TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG -oooooo - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: D620301 MẬT SỐ VI KHUẨN VIBRIO VÀ BACILLUS TRONG ƯƠNG ẤU TRÙNG TÔM SÚ VÀ THẺ CHÂN TRẮNG THEO QUI TRÌNH NƯỚC TRONG KÍN Sinh viên thực PHẠM NGÔ ANH HÀO MSSV: 1153040022 Lớp NTTS K6 Cần Thơ, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG oooooo - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: D620301 MẬT SỐ VI KHUẨN VIBRIO VÀ BACILLUS TRONG ƯƠNG ẤU TRÙNG TÔM SÚ VÀ THẺ CHÂN TRẮNG THEO QUI TRÌNH NƯỚC TRONG KÍN Cán hướng dẫn Ths Nguyễn Lê Hoàng Yến Cần Thơ, 2015 Sinh viên thực PHẠM NGÔ ANH HÀO MSSV: 1153040022 Lớp NTTS K6 LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết khóa luận hoàn thành kết nghiên cứu kết chưa công bố dùng khóa luận cấp Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Sinh viên thực (Chữ ký) Phạm Ngô Anh Hào i XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Đề tài nghiên cứu: “Mật số vi khuẩn Vibrio Bacillus ương ấu trùng tôm sú thẻ chân trắng theo qui trình nước kín” Sinh viên thực hiện: Phạm Ngô Anh Hào Lớp: Nuôi trồng thủy sản K6 Khóa luận hoàn thành theo yêu cầu cán hướng dẫn chỉnh sửa theo góp ý hội đồng bảo vệ khóa luận tốt nghiệp Đại học Khoa Sinh học ứng dụng-Trường Đại học Tây Đô ngày 14/09/2015 Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Sinh viên thực (Chữ ký) Cán hướng dẫn (Chữ ký) Phạm Ngô Anh Hào Ths Nguyễn Lê Hoàng Yến ii LỜI CẢM ƠN Lời nói xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths Nguyễn Lê Hoàng Yến tận tình hướng dẫn truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Tiếp đến, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tây Đô tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến ThS Tạ Văn Phương-cố vấn học tập lớp quý thầy cô Khoa Sinh học ứng dụng tận tình giảng dạy, gắn lý thuyết vào thực hành qua học hữu ích lớp chuyến tham quan thực tế, hành trang vô vững để phục vụ cho công việc nghiên cứu sau Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ tất bạn tập thể lớp Nuôi trồng thủy sản K6 động viên hỗ trợ để có thành công ngày hôm Xin chân thành cảm ơn với lòng trân trọng! Phạm Ngô Anh Hào iii TÓM TẮT Đề tài mật số vi khuẩn Vibrio Bacillus ương ấu trùng tôm sú thẻ chân trắng theo qui trình nước kín tiến hành với nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần Qua khảo sát mật độ vi khuẩn Vibrio, Bacillus, vi khuẩn tổng Mật độ vi khuẩn Vibrio trung bình mẫu ấu trùng tôm sú, ấu trùng tôm thẻ chân trắng, nước ương tôm sú, nước ương tôm thẻ chân trắng với giá trị là: 4,36±3,69; 4,24±2,94; 3,25±2,00; 3,77±2,62 (x103 CFU/mL) Mật độ Bacillus trung bình mẫu nước ương tôm sú, tôm thẻ chân trắng; ấu trùng tôm sú, ấu trùng tôm thẻ chân trắng là: 3,50±3,51; 2,80±2,82; 2,86±3,24; 2,76±2,78 (x104 CFU/mL) Giá trị mật độ vi khuẩn tổng trung bình mẫu ấu trùng tôm thẻ chân trắng, ấu trùng tôm sú; nước ương tôm thẻ chân trắng, nước ương tôm sú là: 15,9±12,3; 14,7±12,9; 3,95±2,78; 3,97±2,46 (x105 CFU/mL) Qua khảo sát mẫu ấu trùng mẫu nước ương đối tượng ương ký sinh trùng Tỷ lệ sống ấu trùng tôm sú 36,6±3,30, tôm thẻ chân trắng 34,2±9,60 nghiệm thức với khác biệt ý nghĩa thống kê (α=5%) Từ khóa: ấu trùng tôm sú, ấu trùng tôm thẻ chân trắng, Bacillus, Vibrio, vi khuẩn tổng iv MỤC LỤC LỜI CAM KẾT i XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv DANH SÁCH HÌNH ix DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT x CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm phân loại, sinh học đối tượng ương 2.1.1 Tôm sú 2.1.2 Tôm thẻ chân trắng 2.2 Tình hình sản xuất giống tôm sú tôm TCT 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Việt Nam 2.3 Sơ lược vi khuẩn 10 2.3.1 Bacillus 10 2.3.2 Vibrio 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.2 Vật liệu nghiên cứu 12 3.2.1 Vật liệu sử dụng ương ấu trùng 12 3.2.2 Vật liệu sử dụng phân tích mẫu 12 3.2.3 Hóa chất 12 3.2.4 Thức ăn 12 3.2.5 Ấu trùng 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 v 3.3.1 Chuẩn bị thí nghiệm 13 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 13 3.3.3 Chăm sóc quản lý thí nghiệm 14 3.3.4 Phương pháp thu phân tích mẫu 15 3.3.5 Phương pháp phân tích mẫu 16 3.3.5 Xác định tiêu sinh lý, sinh hoá vi khuẩn Bacillus 17 3.3.6 Thu hoạch 18 3.4 Phương pháp phân tích số liệu 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Các yếu tố môi trường 19 4.1.1 Nhiệt độ pH 19 4.1.2 Biến động yếu tố thủy hóa 20 4.2 Biến động mật số vi khuẩn mẫu nước ương mẫu ấu trùng 23 4.2.1 Vibrio 23 4.2.2 Bacillus 25 4.2.3 Vi khuẩn tổng 26 4.4 TLS ấu trùng 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề xuất 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC A Phụ lục A.1 Biến động nhiệt độ sáng A Phụ lục A.2 Biến động nhiệt độ chiều B Phụ lục B.1 Biến động pH sáng C Phụ lục B.2 Biến động pH chiều C Phụ lục C.1 Nồng độ Nitrite mẫu nước (mg/L) D Phụ lục C.2 Nồng độ Nitrate mẫu nước (mg/L) D Phụ lục C.3 Nồng độ TAN mẫu nước (mg/L) D Phụ lục D.1 Khối lượng loại thức ăn cho ấu trùng giai đoạn Z1-PL1/ngày E Phụ lục D.2 Khối lượng loại thức ăn cho ấu trùng giai đoạn PL1-PL12/ngày E Phụ lục F.1 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio mẫu nước TCT G vi Phụ lục F.2 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio mẫu nước sú G Phụ lục F.3 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio mẫu tôm TCT H Phụ lục F.4 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio mẫu tôm sú H Phụ lục G.1 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu nước TCT I Phụ lục G.2 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu nước sú J Phụ lục G.3 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu tôm TCT J Phụ lục G.4 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu tôm sú K Phụ lục H.1 Biến động mật độ VKT cộng mẫu nước TCT K Phụ lục H.2 Biến động mật độ VKT cộng mẫu nước sú L Phụ lục H.3 Biến động mật độ VKT cộng mẫu tôm TCT M Phụ lục H.4 Biến động mật độ VKT cộng mẫu tôm sú M Phụ lục H.5 Giá trị TB ĐLC mẫu cấy vi khuẩn chu kỳ ương ấu trùng N Phụ lục K Kết test sinh hóa vi khuẩn Bacillus N Phụ lục L.1 Thành phần số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn P Phụ lục L.1 Thành phần số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Q Phụ lục L.2 Phương pháp pha chế môi trường kỹ thuật vô trùng R Phụ lục M TLS ấu trùng U vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Vòng đời tôm sú (Kenway Hall, 2002) Bảng 2.2 Các giai đoạn phát triển ấu trùng Nauplius Bảng 2.3 Vòng đời tôm TCT (Litopenaeus vannamei) Bảng 3.1 Phương pháp phân tích tiêu môi trường 16 Bảng 3.2 Các tiêu test sinh hóa vi khuẩn Bacillus 17 Bảng 4.1 Biến động nhiệt độ pH nước ương ấu trùng 19 Bảng 4.2 TLS ấu trùng 28 viii D-7 D-10 D-13 D-16 D-19 D-22 D-25 -1 -1 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -1 -1 162 39 59 36 45 15 46 17 49 18 700 1.620 3.900 5.900 9.000 3.600 5.000 4.500 6.000 1.500 5.000 460 1.700 490 1.800 2,76 7,45 4,30 5,25 3,25 1,08 1,15 TB 53 24 17 13 11 31 14 500 530 2.400 1.700 3.000 1.300 7.000 1.100 5.000 400 2.000 310 500 140 700 1,47 4,23 2,35 9,80 4,15 8,45 3,05 8,30 1,20 4,45 0,41 1,49 0,42 1,57 4,36±3,69 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục G.1 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu nước TCT Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL TB 0 D-1 0,00 -1 0 122 1.220 D-4 0,23 -1 33 3.300 -1 45 4.500 D-7 0,88 -2 13 13.000 -1 95 9.500 D-10 2,03 -2 31 31.000 -1 142 14.200 D-13 2,86 -2 43 43.000 -2 35 35.000 D-16 8,75 -3 14 140.000 -2 45 45.000 D-19 5,75 -3 70.000 -1 115 11.500 D-22 2,78 -2 44 44.000 -1 98 9.800 D-25 1,94 -2 29 29.000 TB 2,80±2,82 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 104 CFU/mL I Phụ lục G.2 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu nước sú Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 10 D-1 -1 0 83 830 D-4 -1 27 2.700 -1 36 3.600 D-7 -2 15 15.000 -1 75 7.500 D-10 -2 37 37.000 -1 125 12.500 D-13 -2 56 56.000 -2 32 32.000 D-16 -3 16 160.000 -2 47 47.000 D-19 -3 12 120.000 -2 24 24.000 D-22 -3 80.000 -1 74 7.400 D-25 -2 25 25.000 TB TB 0,00 0,18 0,93 2,23 3,43 9,60 8,35 5,20 1,62 3,50±3,51 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 104 CFU/mL Phụ lục G.3 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu tôm TCT Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 30 D-1 -1 0 72 720 D-4 -1 28 2.800 167 1.670 D-7 -1 37 3.700 -1 45 4.500 D-10 -2 19 19.000 -1 125 1.250 D-13 -2 67 67.000 -2 53 53.000 D-16 -3 11 110.000 D-19 -2 35 35.000 J TB 0,00 0,18 0,27 1,18 3,41 8,15 5,75 D-22 D-25 -3 -1 -2 -1 -2 91 55 78 47 80.000 9.100 55.000 7.800 47.000 TB 3,21 2,74 2,76±2,78 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục G.4 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus mẫu tôm sú Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 13 130 D-1 -1 0 95 950 D-4 -1 33 3.300 114 1.140 D-7 -1 38 3.800 -1 43 4.300 D-10 -2 25 25.000 -1 122 12.200 D-13 -2 37 37.000 -2 45 45.000 D-16 -3 15 150.000 -2 54 54.000 D-19 -3 70.000 -1 82 8.200 D-22 -2 61 61.000 -1 52 5.200 D-25 -2 33 33.000 TB TB 0,01 0,21 0,25 1,47 2,46 9,75 6,20 3,46 1,91 2,86±3,24 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục H.1 Biến động mật độ VKT cộng mẫu nước TCT Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 103 1.030 D-1 -1 55 5.500 352 3.520 D-4 -1 85 8.500 -1 76 7.600 D-7 -2 28 28.000 K TB 0,33 0,60 1,78 D-10 D-13 D-16 D-19 D-22 D-25 -1 -2 -1 -2 -2 -3 -2 -3 -1 -2 -1 -2 96 41 385 104 57 34 12 218 92 262 57 9.600 41.000 3.850 104.000 57.000 90.000 34.000 120.000 21.800 92.000 26.200 57.000 TB 2,53 5,39 7,35 7,70 5,69 4,16 3,95±2,78 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục H.2 Biến động mật độ VKT cộng mẫu nước sú Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 124 1.240 D-1 -1 73 7.300 382 3.820 D-4 -1 126 12.600 -1 107 10.700 D-7 -2 45 45.000 -1 331 33.100 D-10 -2 68 68.000 -2 56 56.000 D-13 -3 11 110.000 -2 32 32.000 D-16 -3 80.000 -1 112 11.200 D-19 -2 87 87.000 -1 96 9.600 D-22 -2 55 55.000 -1 183 18.300 D-25 -2 74 74.000 TB Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL L TB 0,43 0,82 2,79 5,06 8,30 5,60 4,91 3,23 4,62 3,97±2,46 Phụ lục H.3 Biến động mật độ VKT cộng mẫu tôm TCT Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 213 2.130 D-1 -1 76 7.600 -1 119 11.900 D-4 -2 53 53.000 -1 412 41.200 D-7 -2 134 134.000 -2 128 128.000 D-10 -3 42 420.000 -2 107 107.000 D-13 -3 51 510.000 -2 162 162.000 D-16 -3 48 480.000 -2 143 143.000 D-19 -3 31 310.000 -1 367 36.700 D-22 -2 136 136.000 -1 239 23.900 D-25 -2 162 162.000 TB TB 0,49 3,25 8,76 27,4 30,9 32,1 22,7 8,64 9,30 15,9±12,3 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục H.4 Biến động mật độ VKT cộng mẫu tôm sú Ngày Độ pha loãng Số KL CFU/mL 169 1.690 D-1 -1 88 8.800 -1 152 15.200 D-4 -2 61 61.000 -1 334 33.400 D-7 -2 95 95.000 -2 103 103.000 D-10 -3 31 310.000 -2 135 135.000 D-13 -3 42 420.000 -2 141 141.000 D-16 -3 58 580.000 -2 159 159.000 D-19 -3 36 360.000 M TB 0,52 3,81 6,42 20,7 27,8 36,1 26,0 D-22 D-25 -1 -2 -1 -2 323 94 476 52 32.300 94.000 47.600 52.000 TB 6,32 4,98 14,7±12,9 Ghi chú: Giá trị trung bình tính với đơn vị 10 CFU/mL Phụ lục H.5 Giá trị TB ĐLC mẫu cấy vi khuẩn trùng tôm TCT tôm sú Vibrio Bacillus Mẫu Tôm TCT Tôm sú Tôm TCT Tôm sú Nước ương 3,77±2,62 3,25±2,00 2,80±2,82 3,50±3,51 Ấu trùng 4,24±2,94 4,36±3,69 2,76±2,78 2,86±3,24 chu kỳ ương ấu VKT Tôm TCT Tôm sú 3,95±2,78 3,97±2,46 15,9±12,3 14,7±12,9 Ghi chú: Giá trị thể mật độ vi khuẩn TB ĐLC suốt chu kỳ ương Mật độ vi khuẩn Vibrio, Bacillus, VKT tính với đơn vị 103, 104,105 CFU/mL Phụ lục K Kết test sinh hóa vi khuẩn Bacillus Hình dạng khuẩn lạc: khuẩn lạc có hình dạng to, tròn, rìa, khuẩn lạc nhầy, bề mặt nhẵn nhăn Màu trắng đục đến vàng, sau thời gian nuôi lâu khuẩn lạc có tượng bám sát vào bề mặt thạch môi trường Hình a Đĩa khuẩn lạc Bacillus Kết nhuộm Gram cho thấy tế bào vi khuẩn Bacillus có hình dạng que, gram dương N Hình b Nhuộm Gram Theo Brown (2005), vi khuẩn thực thực bào thành tế bào cứng nên chúng tiết enzyme để thủy phân đại phân tử lớn, enzyme protease thủy phân protein, amylase thủy phân tinh bột thành amino acid monosaccharide sau vận chuyển vào tế bào giúp cho trình trao đổi chất Kết phản ứng Catalase, Oxidase, Starch, Casein thể qua Hình c, d, e, f cho thấy chủng vi khuẩn có khả thủy phân tinh bột, Casein, chuyển màu xanh Oxidase sủi bọt phản ứng Catalase Hình c Phản ứng Catalase Khi nhỏ lên vi khuẩn giọt dung dịch H2O2 3% Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương gây tượng sủi bọt O Hình d Phản ứng Oxidase Kết quả: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng Oxidase dương tính (+) không chuyển màu âm tính (-) Hình e Phản ứng Starch Hình f Thủy phân Casein Theo Sharmin and Rahman (2007), Bacillus tiết ngoại enzyme môi trường sống môi trường lỏng chứa protein tripticase soya Theo tác giả, enzyme hoạt động tối ưu pH 8,50 hoạt tính enzyme tăng nhiệt độ tăng, cao nhiệt độ 550C Kết nhận diện hình dạng tiêu sinh hóa vi khuẩn Bacillus phù hợp với nghiên cứu Lâm Trung Tính (2009) thỏa mãn điều kiện Andretta et al., (2004) Phụ lục L.1 Thành phần số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Tryptone Soya Agar Ingredients Grams/Litre Casein peptone (pancreatic) 15,0 Soya peptone (papainic) 5,0 Sodium chloride 5,0 Agar 15,0 P Final pH (at 25°C) 7,3±0,2 Thành phần môi trường TCBS Agar Ingredients Proteose peptone Yeast extract Sodium thiosulphate Sodium citrate Oxgall Sucrose Sodium chloride Ferric citrate Bromo thymol blue Thymol blue Agar Final pH (at 25°C) Gms / Litre 10,000 5,000 10,000 10,000 8,000 20,000 10,000 1,000 0,040 0,040 15,000 8,6±0,2 Thành phần môi trường Nutrient Agar Ingredients Peptic digest of animal tissue Sodium chloride Beef extract Yeast extract Agar Final pH (at 25°C) Gms / Litre 5,000 5,000 1,500 1,500 15,000 7,4±0,2 Phụ lục L.1 Thành phần số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Thành phần môi trường Tryptone Soya Agar Ingredients Grams/Litre Casein peptone (pancreatic) 15,0 Soya peptone (papainic) 5,0 Sodium chloride 5,0 Agar 15,0 Final pH (at 25°C) 7,3±0,2 Thành phần môi trường TCBS Agar Ingredients Gms / Litre Proteose peptone 10,000 Yeast extract 5,000 Sodium thiosulphate 10,000 Sodium citrate 10,000 Oxgall 8,000 Sucrose 20,000 Q Sodium chloride Ferric citrate Bromo thymol blue Thymol blue Agar Final pH (at 25°C) Thành phần môi trường Nutrient Agar Ingredients Peptic digest of animal tissue Sodium chloride Beef extract Yeast extract Agar Final pH (at 25°C) 10,000 1,000 0,040 0,040 15,000 8,6±0,2 Gms / Litre 5,000 5,000 1,500 1,500 15,000 7,4±0,2 Phụ lục L.2 Phương pháp pha chế môi trường kỹ thuật vô trùng L.2.1 Pha môi trường Nutrient Agar: tính lượng môi trường cần sử dụng, pha với tỷ lệ 23g NA với 1L nước cất (1-1,5%) NaCl theo thể tích, cho vào bình chuyên dụng nấu môi trường → nấu môi trường nồi khử trùng áp suất → để nguội >60oC Tryptic Soy Agar: tính lượng môi trường cần sử dụng, pha với tỷ lệ 20g TSA với 1L nước cất (1-1,5%) NaCl theo thể tích, cho vào bình chuyên dụng nấu môi trường → nấu môi trường nồi khử trùng áp suất → để nguội >60oC TCBS Agar: tính lượng môi trường cần sử dụng, pha với tỷ lệ 89g TCBS với 1L nước cất, cho vào bình chuyên dụng nấu môi trường → khuấy từ 2000C để nguội >60oC L.2.2 Chuẩn bị đĩa petri Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường đĩa petri 121oC 20 phút Lau cồn quanh mặt tủ cấy vô trùng Thắp đèn cồn để tránh nhiễm khuẩn vào đĩa môi trường Đợi nhiệt độ bình môi trường nguội đến 60oC cho vào tủ cấy vô trùng với đĩa petri để chuẩn bị đổ đĩa Không đỗ đĩa môi trường nóng 60oC để tránh nước đọng nắp đĩa mặt thạch Sát trùng tay cồn 70% trước đỗ đĩa Quay tròn bình để trộn môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí Đổ khoảng 20mL môi trường vào đĩa petri Nếu thấy có bọt khí mặt thạch dùng que cấy nung đỏ lửa đèn cồn châm vỡ bọt khí Thao tác cần thực thạch nóng, chưa đông R Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch phẳng, đồng nguội đến nhiệt độ phòng Gói giấy báo, ghi tên môi trường ngày đổ đĩa bên cho vào tủ lạnh dùng để cấy vi khuẩn L.2.3 Phương pháp tráng đĩa (cấy trang hay tán vi sinh đĩa thạch) Chuẩn bị Đĩa petri Que cấy thủy tinh đầu tam giác Pipet 20-200 l, hộp đầu tip Cồn 70% Đèn cồn Thao tác Lấy ống nghiệm chứa nước mẫu với độ pha loãng khác để tiến hành tráng đĩa Vệ sinh cồn khắp mặt tủ cấy Cho dụng cụ vào tủ cấy (trừ máy khuấy ống nghiệm) Sát trùng tay cồn 70% Lắc kỹ ống nghiệm máy khuấy ống nghiệm phút Mở nút bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng đèn cồn Dùng Micropipet hút 100L dung dịch mẫu Hơ nhanh miệng ống đèn cồn, đậy nút lại Tay trái mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm Micropipet cho vào 100L mẫu Dùng que cấy nhúng vào cồn, hơ nhanh lửa đèn cồn, làm nguội không khí 15s, tiếp tục làm nguội que gạt phần thạch dung dịch vi khuẩn, que cấy nguội gạt giọt dung dịch trải khắp mặt thạch: tay trái mở nắp hộp, ngón út xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay phải liên tục gạt mặt thạch khô Thay đầu típ tiếp tục với ống lại Chú ý: Để tế bào vi sinh tách rời phân bố mặt thạch, sau nhỏ giọt dịch pha loãng cần tiến hành gạt Nếu để lâu giọt dịch bị khô, tế bào gắn chặt vào mặt thạch, việc gạt dàn chúng khó khăn, dẫn đến kết sai lệch Các đĩa thạch cho vào tủ ấm 32oC 24h L.2.4 Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn Các bước nhuộm Gram thực theo Sharmin and Rahman (2007) S Cho giọt nước muối sinh lý lên kính mang vật Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trãi lên kính mang vật, để kính mang vật khô tự nhiên Hơ lướt kính mang vật lửa đèn cồn, cố định vi khuẩn sau để nguội Nhuộm crytal violet (dung dịch 1) khoảng phút, rửa kính mang vật nước Nhuộm iodine (dung dịch 2) phút, rửa kính mang vật nước Rửa kính mang vật dung dịch alcohol/acetone (dung dịch 3) từ 2- giây Rửa kính mang vật lại nước Nhuộm safranin (dung dịch 4) khoảng phút, rửa lại nước để khô Quan sát kính mang vật kính hiển vi quang học (40X 100X) Vi khuẩn gram (+): xanh tím Vi khuẩn gram (-): màu hồng L.2.5 Thao tác pha loãng Chuẩn bị Ống nghiệm chứa mẫu cần pha loãng Ống nghiệm chứa 10 mL nước muối sinh lý hấp tiệt trùng Máy khuấy ống nghiệm Đèn cồn Micropipet, hộp đầu tip hấp tiệt trùng, bút Tiến hành Vệ sinh cồn khắp mặt tủ cấy T Cho dụng cụ vào bên tủ cấy Rửa tay cồn Lắc bình chứa mẫu cần pha loãng máy khuấy ống nghiệm phút Mở nút bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng đèn cồn Dùng Micropipet hút 1mL Mở nút ống nghiệm chứa 9mL nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn Cho 1mL mẫu vào Hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn, đậy nhanh nút lại Phụ lục M TLS ấu trùng Đối tượng LL1 7500 1970 26,3 Số Nauplius bố trí (ấu trùng) Số PL12 lúc thu (con) TLS (%) TB Stdev Tôm TCT LL2 7500 2360 31,5 34,2 9,6 LL3 7500 3370 44,9 LL1 7500 3010 40,1 Tôm sú LL2 7500 2520 33,6 36,6 3,3 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Tôm TCT Tôm sú Count Sum Average Variance 102.6667 34.22222 92.80593 109.7333 36.57778 10.92148 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 8.322963 207.4548 Total 215.7778 df MS F P-value F crit 8.322963 0.160478 0.709192 7.708647 51.8637 U LL3 7500 2700 36,0 Phụ lục N Một số hình ảnh dụng cụ thiết bị phòng thí nghiệm Tủ cấy vi sinh Nồi Autoclauve Tủ sấy dụng cụ Tủ ấm vi sinh V Cân điện tử số lẻ (trái), Cân điện tử số lẻ (phải) Máy so màu quang phổ Đĩa chứa môi trường Bộ nhuộm Gram Test Oxidase Một số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Agar, TCBS, TSA, NA) W [...]... Biến động mật số vi khuẩn trong mẫu nước ương và mẫu ấu trùng 4.2.1 Vibrio Mẫu nước ương ấu trùng Mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước ương được thể hiện ở Phụ lục F.1 và F.2 Hình 4.4 Biến động mật độ Vibrio trong mẫu nước ương Qua hình 4.4 cho thấy, mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước ương ấu trùng tôm sú và tôm TCT có sự biến động khá lớn Mật độ vi khuẩn có xu hướng tăng dần về giữa chu kỳ ương sau... so với mẫu nước ương tôm sú (3,25±2,00x103 CFU/mL) 23 Mẫu ấu trùng Hình 4.5 Biến động mật độ Vibrio trong mẫu ấu trùng Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu ấu trùng được thể hiện qua hình 4.5, mật độ vi khuẩn Vibrio trong 2 mẫu ấu trùng tôm TCT và tôm sú đều có xu hướng tăng dần vào đầu đợt ương và đạt đỉnh điểm với các giá trị lần lượt là 9,50x103 CFU/mL và 9,80x103 CFU/mL vào ngày ương D-10... sau đó có xu hướng giảm dần vào cuối chu kỳ ương Vào ngày ương D-16 mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu ấu trùng tôm sú cao gấp 1,87 lần so với mẫu ấu trùng tôm TCT, đến ngày ương D-19 thì mật độ vi khuẩn Vibrio giữa 2 mẫu ấu trùng có xu hướng đảo chiều ngược lại khi mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu ấu trùng tôm TCT là (7,05x103 CFU/mL) cao gấp 1,59 lần so với mẫu ấu trùng tôm sú (4,45x103 CFU/mL) The Fuller... kỳ Mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước cấp ban đầu của ấu trùng tôm sú (0,33x103 CFU/mL) cao hơn so với mẫu nước cấp ương ấu trùng tôm TCT (0,00x103 CFU/mL), sự khác biệt này có thể do mẫu nước cấp đã xử lý hết chlorine và được cấp vào bể ương trước 1 ngày so với ngày thả ấu trùng, bể ương không che bạt nên nước ương có thể bị nhiễm vi khuẩn từ không khí Mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước sú cao... 1: Ương tôm sú theo qui trình nước trong kín Nghiệm thức 2: Ương tôm TCT theo qui trình nước trong kín Hình 3.1 Hệ thống bể thí nghiệm 13 3.3.3 Chăm sóc và quản lý thí nghiệm Thả ương ấu trùng Thuần hóa thật kỹ ấu trùng N trước khi chuyển đến bể ương nếu nhiệt độ và độ mặn nước vận chuyển chênh lệch với bể ương quá 0,5oC và hơn 1‰ Tiến hành định lượng ấu trùng và bố trí vào bể ương thể tích 60L Mức nước. .. 2 mẫu nước ương tôm TCT và tôm sú có sự chênh lệch lớn, mẫu nước ương tôm TCT cao gấp 1,99 lần so với mẫu nước sú Mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước sú vào ngày ương D-16 giảm 1,63 lần so với ngày ương D-13 là do mật độ vi khuẩn Bacillus vào ngày ương D-16 đạt giá trị đỉnh điểm (8,75x104 CFU/mL), đây có thể là nguyên nhân gây suy giảm mật độ Vibrio có trong mẫu nước do sự cạnh tranh thức ăn và dinh... hô hấp và làm tôm chậm lớn Vì vậy, đề tài Mật số vi khuẩn Vibrio và Bacillus trong ương ấu trùng tôm sú và thẻ chân trắng theo qui trình nước trong kín được thực hiện nhằm tạo ra tiền đề trong vi c kiểm soát các yếu tố vi sinh vật bất lợi, hướng tới một môi trường ương ấu trùng bền vững hơn cho ngành thủy sản 1.2 Mục tiêu đề tài Cung cấp thêm những thông tin cần thiết về hệ sinh vật hiện diện trong. .. khuẩn Vibrio trong cả 2 mẫu ấu trùng tôm TCT và tôm sú đều giảm, nhất là ở mẫu ấu trùng tôm TCT giảm mạnh từ 9,50x103 CFU/mL xuống 4,45x103 CFU/mL (giảm 2,13 lần) và thấp hơn cả mẫu ấu trùng tôm sú, nguyên nhân có thể là do trong đường ruột của ấu trùng đã hình thành nên các quần thể vi sinh vật có lợi làm ức chế hoặc suy giảm mật độ vi khuẩn Vibrio có trong mẫu ấu trùng Giá trị Vibrio trung bình trong. .. trong mẫu nước ương 23 Hình 4.5 Biến động mật độ Vibrio trong mẫu ấu trùng 24 Hình 4.6 Biến động mật độ Bacillus trong mẫu nước ương 25 Hình 4.7 Biến động mật độ Bacillus trong mẫu ấu trùng 26 Hình 4.8 Biến động VKT trong nước ương 27 Hình 4.9 Biến động VKT trong ấu trùng tôm 27 ix DANH SÁCH TỪ VI T TẮT N: Nauplius Z: Zoea M: Mysis PL: Postlarvae CFU/mL: số khuẩn. .. và dinh dưỡng giữa các quần thể vi sinh vật Theo MoriArtemiay (1999), mật độ vi khuẩn Vibrio vượt quá 103 CFU/mL thì gây hại đến tôm, mật độ vi khuẩn Vibrio trong mẫu nước TCT dao động trong khoảng 0,00-8,35x103 CFU/mL và từ 0,33-6,85x103 CFU/mL đối với mẫu nước sú nên vẫn thích hợp cho sinh trưởng của ấu trùng Giá trị Vibrio trung bình trong suốt chu kỳ ương trong mẫu nước TCT là 3,77±2,62x103 CFU/mL