dương Thị H 58 Nữ Trực tràng Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + Nguyễn Sỹ V 73 Nam Trực tràng 6x7cm 1-1.2 Ung thư biểu mô tuyến + 0.5-1 Họ tên 9802 Lê Tất L 26 Nam Đại tràng 2x2.5c m Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến 9807 Nguyễn Thị V 87 Nữ Đại tràng 8x10cm 11 Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến 10489 Đỗ Văn C 54 Nam Đại tràng 2x2cm Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến 8619 Nguyễn Tiến Ư 60 Nam Đại tràng 4x5cm Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến 10517 Triệu Thị T 44 Nữ Trực tràng 2x2.5c m Gần trực tràng 10597 Hoàng Thị Q 51 Nữ Đại tràng 4x4.5c m 10 10600 Nguyễn Thị T 48 Nữ Trực tràng 3x4cm 0.5 75 Ổ sùi loét TNM Mức độ biệt hóa Đa hình A10398G T3N1M A T2N0M A A T1N0M G T4N1M G T1N0M G T3N1M A Ung thư biểu mô tuyến T1N0M G Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T3N1M0 Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N0M + + G G 11 10608 Ninh Thị C 46 Nữ Trực tràng 2.5x4c m Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N0M G 12 10611 Bùi Công H 71 Nam Đại tràng 3.5x4c m 11 Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N1M G 13 10626 Nguyễn Duy A 54 Nam Đại tràng 2x6cm Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T3N1M A 14 10731 Lê Thu P 63 Nữ Đại tràng 3.5x4c m Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N0M G 15 10740 Ngũ Thanh H 42 Nữ Trực tràng 2.5x3c m Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + T2N0M G 16 10774 Phạm Văn T 57 Nam Trực tràng 2.5x2c m Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + T2N0M G 17 11777 Nguyễn Thị T 71 Nữ Trực tràng 3x4cm 0.5-1 Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến T3N0M A 18 11781 Dương Văn T 57 Nam Trực tràng 2.5x3c m 0.5-0.8 Ung thư biểu mô tuyến + T2N0M A 19 11803 Cao Ngọc T 48 Nam Trực tràng 4x6cm 11 0.5-1.2 Ung thư biểu mô tuyến + T3N1M A 20 11812 Nguyễn Trung T 57 Nam Trực tràng 4x6cm 0.5x0 Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + T3N0M G 21 11822 Cao Xuân V 49 Nam Trực tràng 2.5cm 0.4 Gần trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + T2N0M G 22 10282 Nghiêm Thị M 74 Nữ Đại tràng 3x4cm Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N0M A 23 8276 Vũ Quang N 63 Nam Đại tràng 4x5cm Ung thư biểu mô tuyến T2N1M A 24 16678 Phạm Vĩnh B 75 Nam Trực tràng 4x6 25 16756 Nguyễn Văn T 55 Nam Đại trực 0.5-1 76 + Ung thư biểu mô tuyến - T1N2M0 Kém G Ung thư biểu - T2N1M0 Vừa G tràng mô tuyến 26 16675 Đào Tiến L 51 Nam Đại trực tràng 3x4 Ung thư biểu mô tuyến + T1N0M0 27 16689 Trần Văn T 61 Nam Trực tràng 2x2.5 Ung thư biểu mô tuyến + T1N1M0 28 16890 Chu Thị C 68 Nữ Trực tràng Ung thư biểu mô tuyến - 29 16714 Trần Thị T 48 Nữ Trực tràng Ung thư biểu mô tuyến + T2N0M0 30 16723 Lê Đình H 56 Nam Đại tràng Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến + T1N2M0 A 31 8614 Lê Thị Y 55 Nữ Đại tràng Gần đại tràng Ung thư biểu mô tuyến T2N0M0 A 3x3.5 2.5x3 3 2x3 0,5-1 G Vừa G G T2N1M0 Vừa A Bệnh viện Việt Đức ST T Mã 32 2903 33 Kiểu ung thư Ổ sùi loét TNM Mức độ phân hóa Đa hình A10398G Ung thư biểu mơ tuyến + T3N0M0 Cao G 5x4 cm Ung thư biểu mô tuyến T3N1 Vừa A Trực tràng x3cm Ung thư biểu mô tuyến T4NoM Vừa G Nam Đại tràng 4x5x3 cm Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Cao A Nam Đại tràng 5x3 cm Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa A Tuổ i Giới tính Vị trí u Kích thước u Số hạch Nguyễn Văn S 71 Nam Đại tràng 6x8 cm 3035 Nguyễn Thị M 61 Nữ Trực tràng 34 3161 Đỗ Thị H 36 Nữ 35 3352 Nguyễn Viết Q 95 36 3372 Nguyễn Khắc Q 63 Họ tên Kích thước hạch 77 Vị trí hạch + 37 3558 Nguyễn Hữu Đ 42 Nam Trực tràng 3x2 cm Ung thư biểu mơ tuyến 38 3753 Hồng Thị T 54 Nữ Đại tràng 5x3 cm 39 X749 Nguyễn Thị N 64 Nữ Trực tràng 40 X748 Nguyễn Thị M 59 Nữ 41 X783 Đào Công H 55 42 X782 Nguyễn Thị T 43 3822 44 T4N0M0 Cao A Ung thư biểu mô tuyến T2N0 Vừa A 8x5 cm Ung thư biểu mô tuyến T4N0M0 Vừa A Đại tràng 7x6 cm Ung thư biểu mô tuyến T1N1M1 Cao G Nam Đại tràng 3x4 cm Ung thư biểu mô tuyến + T3N0M0 Cao A 60 Nữ Đại tràng 3x3.5 cm Ung thư biểu mô tuyến + T3N0M0 Vừa A Đỗ Thị H 26 Nữ Đại tràng 9x6 x6 cm Ung thư biểu mô tuyến T4N2M o Vừa G 3825 Đinh Văn G 53 Nam Trực tràng 4x3 Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa G 45 3905 Nguyễn Thị T 80 Nữ Trực tràng 4x3 Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa A 46 3906 Nguyễn Thị T 65 Nữ Đại tràng 10x8x6 cm Ung thư biểu mô tuyến T4N0 Vừa A 47 4101 Nguyễn Thị X 53 Nữ Đại tràng 6x4 cm Ung thư biểu mô tuyến T4N1 Vừa G 48 4120 Đỗ Thị V 51 Nữ Trực tràng cm Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa G 49 4297 Phạm Văn T 43 Nam Đại tràng 10x8 cm Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa A 50 4374 Đoàn Thị R 46 Nữ Ung thư biểu mô tuyến T3N0 Vừa G 51 4463 Nguyễn Văn M 53 Nam Ung thư biểu T4N1M0 Vừa A Trực tràng Đại tràng 6x4 cm 78 + + mô tuyến 52 4475 Nguyễn Thị G 76 Nữ Trực tràng 53 4539 Hồng Đình X 79 Nam Đại tràng 54 4595 Trịnh Thị N 51 Nữ Đại tràng 55 4603 Trần Văn V 46 Nam Trực tràng 56 4620 Ngô Thị H 35 Nữ Đại tràng 57 4644 Hoàng Hữu T 55 Nam Trực tràng 58 4779 Nguyễn Văn N 51 Nam Đại tràng 59 4833 Nguyễn Thị P 59 Nữ Đại tràng 60 4841 Cà Thị V 68 Nữ Trực tràng 61 4942 Nguyễn Thị C 58 Nữ Đại tràng 3x1 cm 6x5 cm 2x1 Ung thư biểu mô tuyến + T4N1M0 Ung thư biểu mô tuyến + T3N1 A Ung thư biểu mô tuyến + T4N2M0 G Ung thư biểu mô tuyến + T3N0 G Ung thư biểu mô tuyến + T4N0 Ung thư biểu mô tuyến Kém Vừa G A T4N1 G G Ung thư biểu mô tuyến + T3 Ung thư biểu mô tuyến + T3N0M0 Cao A Ung thư biểu mô tuyến + T3N0 Vừa G Ung thư biểu mô tuyến + T3N1 79 G Phụ lục Kết giải trình tự đoạn 10398 80 81 82 83