Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 111-120 ẢNH HƯỞNG CỦA HỖN HỢP VI KHUẨN BACILLUS CHỌN LỌC LÊN LUÂN TRÙNG NƯỚC LỢ BRACHIONUS PLICATILIS Phan Thái Tuyết Anh1 Phạm Thị Tuyết Ngân1 Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 07/03/2014 Ngày chấp nhận: 30/12/2014 Title: Influence of selected mixture Bacillus bacteria on brackish rotifer Brachionus plicatilis Từ khóa: Brachionus plicatilis, Bacillus sp., cảm nhiễm Vibrio harveyi Keywords: Brachionus plicatilis, Bacillus, Vibrio harveyi challenging ABSTRACT The aims of this research were to study the impacts of mixed selective Bacillus sp bacteria on the growth of rotifers Brachionus plicatilis The first experiment was investigated the effects of a mixture of Bacillus sp and probiotic products on rotifer populations with two treatments and one control: (1) No adding bacteria for the control treatment, (2) Adding a mixture of Bacillus B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens), (3) Adding Pro W (probiotic products) to cuture rotifer medium In the second experiment, after accomplishing the first experiment, rotifers from each treatment were infected by Vibrio harveyi to determine the survival rate after the infection Results showed that the density of rotifers, carrying eggs in the treatments added Bacillus was significantly higher than those in the control (p0.05) TÓM TẮT Nghiên cứu ảnh hưởng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng luân trùng nước lợ Brachinonus plicatilis nghiên cứu Thí nghiệm I, khảo sát ảnh hưởng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chế phẩm vi sinh lên quần thể luân trùng, thí nghiệm bố trí nghiệm thức đối chứng: (1) Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn); (2) Bổ sung hỗn hợp vi khuẩn Bacillus B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens); (3) Bổ sung chế phẩm vi sinh Pro W lên tỷ lệ sống tỷ lệ tăng trưởng vi khuẩn Thí nghiệm II, sau kết thúc thí nghiệm I luân trùng nghiệm thức gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio harveyi, xác định tỷ lệ sống luân trùng sau gây cảm nhiễm Kết cho thấy mật độ luân trùng cá thể luân trùng mang trứng nghiệm thức bổ sung vi khuẩn cao có ý nghĩa thống kê so với đối chứng đạt giá trị cao nghiệm thức bổ sung hỗn hợp vi khuẩn B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens), vi khuẩn Bacillus có khả lấn át Vibrio Năng suất luân trùng cải thiện bổ sung vi khuẩn Bacillus chế phẩm vi sinh vào hệ thống nuôi Luân trùng nghiệm thức bổ sung Bacillus trì tỷ lệ sống cao gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio harveyi, nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê (p>0,05) 111 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 111-120 Kết cho thấy nhiều dòng vi khuẩn có tác dụng tăng suất nuôi luân trùng, kích thích trình sinh sản vô tính, làm thức ăn trực tiếp tăng cường hấp thu dinh dưỡng Do vậy, mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng loài vi khuẩn hữu ích lên quần thể luân trùng thông qua tiêu tăng trưởng tỉ lệ mang trứng luân trùng phòng thí nghiệm kiểm tra khả chịu đựng luân trùng cảm nhiễm với vi khuẩn gây bệnh Vibrio, để làm sở ứng dụng vào sản xuất, nâng cao suất chất lượng luân trùng GIỚI THIỆU Trong sản xuất giống thức ăn kỹ thuật cho ăn ương ấu trùng vấn đề quan trọng thức ăn tự nhiên đóng vai trò quan trọng định thành công ương nuôi nhiều loài động vật thủy sản (Trần Thị Thanh Hiền ctv., 2007) Luân trùng nước lợ (Brachionus plicatilis) nuôi sử dụng sản xuất giống 60 loài cá biển 18 loài giáp xác (Nagata, 1989) Nhờ có kích thước nhỏ, bơi lội chậm chạp, sống lơ lửng nước làm cho luân trùng trở thành mồi thích hợp cho ấu trùng loài cá giáp xác biển có kích thước miệng nhỏ (Snell Carrillo, 1984) Hơn nữa, đặc điểm ăn lọc không chọn lọc nên luân trùng giàu hoá chất dinh dưỡng cần thiết hay kháng sinh để đưa vào thể ấu trùng nuôi (Lubzens et al., 1989) Vì vậy, luân trùng trở thành nguồn thức ăn tươi sống thiếu sản xuất giống nhiều loài giáp xác cá biển PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm bao gồm lưới lọc có kích thước mắt lưới khác (30, 60 300 µm), nồi hấp tiệt trùng, kính lúp, máy đo pH, máy lắc, hệ thống sục khí Các trang thiết bị thu phân tích mẫu vi sinh, chất lượng nước Hóa chất: Glutaraldehyde 50 ppm, dung dịch Lugol, Chlorine, KI, thiosulfate natri (Na2S2O3) Môi trường chuyên biệt cho Bacillus, Nutrient Agar (NA) Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS) Nguồn nước lấy từ nguồn nước máy, nước ót (100‰) có nguồn gốc từ ruộng muối Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng Nước dùng cho nuôi luân trùng (25‰) pha từ nguồn nước Nước sau pha xử lý chlorine (30 ppm) 24h Sau dùng KI để kiểm tra hàm lượng Clo trước đưa vào sử dụng Nếu chlorine trung hòa thiosulfate natri (Na2S2O3) Các nhà nghiên cứu từ lâu quan tâm đến việc nghiên cứu đặc điểm sinh học, kỹ thuật nuôi số loại thức ăn tươi sống cho ấu trùng động vật thủy sản Quan tâm đối tượng chủ yếu như: vi tảo, luân trùng, giáp xác râu ngành, Artemia, trùng (Trần Thanh Hiền ctv., 2007) Nhật Bản nơi thực nghiên cứu nuôi sinh khối luân trùng vào năm 1964 (Hirata, 1979; trích từ Trần Công Bình, 2006) Ở Trung Quốc, năm 1980, nghiên cứu luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá biển tiến hành (Chen, 1991; trích dẫn từ Trần Thị Thanh Hiền ctv, 2007) Ở Hoa Kỳ, năm 1971, Theilaccker McMaster công bố lần kết nghiên cứu Brachionus plicatilis thức ăn tuyệt vời cho ấu trùng cá biển (Wendy Kenvan, 1991) Tuy nhiên, đến luân trùng nuôi qui mô thí nghiệm, chủ yếu phục vụ cho ương nuôi loài Mullet, cá măng, Pacific threatfin mahimah, Red drum, cá chẽm trắng California halibut Sản lượng nuôi ngày thường đạt 100500 triệu con, suất trung bình 25,7-75 cá thể/ml/ngày.) Luân trùng có nguồn gốc từ trường Đại học Gent, Bỉ nuôi giữ giống Phòng thí nghiệm nuôi thức ăn tự nhiên thuộc Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng Luân trùng nhân giống tháng trước tiến hành thí nghiệm Các dòng vi khuẩn Bacillus gồm B7, B41 (B amyloliquefaciens) có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú huyện Vĩnh Châu, Tỉnh Sóc Trăng (Phạm Thị Tuyết Ngân Nguyễn Hữu Hiệp, 2011) Tảo Chlorella sử dụng cho luân trùng ăn với lượng 100.000 tế bào/luân trùng/ngày đêm (Trần Sương Ngọc Nguyễn Hồng Lộc, 2006) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp sát trùng luân trùng để tạo non vô trùng Hino (1991) cho thay đổi quần thể vi khuẩn hay nhiễm tạp loài khác ảnh hưởng đến trình nuôi luân trùng Các loại vi khuẩn bể nuôi luân trùng phát triển có ảnh hưởng có lợi hay có hại tùy thuộc vào loại vi khuẩn Các nghiên cứu chủ yếu dựa tác động dinh dưỡng vi khuẩn đến vật nuôi Để có mật số luân trùng mong muốn tỷ lệ luân trùng mang trứng cao, trước bố trí thí nghiệm luân trùng nhân giống cách nuôi keo nhựa 10 L, với mật độ nuôi ban 112 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 111-120 đầu 250 – 300 cá thể/mL Luân trùng cho ăn tảo Chlorella Sau luân trùng mang trứng tiến hành sát trùng luân trùng để ấu trùng vô trùng theo qui trình ứng dụng Trung tâm Khảo cứu Artemia, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Gent, Bỉ (Nguyễn Thị Ngọc Tinh et al., 2010) Thí nghiệm thực chu kỳ nuôi, chu kỳ kéo dài ngày Sau chu kỳ nuôi thu lại luân trùng nghiệm thức nuôi hoàn toàn Nguồn giống chu kỳ thứ lấy từ chu kỳ thứ 1, tiếp tục chu kỳ Thí nghiệm 2: Gây cảm nhiễm luân trùng với Vibrio sau bổ sung Bacillus Chất khử trùng sử dụng: Glutaraldehyde, nồng độ sử dụng 200 ppm, thời gian sát trùng nước biển 25‰ tiệt trùng Qui trình thực sau: Trứng amictic từ luân trùng mang trứng đếm tính toán để có mật độ luân trùng mong muốn ban đầu theo nhu cầu thí nghiệm Sau luân trùng mang trứng rửa với nước biển 25‰, lọc qua lưới có kích thước mắt lưới 300 µm sau rửa lại nhiều lần qua lưới 60 µm Cô đặc luân trùng trước tiến hành cho dung dịch glutaraldehyde 200 ppm vào Sau giờ, luân trùng ống lọc qua lưới 60 µm nhằm loại bỏ xác luân trùng chết sau lọc rửa lại nhiều lần qua lưới 30 µm để giữ lại tất trứng amictic, trứng ấp chai chứa 250 mL nước 25‰ đặt máy lắc Sau trứng amictic nở ra, để yên khoảng phút luân trùng chết lắng hết xuống đáy Tiến hành thu phần đổ vào chai mới, xác định số lượng luân trùng nở tiến hành bố trí thí nghiệm Quần thể luân trùng chu kỳ thu vào cuối thí nghiệm 1, giữ riêng luân trùng theo nghiệm thức riêng biệt Bố trí thí nghiệm tương tự thí nghiệm (2 nghiệm thức đối chứng), nghiệm thức đối chứng bổ sung vi khuẩn V harveyi, mật độ gây cảm nhiễm 107 CFU/mL, thí nghiệm thực ngày 2.2.2 Các tiêu theo dõi Chỉ tiêu nhiệt độ pH đo cuối chu kỳ nuôi Các yếu tố NO2, TAN đo ngày/lần; tiêu vi khuẩn (vi khuẩn tổng cộng, Bacillus Vibrio) cuối chu kỳ nuôi tiêu sinh học (số luân trùng, tỷ lệ luân trùng mang trứng) xác định ngày 2.3 Phương pháp thu thập, tính toán xử lý số liệu 2.3.1 Chỉ tiêu môi trường vi sinh Bố trí thí nghiệm Nhiệt độ đo nhiệt kế thủy ngân pH đo máy đo pH Các tiêu NO2 TAN đo theo phương pháp Indo – phenol blue Dianozium (APHA, 1995) a Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus lên tăng trưởng quần thể luân trùng Luân trùng vô trùng bố trí ống falcon 50 mL với mật độ ban đầu 30 cá thể/mL đặt mày lắc Thí nghiệm gồm nghiệm thức bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nghiệm thức lần lặp lại Các nghiệm thức bố trí sau: Vi khuẩn Bacillus B7, B41 trữ phòng vi sinh cấy truyền môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn Bacillus môi trường TSA NA, sau dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường TSB, để lên máy lắc nhiệt độ 30C Sau 24 thấy ống nghiệm chứa dung dịch vi khuẩn chuyển sang màu đục Chuyển mL dung dịch chứa vi khuẩn sang bình tam giác có chứa 450 mL môi trường lỏng (TSB) Sau 24 thu 500 mL dung dịch chứa vi khuẩn cần nuôi tăng sinh b Phương pháp phân tích mẫu vi sinh môi trường thạch  Nghiệm thức 1: Không bổ sung vi khuẩn (đối chứng: ĐC)  Nghiệm thức 2: Bổ sung vi khuẩn B7+ B41 (B amyloliquefaciens), mật độ 107 CFU/mL  Nghiệm thức 4: Bổ sung chế phẩm vi sinh Pro W mật độ 107 CFU/mL  Thành phần chế phẩm vi sinh Pro W g:  Bacillus subtilis 2.5 × 1012 CFU/g  Bacillus licheniformis  Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus phương pháp đếm khuẩn lạc (Nguyễn Lân Dũng, 1983) 12 2.5 × 10 CFU/g 113 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 111-120  Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn tổng cộng Vibrio phương pháp đếm khẩn lạc (Baumann et al., 1980) 2.4 Chỉ tiêu sinh học vào nhiều yếu tố hấp thu nguồn đạm khác dẫn đến biến đổi pH môi trường có tảo b Tổng đạm ammon TAN Luân trùng đếm ngày để xác định tỷ lệ sống Mật độ luân trùng xác định ngày cách sử dụng micropipet 100 µL, cố định nhuộm màu Lugol Sau đếm kính lúp, không đếm không bắt màu Lugol (luân trùng chết) Tỷ lệ sống (%) = (Nc/No) x 100 (Nc: Số luân trùng lúc kết thúc thí nghiệm; No: Số luân trùng lúc bắt đầu thí nghiệm) Hệ số trứng: HST(%) = n/N (n: Số cá thể luân trùng mang trứng, N: Tổng số luân trùng đếm) 2.5 Xử lý số liệu Kết biến động hàm lượng TAN thí nghiệm trình bày Hình cho thấy nghiệm thức hàm lượng TAN có khuynh hướng tăng nhanh cao, nghiệm thức ĐC có hàm lượng TAN trung bình thấp (18,13 ± 6,8 mg/L) cao nghiệm thức B7 + B41 (21,54 ± 11,8 mg/L) khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức đối chứng nghiệm thức lại qua chu kỳ thu mẫu (p0,05), nhiệt độ biến động, nhiệt độ dao động khoảng 25,3 – 29,50C Nhiệt độ dao động không đáng kể thí nghiệm bố trí phòng thí nghiệm điều kiện môi trường, tác động nhiệt độ bên vào Theo Fulks (1991) nhiệt độ dao động thích hợp cho luân trùng 20 – 300C nhiệt độ thí nghiệm nằm khoảng thích hợp cho phát triển luân trùng pH có khuynh hướng giảm chu kỳ nuôi sử dụng thức ăn hoàn toàn tảo nên cuối vụ lượng tảo dư thừa bắt đầu phân hủy làm tăng lượng CO2 làm giảm pH, giá trị pH phụ thuộc 114 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 111-120 Hình 1: Hàm lượng TAN trung bình chu kỳ nuôi thí nghiệm c Nitrite (NO2- ) chu kỳ khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức B7 + B41 với nghiệm thức lại (p