ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS BS Trần Huy Thịnh PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội hết lòng tạo điều kiện để học tập tốt đạt thành ngày hôm Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Thịnh, Phó trưởng Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ bảo cho trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, toàn thể nhân viên Trung tâm tạo điều kiện giúp đỡ cho trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Khoa Xét Nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, anh chị em Khoa giúp đỡ cho trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn Và cuối xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình người bạn bên động viên, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2015 Dương Thị Giang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CYP Cytochrome P450 CYP21 Cytochrome P450 21(steroid 21- hydroxylase) DNA Deoxyribonucleic acid DOC Deoxycorticosterone E Exon I Intron Ig2 Đột biến điểm intron 2( 656A/C →G) HLA Human leukocyte antigen KCĐ Không cổ điển MM Mất muối MHC Major histocompatibility complex MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification NHĐT Nam hóa đơn PCR Polymerase Chain Reaction Stop codon Mã kết thúc TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh 3β- HDS 3β- hydroxysteroid dehydrogennase 17-OHP 17 – hydroxyprogesteron 21-OH 21- hydroxylase ∆8bp Mất 8bp exon MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát bệnh TSTTBS 1.2 Vài nét tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS Việt Nam 1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh .7 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh TSTTBS 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS .9 CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS .11 2.1 Cơ sở phân tử bệnh TSTTBS 11 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen CYP21 11 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS .12 2.2 Đặc điểm di truyền bệnh TSTTBS .14 2.3 Biểu lâm sàng, cận lâm sàng người mang gen dị hợp tử 15 2.4 Phát người lành mang gen bệnh 16 CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 17 3.1 Chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 17 3.1.1 Chẩn đoán xác định 17 3.1.2 Chẩn đoán phân biệt .17 3.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 19 3.2.1 Kỹ thuật PCR 19 3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) .20 3.2.3 Kỹ thuật Souther blot 21 3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 21 CHƯƠNG 25 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu .25 2.2.1 Dụng cụ trang thiết bị 25 2.2.2 Hoá chất 25 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.4 Đạo đức nghiên cứu .27 2.5 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang .27 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 28 Chương 34 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Kết tách chiết DNA 34 3.2 Kết phát đột biến gen bệnh nhân phát người lành mang gen bệnh 36 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH giới .8 Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35], [39] .13 Bảng 1.3 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) 23 Bảng 3.1 Các thành viên gia đình bệnh nhân 36 Bảng 3.2 Kiểu đột biến gen bệnh nhân thành viên gia đình 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận thiếu hụt enzym [35] .8 Hình 1.2 Nhiễm sắc thể số vị trí gen CYP21 [19] .11 Hình 1.3 Cấu trúc phân tủ gen CYP21 [18] 12 Hình 1.4 Quy luật di truyền gen lặn NST thường .14 Hình 1.5 Phả hệ gia đình có bị bệnh di truyền lặn NST thường (Autosome Recessive) 15 Thế hệ I, II, người bị bệnh, hệ III có người bị bệnh .15 Hình 1.6 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH thể bệnh người mang gen dị hợp tử [36] .16 Hình 1.7 Các bước kỹ thuật PCR 20 Hình 1.8 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 22 Hình 1.9 Sơ đồ vị trí số probe Kit MLPA P050B2 24 Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kết MLPA 24 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28 Hình 2.2 Sơ đồ vị trí số probe Kit MLPA P050B2 [4] 31 Hình 3.1 Kết kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm 34 Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số .35 Hình 3.3 Phả hệ gia đình số 01 39 Hình 3.4 Kết MLPA gia đình mã số 01 .40 Hình 3.5 Phả hệ gia đình số 02 41 Hình 3.6 Kết MLPA gia đình mã số 02 42 Hình 3.7 Phả hệ gia đình số 03 43 Hình 3.8 Kết MLPA gia đình mã số 03 44 Hình 3.9 Phả hệ gia đình số 04 45 Hình 3.10 Kết MLPA gia đình mã số 04 46 Hình 3.11 Phả hệ gia đình số 05 .47 Hình 3.12 Kết MLPA gia đình mã số 05 49 Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 50 Hình 3.14 Kết MLPA gia đình mã số 06 51 MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) bệnh gây giảm hoàn toàn năm enzym tham gia vào trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận; đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp chiếm tỷ lệ 90 - 95%, thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm - 9%, lại thể bệnh gặp thiếu hụt 3β-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase 20, 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền đơn gen lặn, nhiễm sắc thể thường đột biến gen CYP21A2 gây nên Đối với thể nặng, bệnh không chẩn đoán sớm điều trị thích hợp dẫn đến suy thượng thận cấp bệnh nhân tử vong Các thể bệnh khác dẫn đến nam hóa trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai; bệnh ảnh hưởng nặng nề đến phát triển thể chất, chức sinh sản, tâm lý người bệnh gia đình [6] Sự phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… phát hầu hết đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, dạng đột biến đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% trường hợp [25] Nhiều nghiên cứu tìm thấy mối tương quan kiểu gen kiểu hình bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh cách xác định đột biến đặc trưng thể bệnh Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng như: đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây thể bệnh nặng hay gặp thể muối Đột biến sai nghĩa I172N làm giảm hoạt tính enzym 21hydroxylase - 2% so với bình thường gặp thể nam hoá đơn hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase 20 - 50% so với bình thường gặp thể bệnh không điển hình Xác định xác dạng đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm tác động việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase bệnh nhân Bên cạnh việc xác định người lành mang gen cung cấp thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh giúp giảm tỷ lệ sinh đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý chăm sóc tốt trẻ có nguy cao bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh cộng đồng Các đột biến đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, dạng đột biến gây thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán xác kịp thời Tuy nhiên, dạng đột biến khó xác định kỹ thuật PCR thông thường Gần đây, kỹ thuật MLPA phương pháp với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản độ nhạy cao phát xác dạng đột biến gen CYP21A2 Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA chưa khai thác nhiều Việt Nam, đặc biệt việc xác định người lành mang gen gây bệnh di truyền Chính nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen cung cấp thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh, tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH Hình 3.12 Kết MLPA gia đình mã số 05 Hình ảnh (hình 3.12) phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 người bình thường, phân tích kết người bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với người bình thường, người mẹ có đỉnh exon 1/2 người bình thường, từ kết bệnh nhân bố mẹ bệnh nhân chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kết hợp xóa đoạn từ exon đến exon đột biến điểm I172 (probe exon thiết kế để phát đột biến I172N), người bố mang gen dị hợp tử xóa đoạn từ exon đến exon 3, người mẹ mang gen dị hợp tử I172N Phân tích thêm hình ảnh MLPA em trai em gái bệnh nhân thấy em trai bệnh nhân hoàn toàn bình thường, em gái bệnh nhân mang đột biến tương tự bệnh nhân 49 Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS06: Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 Ở hệ thứ có gái 18 tháng, mang đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon với kiểu hình muối Bố 30 tuổi mẹ 28 tuổi Anh trai tuổi biểu bệnh Trong phả hệ không bị bệnh giống bệnh nhân 50 Kiểu gen gia đình số 06 Hình 3.14 Kết MLPA gia đình mã số 06 Hình ảnh phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy 51 người bình thường xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 người bình thường, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết người bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố bệnh nhân người mang gen bệnh, hình ảnh MLPA người mẹ bệnh nhân cho thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thường, chứng tỏ mẹ đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 52 KẾT LUẬN Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- exon 1- bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử Các bệnh nhân lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- dị hợp tử xóa đoạn exon 1- Ở nhóm bố mẹ thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái), phát 4/6 người bố mang gen 5/6 người mẹ mang gen, em gái bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thúy Giang (2008), Nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hưởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh viện Nhi trung ương, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội Triệu Quốc Khánh (2004), Nghiên cứu nhận thức bố mẹ bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội Võ Thị Kim Huệ (2000), Góp phần nghiên cứu chẩn đoán điều trị bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21- hydroxylase trẻ em, Luận án Tiến sĩ khoa học Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Trần Kiêm Hảo (2007), Xác định số đột biến CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21- hydroxylase phát người lành mang gen bệnh, Luận án Tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Phương Mai, Lý Thanh Hà, Nguyễn Mai Hương cộng (2008), “Xét nghiệm di truyền chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57(4), tr 259 - 264 Thái Thiên Nam (2001), Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thượng thận bẩm sinh so thiếu enzym 21-hydroxylase trẻ em, Luận văn Thạc sỹ y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội Thái Thiên Nam, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thương Lan (2002), “Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzyme 21-hydroxylase trẻ em gia đình trẻ bị bệnh viện Nhi”, Nhi khoa; tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thu Nhạn (1994), “Dậy sớm”, Cẩm nang điều trị Nhi khoa Nhà xuất Y học, tr 245 - 246 54 Nguyễn Thu Nhạn, Cao Quốc Việt, Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Thị Hoàn, Trần Thị Hòa (1991), “Bệnh rối loạn nội tiếtchuyển hóa di truyền viện bảo vệ sức khỏe trẻ em”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 10 năm (1981 – 1990), tr 66 - 75 10 Nguyễn Thị Phượng (1996), “Đặc điểm di truyền hội chứng sinh dục thượng thận”, Di truyền học ứng dụng, tr - 11 Nguyễn Thanh Thúy (2010), “Sử dụng kỹ thuật PCR lồng phát AND thai từ huyết mẹ ứng dụng chẩn đoán trước sinh”, Tạp chí thông tin Y – Dược Số đặc biệt chào mừng ngày gặp mặt liên viện hàng năm giảng dạy nghiên cứu miễn dịch học lần thứ 20, tr 41 - 45 12 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 13 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, tr 28 - 32 Tiếng Anh 14 Aysha H Khan, Muniba Aban, Jamal Raza (2011), “Ethnic disparity in 21 – hydroxylase gene mutations identified in Pakistani congenital adrenal hyperplasia patients”, BMC Endocrine Disorders, Biomed central, pp.1 - 13 15 Angel O K Chan, But M W (2011), “Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients”, Steroids, 76, pp 1057 - 1062 16 Amor M, Parker K.L, Globerman H, New M.I, White P.C (1998), “Mutation in the CYP21B gene (I12172→Asn) cause steroid 21- hydroxylase deficiency”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 1600 - 1604 17 Book C G D (2000), “Antenatal Treatment of a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia”, Archive Disease Children Fetal Neonatal Ed, 82, pp 176 - 181 55 18 Dorr HG, Sippell WG (1993), “Prenatal dexamethasone treatment in pregnancies at rick for congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency: effect on midgestational amniotic fluid steroid levels”, J Clin Endocrinol Metab 76(1), pp 117 - 120 19 Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi, (2010), “Novel deletion alleles carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazilian patients with 21hydroxylase deficiency”, BMC medical Genetics 20 Fibkielstain P.G, Chen W, Mehta P.S (2010), "Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency" J Clin Endocrinol Metab, 96 (1), pp 161 - 172 21 Forest G Maguelone (2004), “Recent advances in the diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, Human Reproduction, Vol 10, No6, pp 469 - 485 22 Gelehrter T.D, Collin F.S (1990), Principles of Medical Genetics, William and Wilkins, pp 299 - 312 23 Ghizzoni Lucia, Marco Cappa (2011), “Relationship of CYP21A2 genotype and serum 17 – hydroxyprogesterone and cortisol levels in a large cohort of Italian children with premature pubarche”, European Journal of Endocrinology, 165, pp 307 - 314 24 Higashi Y, Yoshioka H, Yamane M, Gotoh O, Fuji – K.Y (1986), “Complete Nucleotide Sequence of Two Steroid 21- Hydroxylase Genes Tandemly Arranged in Human Chromosome: A pseudogene and A Genuine Gene”, Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp 2841 - 2845 25 Juan Tian, Guohua Yang (2011), “Molecular diagnosis of two families with classic congenital adrenal hyperplasia”, Gene No, pp 368 - 89 26 Keegan C E, Killeen A A (2001), “An Overview of Molecular Diagnosis of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal of Molecular Diagnostics, 3(2), pp 49 - 53 56 27 Koppens P.F.J (2002), “Molecular genetics and epidemiology of steroid 21hydroxylase deficiency origin of disease- causing mutations”, Optima grafische communicate, Rotterdam, The Netherland 28 Larsen et al (2003), Congenital Adrenal Hyperplasia, Williams textbook of Endocrinology10th ed, pp 458 - 513 29 Levine L.S (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia”, Pediatrics in Review, 21 (5), pp 159 - 169 30 Marie I New (1998), “Diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasiase”, Annul Rev Med, 49, pp 311 - 328 31 New M.I, Carlson A, Obeid J, Marshall I, Cabrera M.S (2001), “Prenatal Diagnosis for Congenital Adrenal Hyperplasia in 532 Pregnancies”, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 86 (12), pp 5651 - 5657 32 Nike M M L Stikkelbroeck (2003), “CYP21 Gene Mutation Analysis in 198 Patients with 21 – hydroxylase Deficiency in the Netherlands: Six Novel Mutations and a Specific Cluster of Four Mutations”, Jounal Clin Endocrinol Metab, 88, pp 3852 - 3859 33 Nils Krone, Felix G (2005), “Functional Characterization of Two Novel Point mutations in the CYP21Gene causing simple virilizing forms of congenital Adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism, 90(1), pp 445 - 454 34 Paola Concolino (2009), “Multiplex ligation – dependent probe amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia: First technical report”, Clinical Chimica Acta, 402, Elsevier B.V, pp.164 - 170 35 Paulino.L.C (1999), “Mutation distribution and CYP21/C4 locus variability in Brazilian families with the classical form of 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal Acta Pediatric, 88, pp 275 - 283 36 Speiser P W (2005), “The Genetics of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, The Endocrinologist, 15 (1), pp 37 - 41 57 37 Speiser P.W (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency”, Endocrine Reviews, 21(3), pp 245 - 291 38 Theodoropoulou M, Barta C, Szoke M, Staub M, Ja’nos S, (2001), “Prenatal Diagnosis of Steroid 21- Hydroxylase Deficiency by Allene – Specific Amplification”, Fetal Diagnosis and Therapy, 16, pp 237 - 240 39 Vu C.D, Bui P.T, Kate Armstrong (2010), Growing numbers of children with CAH in Vietnam, Abstract submitted for 6th Congress of APPES 40 Zuzana Vrzalova (2011), “Chimeric CYP21A1P/CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia”, European Journal of Medical Genetics, No 54 pp 112 - 117 41 White P.C., Grossberger D, Onufer B.J, Chaplin D.D, Dupont B, (1985), “Two genes Encoding Steroid 21- Hydroxylase Are Located Near The Genes Encoding the Fourth Component of Complement in Man”, Proc Natl Acad Sci USA, 82 pp 1089 - 1093 58 PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH Triệu chứng suy thượng thận cấp thiếu hụt Cortisol Aldosteron - Trẻ nôn nhiều, nôn tự nhiên không liên quan đến bữa bú, kèm theo ỉa chảy - Do nôn nhiều trẻ bị nước, da nhăn nheo, sụt cân, mặt hốc hác, mắt trũng, - môi khô Xạm da, đặc biệt phận sinh dục Trẻ tình trạng sốc: Da vân tím, mạch nhanh nhỏ khó bắt, huyết áp tụt, loạn nhịp tim Trong trường hợp trẻ bị chẩn đoán nhầm với tiêu chảy cấp nước, viêm ruột hoại tử bệnh nhiễm trùng - khác Rối loạn điện giải nặng: Na+ giảm, Cl- giảm, K+ tăng cao 5,2 mEq Không xử lý kịp trẻ tử vong trụy mạch ngừng tim Triệu chứng nam hóa tăng Testosteron - Ở trẻ trai: dương vật to, dài so với tuổi, vùng bìu thâm, tinh hoàn bé tương đương với tuổi - Ở trẻ gái: bị nam hóa, âm vật phì đại dương vật, nên có trẻ sinh tưởng nhầm trai Hai môi lớn dính vào nhau, nhìn trông giống bìu, tinh hoàn Trong trường hợp trẻ bị khai sinh nhầm trai * Thể nam hóa đơn Biểu lâm sàng chủ yếu cường Testosteron gây nam hóa - Trẻ trai: Dậy sớm giả, dương vật to, dài so với tuổi thể tích tinh hoàn bé tương đương với tuổi bệnh nhân, không tương xứng với dương - vật Mọc lông sinh dục sớm Trẻ gái: Âm vật phì đại trông dương vật Âm vật phì đại chia theo typs Prader Hai môi lớn dính nhau, trông giống bìu Không có tinh hoàn khám lâm sàng kiểm tra siêu âm Phải làm xét nghiệm nhiễm sắc thể xác định giới tính xác nữ với Karyotyp 46.XX - Tốc độ lớn nhanh, bắp phát triển trông trẻ lực lưỡng Tuổi xương sớm so với tuổi thực xương đóng sớm nên đến tuổi dậy trẻ thấp so với trẻ lứa tuổi khác - Giọng ồm, mọc trứng cá, mọc lông sinh dục sớm so với tuổi Triệu chứng xét nghiệm - Xét nghiệm máu - Cortisol máu giảm - Aldosteron giảm - Testosteron tăng cao >1 nmol/l - Progesteron, 17- OH prgesteron tăng cao > 6.0 nmol/l - Điện giải đồ rối loạn: Na+ < 130 mEq/l, Cl- giảm, K+ tăng cao > mEq/l - Định lượng enzym 21- hydroxylase thiếu hụt có giá trị chẩn đoán đặc hiệu - chưa làm Xét nghiệm giải trình tự gen MLPA để tìm đột biến gen CYP21A2 PHỤ LỤC Điều trị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Nguyên tắc điều trị Tăng sản thượng thận thận bẩm sinh bệnh điều trị liệu pháp thay hormon thiếu hụt suốt đời, giúp ức chế hormon Testosteron, tùy theo thể lâm sàng khác nhau, dùng thuốc khác Bệnh cần phát sớm, điều trị sớm tránh tử vong cho trẻ đưa trẻ sống bình thường Điều trị cụ thể suy thượng thận cấp + Thay hormon thiếu hụt: *Cortisol: thường dùng Hydrocortison 30- 50 mg/m Prednisonlon 15- 30 mg tiêm tĩnh mạch chậm, chia hai lần ngày * DOCA DCA mg/ống tiêm bắp sâu hàng ngày Khi trẻ hết nôn, hết nước, ăn uống bình thường không tiêm Chuyển sang uống Hydrocortison viên 10mg với liều 15- 25 mg/m da Uống Florinef viên 0,1 mg với liều 0,005- 0,15 mg/ 24 + Truyền dịch: muối 0/00, đường 5% theo tỷ lệ 1:1, sau có kết điện giải đồ bù theo điện giải đồ, đến Na + tăng, K+ giảm bình thường, trẻ không nôn, hết nước + Nếu K+ tăng cao, phải xử trí cấp cứu tiêm Gluconate Canxi 0,5g theo đường truyền tĩnh mạch + Chống nhiễm toan chuyển hóa Bicarbonate 14% theo kết khí máu Điều trị trì suốt đời - Hydrocortison 10 - 25 mg/ m2/ ngày, dạng viên 10 mg uống lúc no Nếu Hydrocortison dùng Prednisolon mg/24 viên uống lúc no - Florinef viên 0,1 mg; 0,05 - 0,15 mg/ngày cho thể muối Uống thêm nước muối đường hàng ngày với lượng Na+ - mmol/l/ngày Nếu có yếu tố sang chấn nhiễm khuẩn, chấn thương, tăng liều Prednisolon Hydrocortison - lần trước đưa trẻ đến bệnh viện Phẫu thuật tạo hình cho trẻ gái Nếu bệnh nhân gái sau điều trị nội khoa ổn định cần phải mổ phẫu thuật chỉnh hình cắt bỏ âm vật phì đại, tạo hình niệu đạo Trước mổ hai thì, mổ Phẫu thuật từ tháng tuổi giúp cải thiện tình trạng tâm lý cho bệnh nhân gia đình cải thiện chức sinh dục, sinh sản cho bệnh nhân sau PHỤ LỤC QUY ƯỚC CÁC KÝ HIỆU SỬ DỤNG TRONG SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO QUI ĐỊNH CỦA HỘI DI TRUYỀN NGƯỜI QUỐC TẾ Nam, nữ không bị bệnh Người mang gen dị hợp tử di truyền liên kết giới tính Người mang gen dị hợp tử bệnh di Bệnh nhân Mối quan hệ vợ chồng Kết hôn cận huyết Số thứ tự Anh, chị, em ruột Không rõ giới tính truyền lặn NST Sinh đôi khác trứng Vô sinh Đối tượng nghiên cứu thường Chết Sinh đôi trứng 11,19,21,23,27,30,33,34,39,41,43,45,47,48,50 1-10,12-18,20,22,24-26,28,29,31,32,35-38,40,42,44,46,49,51- [...]... biến gen CYP21A2 Trong đó, nồng độ 17OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym 21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và người mang gen, người ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở các nước phát triển [1] 15 2.4 Phát hiện người lành mang gen bệnh Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính... quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bị bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể [3],[19],[32] 2.3 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận cao hơn những người bình thường không mang gen [19], [26] Chẩn đoán bệnh dựa... QUAN TÀI LIỆU 1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21- HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh dục- thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự thiếu hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận Trong đó, sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm... trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [36] Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lý người mang gen và người bệnh Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn trong cùng dòng họ cũng như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x... của NST số 6 vùng 6p21.3 Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể [18], [40] Hình 1.2 Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19] Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2, có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh... (Lee HH el al 2000) Do thiếu hụt enzym 21- OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21- OH hoặc người lành mang gen với độ tin cậy cao... độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng thận cấp và cường androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi enzym 21hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể. .. tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35] 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt của 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể khác nhau bao gồm: ∗ Thể mất muối Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể cổ điển sẽ dẫn đến suy giảm trầm trọng khả... Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3] Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7] Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân... Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện người lành mang gen bệnh [4] Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1] Nhìn chung, ở Việt