Đang tải... (xem toàn văn)
QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELIN TỪ DỨABromelin là nhóm protease thực vật có mã số EC3.4.22.33 được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt từ thân và trái dứa. Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ-CÔNG NGHỆ TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELIN TỪ DỨA Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S NGÔ MINH NHÃ Đỗ Thị Phương Uyên Lê Thị Thảo Ly Hà Huỳnh Kim Linh Nguyễn Thị Bích Linh CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.1 Nội dung nghiên cứu: 1.2 Phạm vi nghiên cứu: CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu Hình 2.1 Hình ảnh quả dứa. 2.2 Khái niệm enzyme Enzyme là một chất xúc tác sinh học, bản chất là protein. Nguồn gốc từ các tế bào sống sản xuất ra. Tác dụng của enzyme: tăng tốc độ và hiệu suất của phản ứng. Sau khi xúc tác enzyme giữ nguyên khả năng xúc tác Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme: E + S = ES E + P Ở đây: E - enzyme; S – cơ chất; P – sản phẩm 2.3.Enzyme bromelin 2.3.1 Enzyme bromelin Bromelin là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt từ thân và trái dứa. Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose 2.3.2 Ứng dụng Trong công nghệ thực phẩm: • Thủy phân protein cá • Làm mềm thịt • Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa Trong y học: Sản xuất các sản phẩm chức năng có tác dụng tăng cường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh. Đồng thời hỗ trợ trong điều trị các bệnh hiểm nghèo 2.3.3 Nghiên cứu nước nước 2.3.3.1 Trong nước Năm 1997, Đặng Thị Thu và cộng sự, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Đề tài thí nghiệm hóa sinh công nghiệp - Xác định hoạt lưc protease bằng phương pháp Anson cải tiến Năm 2005, Lê Thanh Mai, Nguyễn Kiêu Hùng, trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. Khảo sát khả năng làm mềm thịt của enzyme bromelin thu được từ phần phế liệu dứa- chồi ngọn Năm 2009, Lại Thị Ngọc Hà, Trường Đại học Nôg nghiệp Hà Nội. Đề tài nghiên cứu tách và tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm dứa Năm 2010, Th.S Trần Công Hòa, trường Đại học Đà Nẵng. Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme Bromelin và nồng độ muối đến quá trình sản xuất nước mắm 2.3.3.2 Ngoài nước Ngày 24/6/2005, Phó giáo sư R.E. Ryan khoa tai mũi họng Đại học Y khoa Louis, Mỹ đã công bố một đề tài nghiên cứu “Đánh giá lâm sàng mù đôi có đối chứng về tác dụng của Bromelain trong điều trị viêm xoang cấp”. Nghiên cứu được thực hiện trên 50 người bị viêm xoang cấp tính cho thấy nhóm điều trị bằng Bromelain, phản ứng viêm đã giảm đi tới 83% Tháng 6/2014, tiến sĩ Majid OW và đồng sự Al-Mashhadani BA, Đại học Mosul, Mosul, Iraq, đã công bố một nghiên cứu chứng minh tác dụng chống viêm của Bromelain tương đương với một thuốc tân dược nhưng không để lại tác dụng phụ trên đường tiêu hóa 2.3.4 Các sản phẩm Hình 2.2 Sản phẩm thuốc Yucca TD Hình 2.3 Sản phẩm thuốc Xoang Việt Hình 2.4 Sản phẩm thuốc Pedonase 3.2 Giải thích quy trình: 3.2.1 Nguyên liệu Có thể sử dụng nguyên liệu dứa tươi, sử dụng thân, quả, vỏ, chồi và lá đều được Ngoài ra có thể sử dụng phế phẩm từ cây dứa được thu nhận từ các cơ sở sản xuất Sau khi đem về, nguyên liệu sẽ được rửa bằng nước sạch để loại bỏ tạp chất và đất cát, để chuẩn bị cho những giai đoạn tiếp theo 3.2.2 Xay nhuyễn Mục đích: Làm giảm kích thước nguyên liệu, nhằm phá vỡ tế bào mô dứa để có thể tách lấy enzyme bromelin. Nhằm trích ly dịch quả có trong dứa Nguyên liệu dứa lúc này sẽ được xay thật nhuyễn, mịn, để có thể dễ dàng ép lấy tối đa lượng dịch chiết Có thể nghiền nhỏ trước khi xay 3.2.3 Lọc Mục đích: Tách một phần hoặc toàn bộ các cặn còn lại trong dịch ép, quá trình này hao hụt cỡ 15% khối lượ ng dịch ép Tốc độ lọc phụ thuộc chênh lệch áp suất và bề dày lớp cặn 3.2.4 Ly tâm Mục đích: thu được dịch chiết có chứa enzyme bromelin Li tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin 3.2.5 Thu chế phẩm bromelin thô Có ba phương pháp tách enzyme bromelin ra khỏi dịch chiết như sau: phương pháp kết tủa enzyme, phương pháp hấp phụ và phương pháp siêu lọc Phương pháp kết tủa: Các dung môi thừơng đươc sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hòa tan rất tốt do đó ở dung dịch bão hòa của muối này thì tất cả protein đều kết tủa Cách làm: DUNG DỊCH NƯỚC DỨA Làm lạnh hỗn hợp trong 4-5 Làm lạnh hỗn hợp trong 1 Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 giờ phút Ly tâm bỏ tủa Làm lạnh trong 1 giờ Ly tâm thu tủa Sấy khô BRO-EtOH BRO-A Sơ đồ 3.2 Thu nhận enzyme bromelin bằng phương pháp kết tủa BRO-N Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin-kaolin Phương pháp siêu lọc: phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn phương pháp siêu lọc thì sẽ loại bỏ được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Ưu điểm của phương pháp siêu lọc: Cách làm: DUNG DỊCH NƯỚC DỨA 1 PHƯƠNG PHÁP SIÊU LỌC Dịch thấm qua (làm siro, rượu thu citric Dịch cô đặc Cô đông acid) Ly tâm thu tủa Sấy khô BRO-SL (1) BRO-SL (2) Sơ đồ 3.3 Thu nhận enzyme bằng phương pháp siêu lọc. 3.2.6 Sấy khô Mục đích: tách một phần nước khỏi dịch chiết và thu tủa Có thể sử dụng phương pháp sấy chân không. Thu được chế phẩm có màu trắng ngà Thời gian: 24 giờ Nhiệt độ: 40oC Độ ẩm cuối cùng: 5 – 8% W. 3.2.7 Phương pháp tinh enzyme bromelin 3.2.7.1 Tinh phương pháp thẩm tích Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH 7,2 Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay dung dịch đệm bên ngoài một lần Cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1l dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ 3.2.7.2 Tinh cách lọc qua sephadex 3.2.7.2.1 Tinh cách lọc qua sephadex G-50 Nhồi cột: Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 100oC trong 1 giờ rồi nhồi vào cột (kích thước cột 23,5×0,9cm) Đông khô Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút. Dịch enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để khử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme Thực hiện ở nhiệt độ thấp Thời gian: 1 giờ 3.2.7.2.2 Tinh cách lọc qua sephadex G-100 Sephadex G-100 được đun cách thủy ở 100 oC trong 5 giờ, sau đó nhồi vào cột kích thước 28×1cm Thu từng phân đoạn enzyme (mỗi phân đoạn là 3ml) và do OD ở bước sóng 280nm Cho dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 chảy qua cột khoảng 3-4 giờ để cân bằng cột Cân 100mg enzyme thô hòa vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột. chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzyme là 1ml/5 phút. 3.2.7.2.3.Tinh bromelin phương pháp sắc ký Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion trên DEAE-cellulose thì thấy có một thành phần chính và 5 thành phần phụ Bromelin quả: khi sắc ký trên DEAE-cellulose và sulfo ethyl sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận: Bromelin mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống con người. Nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu. Có tác dụng chữa bệnh và hỗ trợ chữa bệnh, góp phần trong quá trình sản xuất một số sản phẩm như nước mắm, sữa… 4.2 Đề nghị: Sử dụng bromelin một cách hợp lý và hiệu quả Cần mở rộng quy mô sản xuất enzyme bromelin [...]...CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH VÀ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELIN TỪ DỨA 3.1 Phương pháp thu nhận bromelin Phương pháp thu nhận Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau: Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn Dịch ly tâm Chế phẩm bromelin thô Lọc Dịch lọc Sấy khô Sản phẩm enzyme Tinh sạch Ly tâm Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin tinh khiết... sạch Ly tâm Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin tinh khiết 3.2 Giải thích quy trình: 3.2.1 Nguyên liệu Có thể sử dụng nguyên liệu dứa tươi, sử dụng thân, quả, vỏ, chồi và lá đều được Ngoài ra có thể sử dụng phế phẩm từ cây dứa được thu nhận từ các cơ sở sản xuất Sau khi đem về, nguyên liệu sẽ được rửa bằng nước sạch để loại bỏ tạp chất và đất cát, để chuẩn bị cho những giai đoạn tiếp theo... Mục đích: thu được dịch chiết có chứa enzyme bromelin Li tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin 3.2.5 Thu chế phẩm bromelin thô Có ba phương pháp tách enzyme bromelin ra khỏi dịch chiết như sau: phương pháp kết tủa enzyme, phương pháp hấp phụ và phương pháp siêu lọc Phương pháp kết tủa: Các dung môi thừơng đươc sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác ... Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin- kaolin Phương pháp siêu lọc: phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn phương pháp siêu lọc thì sẽ loại bỏ được các ... Mục đích: Làm giảm kích thước nguyên liệu, nhằm phá vỡ tế bào mô dứa để có thể tách lấy enzyme bromelin. Nhằm trích ly dịch quả có trong dứa Nguyên liệu dứa lúc này sẽ được xay thật nhuyễn, mịn, để có thể dễ dàng ép lấy tối đa lượng dịch chiết Có thể nghiền nhỏ trước khi xay 3.2.3 Lọc Mục đích: Tách một phần hoặc toàn bộ các cặn còn lại trong dịch ép, quá trình này hao hụt cỡ 15% khối lượ ng dịch ép Tốc độ lọc phụ thuộc chênh lệch áp suất và bề dày lớp cặn... Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút. Dịch enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để khử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme Thực hiện ở nhiệt độ thấp Thời gian: 1 giờ 3.2.7.2.2 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100 Sephadex G-100 được đun cách thủy ở 100 oC trong 5 giờ, sau đó nhồi vào cột kích thước 28×1cm Thu từng phân đoạn enzyme (mỗi phân đoạn là 3ml) và do OD ở bước sóng 280nm... một thành phần chính và 5 thành phần phụ Bromelin quả: khi sắc ký trên DEAE-cellulose và sulfo ethyl sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận: Bromelin mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống con người. Nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu. Có tác dụng chữa bệnh và hỗ trợ chữa bệnh, góp phần trong quá trình sản xuất một số sản phẩm như nước mắm, sữa…... thương phẩm của nguyên liệu. Có tác dụng chữa bệnh và hỗ trợ chữa bệnh, góp phần trong quá trình sản xuất một số sản phẩm như nước mắm, sữa… 4.2 Đề nghị: Sử dụng bromelin một cách hợp lý và hiệu quả Cần mở rộng quy mô sản xuất enzyme bromelin ... chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Ưu điểm của phương pháp siêu lọc: Cách làm: DUNG DỊCH NƯỚC DỨA 1 PHƯƠNG PHÁP SIÊU LỌC Dịch thấm qua (làm siro, rượu thu citric Dịch cô đặc Cô đông acid) Ly tâm thu tủa Sấy khô BRO-SL (1) BRO-SL (2) Sơ đồ 3.3 Thu nhận enzyme bằng phương pháp siêu lọc. 3.2.6 Sấy... Cho dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 chảy qua cột khoảng 3-4 giờ để cân bằng cột Cân 100mg enzyme thô hòa vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột. chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzyme là 1ml/5 phút. 3.2.7.2.3.Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion trên DEAE-cellulose thì thấy có