Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Đại học Thái Nguyên Đại học Sư phạm Tổng quan chuyển gen Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Học viên thực hiện: Phạm Thị Oanh Chuyên ngành: Di truyền học – K16 Thái Nguyên - 2009 liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Khái Tài niệm: Kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật cho phép chuyển gen lạ vào thể (tế bào chủ) (Gen gắn vào vectơ tạo thành dòng tái tổ hợp) Các bước chuyển gen: - Nhân gen mà mong muốn chuyển - Tạo dịng - Thiết kế vectơ chuyển gen - Chuyển gen vào tế bào chủ - Nuôi cấy mô tế bào - Tạo thể chuyển gen phịng thí nghiệm - Đưa thể chuyển gen môi trường đánh giá Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 1: Sơ đồ chuyển gen plasmid Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2: Sơ đồ chuyển gen thực khuẩn lamda Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Phương pháp chuyển gen: 3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.1.1 Dùng súng bắn gen * Nguyên lý: - Tạo DNA tái tổ hợp - Bọc vào ba kim loại: Vàng, Vonfam, Tungsten để tạo viên đạn nhỏ (0,5 - 1,5 µm) - Các viên đạn bắn vào tế bào với tốc độ cao (1300m/s) * Ưu điểm: Tham tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào * Nhược điểm: Tốn nên sử dụng Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.1.2 Phương pháp xung điện * Nguyên lý - Tạo DNA tái tổ hợp - Tạo tế bào trần - Sử dụng thiết bị xung điện tạo điện cao (200 - 400v) khoảng thời gian 4/1000 s để tạo lỗ thủng tế bào trần để giúp cho DNA tái tổ hợp xâm nhập vào hệ gen tế bào 3.1.3 Phương pháp siêu âm * Nguyên lý - Tạo DNA tái tổ hợp - Tạo tế bào trần - Sử dụng máy siêu âm để tạo lỗ thủng màng tế bào trần giúp cho DNA tái tổ hợp xâm nhập vào hệ gen tế bào Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.1.4 Phương pháp sử dụng hóa chất Hóa chất thường dùng là: polyethylen Glycol (PEG) * Nguyên lý - Tạo DNA tái tổ hợp - Tạo tế bào trần - Bổ xung PEG vào môi trường có tế bào trần để tạo lỗ thủng tế bào trần để giúp cho DNA tái tổ hợp xâm nhập vào hệ gen tế bào 3.1.5 Phương pháp vi tiêm * Nguyên lý - Tạo DNA tái tổ hợp - Tạo tế bào trần - Tiêm trực tiếp DNA tái tổ hợp vào nhân tế bào qua pipet thủy tinh đặc biệt Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.1.6 Phương pháp chuyển gen qua ống phấn Phương pháp áp dụng lúa * Ngun lý Sử dụng ống mao quản có đường kính 0,2 mm để đưa DNA tái tổ hợp vào theo đường ống phấn bầu nhụy 3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.2.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium có đặc điểm: - Gây bệnh khối u thân - Dễ xâm nhiễm vào tế bào thực vật qua vết trầy xước - Có plasmid - Ti Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3: Ảnh plasmid - Ti Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Plasmid - Ti có kích thước khoảng 200kb, có vùng: - Vùng A (T-DNA): có hệ gen gây khối u hệ gen mã hóa cho số enzyme (Opine) - Vùng B: liên quan đến tái sinh - Vùng C: liên quan đến tiếp hợp - Vùng D (vùng độc): chứa gen virulence có vai trị chuyển T - DNA vào hệ gen nhân tế bào thực vật Sử dụng plasmid - Ti thiết kế vector chuyển gen * Các loại vector dựa plasmid - Ti: - Vector liên hợp: có kết hợp loại plasmid: + Plasmid - Ti loại bỏ vùng gây khối u + Plasmid trung gian có đoạn tương đồng với phần bị loại bỏ plasmid - Ti Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 4: Sơ đồ hệ thống vector liên hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình Vectơ liên hợp pGV 3850 vectơ trung gian pGV 1103 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình Sơ đồ hệ thống vectơ nhị thể liệu chia sẻ Vectơ nhịTàitheerpBin 19 tại: ( dowWw.SinhHoc.edu.vn Binvan thiết kế) - Plasmid thứ có nguồn gốc từ pUC 19 E.Coli - Plasmid thứ hai plasmid - Ti lại vùng gen Vir Hình Vectơ nhị thể pBin 19 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2.2 Chuyển gen nhờ virus * Virus cần đảm bảo yêu cầu: - Hệ gen phải DNA - Có khả chuyển từ tế bào sang tế bào khác vách tế bào - Có khả mang DNA - Không gây hại cho thực vật * Ưu điểm: - Virus dễ nhập lây lan thể thực vật - Virus mang đoạn DNA lớn sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Thành Tài tựuliệu củachia kỹ thuật chuyển gen 4.1 Tạo vi sinh vật chuyển gen * Mục đích: Tạo vi sinh vật sản xuất sản phẩm mong muốn * Ví dụ: - Tạo chủng vi khuẩn E.Coli sản xuất insulin người - Tạo chủng vi khuẩn E.Coli sản xuất somatostatin - Tạo nấm men chuyển gen 4.2 Tạo động vật chuyển gen - Dùng làm mơ hình thí nghiệm - Dùng để sản xuất protein số lượng lớn - Dùng để tạo chủng mang đặc tính q - Tạo giống động vật có suất cao Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình Quy trình tạo giống bị chuyển gen sản xuất r-protein người A.Phương pháp vi tiêm B.Phương pháp chuyển gen cải tiến Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 4.3 Tạo thực vật chuyển gen * Mục đích: - Tạo kháng thuốc diệt cỏ, virus, côn trùng - Tạo trồng sản xuất protein với hàm lượng chất lượng cao - Tạo trồng có đặc tính q (chịu hạn, mặn, rét ) - Tạo trồng sản xuất hợp chất đặc biệt - Tạo giống hoa nhiều màu sắc Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình Cà chua chuyển gen Hình 10 Lúa chuyển gen A.Giống lúa chuyển gen tổng hợp β-caroten B.Giống lúa bình thường Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hạn chế kỹ thuật chuyển gen - Các gen chưa phân lập nghiên cứu nhiều - Quy trình chuyển gen chưa tối ưu hoàn thiện - Phương pháp biểu gen sau biến nạp chưa hoàn chỉnh - Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào tái sinh chuyển gen hạn chế - Sinh vật chuyển gen nhiều tranh cãi phản đối nhà sinh học giới (lo ngại sức khỏe, môi trường, kinh tế vv…) Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn