TIấU LUN: CNSX Vacxin Va khang sinh ấ Tai: CNSX Vacxin viờm gan B GV hng dn: GV Nguyờn Thi Thng Thng Nhúm SV thc hin : Trõn Trung Hiờu (Leader)036 Nguyờn Quang Huy 042 Cõn Thi Khanh Huyờn 044 Hoang Thi Hng 049 Hoang Thi Yờn 098 Mc lc Gii thiờu vờ bờnh viờm gan B Virus viờm gan B Gii thiờu vờ vaccine Quy trỡnh sn xuõt vaccine viờm gan B tỏi t hp Quy trinh sn xuõt vaccime viờm gan B t huyờt tng ngi lanh Bờnh viờm gan B la gi? Viờm gan siờu vi B l bnh gan him nghốo thng gp nht trờn th gii siờu vi khun B gõy Vit Nam l mt nhng quc gia cú t l b nhim siờu vi B cao nht th gii nc ta cú khong 10 triu ngi ang b nhim cn bnh ny Ti viờm gan B c coi l cn bnh nguy him? Vỡ õy l cn bờnh lõy lan lng l, tiờn trin õm thõm a s ngi bi nhiờm siờu vi B ờu khụng biờt l mỡnh bi nhiờm v cú th vụ tỡnh lõy sang ngi khỏc qua ng mỏu a s ngi ln bi nhiờm ờu cú th loi tr siờu vi B dờ dng Tuy nhiờn a s tr s sinh v tr em bi nhiờm ờu khụng th loi tr c siờu vi khun ny v s tr thnh ngi mang siờu vi B mn tớnh C ngi mang siờu vi B mn tớnh s cú ngi bi thiờt mng x gan v ung th gan sut cuc i ca h Siờu vi B cú th thõm lng tõn cụng gan nhiờu nm m bờnh nhõn khụng hờ hay biờt ờn bờnh nhõn cm thõy cõn i khỏm bờnh thỡ thng bờnh ó vo giai on cui Nhiờu bờnh nhõn ó chờt ung th gan khụng biờt th phm chớnh l siờu vi khun B Bờnh viờm gan siờu vi B cú th phat hiờn sm mt cach dờ dang nh vao cac xột nghiờm mau n gin Viờc phat hiờn sm viờm gan B mn tớnh giỳp gia tng hy vng ngn nga biờn chng x gan va ung th gan bng cach kham sc khe inh k va iờu tri vi nhng loi thuc c tri mi Tinh hinh nhiờm HBV trờn thờ gii Virus viờm gan B Virus viờm gan B( HBV) thuc h Hepadnaviridae la nhng virus cú kớch thc nh Cú loi tiờu th: hinh cõu nh (d=22nm), hinh cõu ln (d=42-45nm) va hinh cõu nh va hinh ng B gene gm mt DNA cú phõn gp ụi, khong 3.2 kilo cp base, to nờn cac antigen: HBsAg (khang nguyờn bờ mt): thuc lp v ca HBV dựng xột nghiờm mau biờt cú HBV c th HBcAg (khỏng nguyờn lừi): thuc lp lừi ca HBV - dựng biờt HBV ang phat trin HBeAg (khang nguyờn ni sinh): nờu cú mau bờnh nhõn ang cú kh nng lõy rõt cao Cõu trỳc b gene viờm gan B gen X : cú th la nguyờn nhõn to ung th gan gen P Hepatitis B virus Caỏu taùo boọ gen HBV Nuụi cõy Saccharomyces cerevisiae Nuụi cõy nõm men mụi trng 250C lc 250 rmp Khi o OD600 khong 0.4 - 0.6 dng lc Cho dung dich SDS Ly tõm 2500 rmp phỳt, 40C Lc tỏch kờt ta thu c dich protein Tach va tinh sch protein Mun thu nhn c cac protein nguyờn th tc la protein cú tõt c tớnh chõt t nhiờn c trng ca nú, cõn s dng cac biờn phap khac -Nhit -Nng proton (pH) -Tỏc nhõn húa hc Tinh sch protein 1.Loi b chõt -Phng phỏp thm tớch (dialysis) -Phng phỏp biờn tớnh chn lc - Phng phỏp kờt ta phõn on bng mui trung tớnh hoc cỏc dung mụi hu c, -Cỏc phng phỏp sc ký trao i ion, iờn di, phng phỏp lc gel Phng phap sc ký lc gel Cỏc phn t ln khụng thm vo ht sephadex Ht sephadex Hot ng ca lc phõn t sephadex Cỏc phn t nh thm vo cỏ ht sephadex Tỏch cỏc phõn t theo kớch thc bng sc ký lc gel Sn phm vacxin tỏi t hp HBsAg Thnh phn: Mt liờu 1ml bao gm: - Khang nguyờn bờ mt virỳt viờm gan B tinh khiờt 20 àg - Hydroxyt nhụm 0,5 mg - Thimerosal 0,01% (W/V) Qui trinh sn xuõt vacxin viờm gan b t huyờt tng ngi Vacxin thuc loi vacxin di n vi phõn khang nguyờn cú tớnh sinh miờn dich la protein v ca virus viờm gan b ( HbsAg) c tach va tinh chờ t huyờt tng ca nhng ngi mang virus viờm gan B nh cac k thut tach thụng thng nh kờt ta, cụ c, ly tõmvi 20 bc nh sau: Bc thu thp huyờt tng ngi mang HbsAg cú hiờu gia cao (>104-105) Bc to huyờt t huyờt tng (ta vi (NH4)2S04 30% nng cui), nhiờt phũng 30 phỳt, ly tõm 5000v/phỳt 20 phỳt/40c b cn, lõy dich ni Bc ta vi sulphatamol 50% (nng cui) qua ờm nhiờt phũng, ly tõm nh trờn B nc ni, cn Bc hũa cn vi KBr, khuõy ờu ớt nhõt gi nhiờt phũng, lng loi b cn bng phờu lc hỳt chõn khụng Bc iờu chnh dich cú t trng 1,32g/cm3 (thờm bt KBr) Bc chun bi mõy siờu li tõm HITACH55pp v onal rotor RPZ35T Bc cho cac dung dich vao rotor o Nc cõt d=1: 500ml o Dung dich KBr d = 1,3g/cm3: 400ml o Dung dich mu d=1,32g/cm3: 1000ml o Ly tõm 25000 v/phỳt 24 gi/20oc Lõy mu tng o Phõn on 30ml va xac inh HsbAg chỳng Trn cac phõn on cú HsbAg dng tớnh cao o Siờu li tõm lõn Bc cụ c ờn th tớch 300ml Bc siờu li tõm tng vựng vi sacaroza graddient (2 lõn) o Dung dich Nacl M :500ml o Dungdich mu :300ml o Dung dich sacaroza 10% : 300ml o Dung dich sacaroza 20% : 300ml o Dung dich sacaroza 30% : 300ml o Dung dich sacaroza 40% : 300mk o Li tõm 25000 v/phỳt 20 gi/10oc B qua 300 ml õu, lõy mu tng phõn on 30 ml va xac inh HsbAg chỳng Trn cac phõn on HsbAg cú hiờu gia cao Bc 10 cụ c dich (V=300ml) Bc 11 bõt hot HsbAg tinh khiờt 60oc/10 gi Lc qua mang lc 8um v 0,45um Bõt hot tiờp vi formaldehyt (nng cui 1:2000) 96 gi/37oc Bc 12 cụ c va thm tớch loi formaldehyt (bng Pellicon cassette) Kim tra tinh sch ca HbsAg (iờn di, kớnh hin vi iờn t) kim tra HBV-ADD tn d (PCA) Bc 13 kim tra ham lng HbsAg (o mt quang va ELISA) Bc 14 lc vụ trựng qua mang lc 0.22um Bc 15 hõp ph HbsAg vao gel Al(OH)3 va pha vacxin vi ham lng HbsAg 20ug/ml nng cui ca nhụm: 300ug/ml thờm chõt bo qun thimerosal nng 1:10000 Bc 16 lc ờu cac chai tuõn, lõn/tuõn Bc 17 lõy mu ban phm kim tra vụ khun, an toan, cụng hiờu, chõt gõy st va cac ch s húa hc Bc 18 úng l, dan nhón, úng gúi Bc 19 lõy mu kim tra chõt lng vacxinvoo khun, an toan, cụng hiờu, chõt gõy st va cac phõn húa hc Bc 20 xuaatss xng vacxin San phõm vaccine viờm gan B c iu ch t huyt tng ngi lnh mang khỏng nguyờn b mt virỳt viờm gan B (HBsAg) khụng cú triu chng lõm sng Thnh phn: Mt liờu 1ml bao gm: - Khang nguyờn bờ mt virỳt viờm gan B tinh khiờt 20 àg - Hydroxyt nhụm 0,5 mg - Thimerosal .0,01% (W/V) THE END THANK YOU FOR LISTENING [...]... bị biến nạp đắt tiền  Hóa biến nạp Đây là phương thức kinh điển để biến nạp plasmid vào tế bào E coli Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận plasmid Gồm 2 b ớc :  Chuẩn bị tế bào khả biến  Cấy plasmid vào b ng shock nhiệt Chuẩn bị tế bào khả biến Cấy ria trên mơi trường LB(Luria-Bertani) đặc (ni qua đêm, 370C)... trong 300 µL CaCl2 Tế bào khả biến được chia vào các ống eppendorf, mỗi ống 100 µL đem b o quản ở nhiệt độ -800C Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli JM109 b ng phương pháp sốc nhiệt B sung 5 µL DNA vector PMD 18 T vào ống eppendorf chứa 50 µL tế bào khả biến và giữ trên đá 20 phút Tế bào được sốc nhiệt ở 420C trong 30 giây sau đó giữ trên đá 2 phút Tế bào sau biến nạp được ni trong... vật chống lại b ̣nh b ng cách tiêm trực tiếp DNA vào cơ thể sinh vật • Tạo ra một đáp ứng miễn dịch DNA tái tổ hợp từ Saccharomyces cervisiae B ớc 1: Giải trình tự chuỗi, lựa chọn và thiết kế vector B ớc 2: Nhân dòng plasmide và biểu hiện cấu trúc vector B ớc 3: Phân tích và xác định gen đích  B ớc 4: Biến tính tế bào và đưa plasmide tái tổ hợp vào  B ớc 5: Tế bào sinh ra... nhất để biến nạp vi khuẩn - Hai thơng số quan trọng của phương thức này là Loại tế bào vi khuẩn Tần số xung điện cần thiết Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:  Hiệu śt biến nạp cao  Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20 μL  Có thể cho hiệu śt khoảng 109 thể biến nạp Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến...  B ớc 6: Kiểm tra chất lượng protein  B ớc 7: Phân loại và tinh sạch protein  B ớc 8: Thu nhận thành cơng protein đích Giải trình tự chuỗi Thực hiện PCR  Lấy mẫu và b o quản  Ly trích và tinh sạch  Kh́ch đại DNA b ng phản ứng PCR trong máy ln nhiệt  Kiểm tra và phát hiện sản < /b> phẩm kh́ch đại trên gel Agarose  Thực hiện phản ứng cắt  Điện di và phân tích kết quả Điện biến... plasmid (plasmid DNA extraction and purification) Đưa Plasmid vào Saccharomyces cerevisiae Tạo mơi trường khả biến:  Mơi trường LB  Cho dung dịch CaCl2 vào  Ni cấy Saccharomyces cerevisiae trên mơi trường Chi Saccharomyces Biến nạp b ng phương pháp sốc nhiệt Mơi trường LB khả biến đặt trong đá lạnh Cho plasmid pcDNA 3.1+ vào mơi trường Tiến hành ủ đá Cho vào nồi ủ nhiệt ở 42oC... sau biến nạp được ni trong 600 µL mơi trường LB (lắc 200 vòng/phút ở 370C, 60 phút) Cấy trải 100 µL dịch lên mơi trường LB rắn có b sung ampicillin (100mg/L) (370C, qua đêm) Thu nhận dòng cần Hind III EcoR1 Cắt plasmide Chuyển gen vào plasmide biểu hiện (pcDNA 3.1) Điện di Kết quả Tách chiết, thu nhận DNA của plasmid từ E.coli • Phá vỡ màng tế bào (lysis method) • Ly tâm (centrifugation)... trường LB lỏng, (lắc qua đêm ở 37 0C, 200 vòng/phút) Chuyển 1 mL dịch ni sang 100 mL mơi trường LB lỏng mới, tiếp tục ni lắc 37 0C, 200 vòng/phút Sau 2 – 3 giờ, khi OD600 đạt 0,375 Chuyển dịch sang 6 ống ly tâm 15 mL đã được giữ lạnh trong đá Dịch tế b o sau khi ly tâm 6000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút được rửa 2 lần b ng 3 mL CaCl2 60mM sau đó dịch hòa tan được giữ trong đá 30 phút B phần nổi,... tế bào Vacine là gì ? • Vaccine: là chế phẩm có tính kháng ngun dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân gây b ̣nh cụ thể Các dạng vaccine Phân loại theo nguồn gốc: Vaccine trùn thống Vaccine tái tổ hợp Vắc-xin kinh điển Vắc-xin b ́t hoạt Vắc-xin sống, giảm độc lực Các "toxoid“ Vaccine DNA • Loại kỹ thuật được sử dụng để b o... 40C  Lọc tách kết tủa thu được dịch protein Tách và tinh sạch protein Muốn thu nhận được các protein ngun thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau -Nhiệt độ -Nồng độ proton (pH) -Tác nhân hóa học…