KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT Ths Bùi Hồng Quân 09.09.25.24.19/09.17.27.26.25 Email: buihongquan@hui.edu.vn Website: www.buihongquan.tk GBD giữ gìn màu xanh cho quê hương, xây dựng tương lai từ chất lượng sống ĐỊNH NGHĨA • Sự cố định tế bào vi sinh vật trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự dung dịch, có khả trao đổi chất với phân tử chất có mặt phase tự nói • Cố định vi sinh vật việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan nước Tế bào sau cố định sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm chủ động ngừng phản ứng mong muốn PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP • • • • Trên bề mặt chất mang Trong lòng chất mang Không mang chất mang Một số phương pháp khác: gel lạnh sâu, cố định liên hợp, nhờ photopolymer CHẤT MANG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO • Vai trò: – Đóng vai trò định lựa chọn phương pháp – Quyết định tính hiệu trình cố định YÊU CẦU • Điểm quan tâm lựa chọn chất mang phải rẻ tiền Điều liên quan đến hiệu kinh tế quy trình công nghệ, đặc biệt quy trình ứng dụng vào quy mô công nghiệp • Chất mang phải có tính chất lý bền vững, ổn định Nhờ mà chất mang chịu điều kiện môi trường khuấy trộn, áp lực quy trình sản xuất • Về mặt hóa học chất mang phải bền vững, không tan môi trường phản ứng • Chất mang không làm hay ức chế hoạt tính enzyme vi sinh vật YÊU CẦU • Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với công vi sinh vật • Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học • Chất mang phải chọn lọc cho cố định vi sinh vật dễ dàng • Chất mang sử dụng nhiều lần • Chất mang phải an toàn cho môi trường sống • Chất ang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất chất mang vừa tăng khả cố định vi sinh vật vừa tăng khả tiếp xúc chất với enzyme, nhờ làm tăng hoạt tính enzyme số lần tái sử dụng • Chất mang có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng PHÂN LOẠI • Polysaccharide: cellulose, alginate, carrageenan… • Protein: collagen, keratin… • Hữu tổng hợp: polysaccharide, polyvinylacetate… • Vô tự nhiên: than hoạt tính, zeolit, silicate… • Vô tổnh hợp: silicagel, Al2O3… ƯU ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH • • • • • • • • • • • Mật độ tế bào cao Sản phẩm Có thể tái sử dụng nhiều lần Chịu tác động bên Điều chỉnh kích thước khối vi sinh vật cố định phù hợp với môi trường phản ứng, reactor Enzyme tế bào xúc tác phản ứng hóa sinh, không tan nước Kích thước thiết bị nhỏ, gọn Quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi Sử dụng nhiều loại chất, quy trình thiết kế đơn giản Chất lượng sản phẩm đồng Tế bào cố định bảo vệ bị ức chế chất sản phẩm cuối NHƯỢC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH • Hoạt lực thấp tế bào tự • Trong môi trường phản ứng sử dụng tế bào cố định, không tránh khỏi tượng rửa trôi tế bào khỏi chất mang Các tế bào lẫn vào sản phẩm, dẫn đến khó khăn việc chiết tách, tinh sản phẩm, gây tốn chi phí • pH hoạt động tối ưu bị chuyển dịch sang kiềm hay acid so với tế bào bình thường • Tế bào cố định đòi hỏi dinh dưỡng đầy đủ để hoạt động bình thường, thực trao đổi chất • Cơ chất muốn vào tế bào để thực trao đổi chất tạo sản phẩm phải qua chất mang, thành tế bào, màng tế bào…Các chất ảnh hưởng đến thẩm thấu vào chất sản phẩm CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TẾ BÀO CỐ ĐỊNH • Bản thân chất mang polymer ngăn cản khuếch tán tự phân tử theo hướng tới enzyme khỏi enzyme từ ảnh hưởng tới hiệu xúc tác enzyme • Nếu cố định chất mang có phân tử lượng cao: giảm đáng kể hoạt tính chúng bề mặt so với chất mang có phân tử lượng thấp • Các tính chất lý hoc chất mang: tính kỵ nước, háo nước, hòa tan, bền học…đều ảnh hưởng định đến khả cố định • Bản chất hóa học chất mang ảnh hưởng đáng kể tới khả hấp phụ lên chất Ảnh hưởng khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác • Tốc độ khuếch tán chất, sản phẩm chất khác phụ thuộc vào yếu tố: – Kích thước lỗ gel chất mang polymer – Trọng lượng phân tử chất – Sự chênh lệch nồng độ vùng môi trường vi mô xung quanh vi sinh vật dung dịch tự – Những giới hạn khuếch tán thể dạng hàng rào khuếch tán bên bên Ảnh hưởng khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác • Rào khuếch tán bên xuất có tồn lớp mỏng dung môi bao xung quanh hạt polymer • Các chất khuếch tán vào lớp nhờ kết hợp khuếch tán phân tử thụ động đối lưu • Độ dày lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung dịch xung quanh hạt chứa tế bào cố định • Việc gia tăng tốc độ pha trộn làm giảm rào khuếch tán bên • Trong quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò quan trọng Ảnh hưởng vi sinh vật • Thành phần hóa học, cấu tạo màng ế bào, kích thước, hình dạng…của loài vi sinh vật khác ảnh hưởng khác đến việc lựa chọn kỹ thuật cố định tế bào vào chất mang • Bản chất hay hình dạng loài vi sinh vật định kiểu liên kết độ bền kiểu liên kết hình thành tế bào vi sinh vật chất mang • Trạng thái sinh lý hoạt tính loài vi sinh vật ảnh hưởng đến liên kết độ bền liên kết CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT • Yêu cầu chung phương pháp cố định tế bào vi sinh vật: – – – – Đơn giản Độ lặp lại lớn Không gây biến tính Cho phép dễ dàng kiểm soát số lượng tế bào cố định – Các tế bào không bị rửa trôi khỏi chất mang trình sử dụng bảo quản PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT CHẤT MANG • PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ • PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ • Định nghĩa: chất liên kết cộng hóa trị nối tế bào với chất mang thông qua “cầu nối” Cầu nối phải có kích thước không lớn có hai đầu, đầu nối polymer, đầu nối tế bào • Chất mang: cellulose, dẫn xuất cellulose, agarose, silicagel, bentonit… • Cách tiến hành: – Theo giai đoạn: chất mang có khả liên kết trực tiếp tế bào Việc gắn hiệu diện tích tế bào chất mang có dấu ngược – Theo hai giai đoạn: hoạt hóa chất mang Thường ứng dụng để cố định enzyme PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ • Định nghĩa: ??? Trong trình cố định vi sinh vật cách hấp phụ có liên kết sau hình thành: – Liên kết tĩnh điện Van der walls: tế bào bề mặt chất mang tạo nên chênh lệch điện bề mặt chất mang bề mặt tế bào giúp tế bào chất mang gắn liền – Liên kết mao quản: chất mang có mao quản, ngâm huyền phù vi sinh vật hình thành lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào long chất mang – Liên kết ion: bề mặt chất mang vi sinh vật có mang ion trái dấu, nhờ tế bào vi sinh vật liên kết chất mang PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ • Chất mang: – Chất mang cấu trúc xốp: thủy tinh – Chất mang cấu trúc lỗ xốp: than hoạt tính – Chất mang có điện tích: nhựa trao đổi ion • Cách tiến hành: – Phương pháp cổ điển – Phương pháp cổ điển có cải tiến – Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT TRONG CẤU TRÚC GEL • Định nghĩa: – Polymer tạo màng lưới bao xung quanh tế bào – Mạng lưới có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui khỏi mạng, đồng thời đủ lớn cho chất sản phẩm tạo ra vào dễ dàng • Các phương pháp: – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật ion gel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật covalent gel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật cryogel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật noncovalent gel CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG • Cố định tế bào vi sinh vật liên kết chéo tế bào vi sinh vật • Cách tiến hành: – Các tế bào liên kết với tạo thành khối tế bào – Tác nhân liên kết: glutaraldehyde, toluene, diisocyanate, hexamethylene • Vai trò tác nhân: – Tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật – Phản ứng với thành tế bào vi sinh vật CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG • Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật màng chắn membrane: • Ví dụ tế bào vi khuẩn A.xylinum mạng lưới cellulose, tế bào nấm men cố định mạng lưới cellulose CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG ALGINATE • Tính chất tạo gel dung dịch alginate: – Một tính chất quan trọng alginate khả tạo gel điều kiện định – Khi cho kết hợp cation hóa trị II III, thường dung Ca2+ xuất vùng nối mạch phân tử alginate tạo gel theo mô hình “hộp trứng” CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG ALGINATE • Phương pháp cố định sử dụng chất mang alginate: – Alginate ứng dụng làm chất cố định tế bào có đặc điểm: alginic acid polyanion nên dễ dàn khâu mạch tạo gel dung dịch CaCl2 KCl, alginic acid có khả bao xung quanh tế bào – Phương pháp cố định tế bào dung chất mang alginate phổ biến phương pháp bẫy tế bào lòng chất mang – Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật chất mang alginate nhỏ vào dung dịch đa diện để thực phản ứng tạo mạng lưới gel – Qua đó, tế bào vi sinh vật cố định hệ thống mạng lưới vừa hình thành CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG CARRAGEENAN • Chất mang carageenan: – Carrageenan phân tử polymer mạch thẳng, gồm ~ 25000 dẫn xuất galactose xếp cách cân đối – Tính chất tạo gel carrageenan: – Một tính chất quan trọng khả tạo gel – Carrageenan hình thành gel điều kiện làm lạnh dung dịch nóng chứa số loại cation, đặc biệt K+ Ca2+ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG CARRAGEENAN • Được thực theo phương pháp nhốt long chất mang – Làm lạnh đông huyền phù tế bào carrageenan xuống nhiệt độ thấp nhiệt độ nóng chảy – Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật chất mang carrageenan nhỏ vào dung dịch đa diện để thực phản ứng tạo mạng lưới gel • Tế bào vi sinh vật cố định hệ thống mạng lưới vừa đựơc hình thành [...]... cố định tế bào vi sinh vật trong covalent gel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cryogel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong noncovalent gel CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG • Cố định tế bào vi sinh vật bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật • Cách tiến hành: – Các tế bào liên kết với nhau tạo thành khối tế bào – Tác nhân liên kết: glutaraldehyde, toluene, diisocyanate,... hexamethylene • Vai trò của các tác nhân: – Tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật – Phản ứng được với thành tế bào vi sinh vật CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG • Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane: • Ví dụ tế bào vi khuẩn A.xylinum trong mạng lưới cellulose, tế bào nấm men cố định trong mạng lưới cellulose CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG ALGINATE • Tính chất tạo gel của dung dịch... mang • Bản chất hay hình dạng loài vi sinh vật sẽ quyết định kiểu liên kết và độ bền kiểu liên kết hình thành giữa tế bào vi sinh vật và chất mang • Trạng thái sinh lý cũng như hoạt tính của loài vi sinh vật ảnh hưởng đến liên kết và độ bền của những liên kết đó CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT • Yêu cầu chung của các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật: – – – – Đơn giản Độ lặp lại lớn... CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT TRONG CẤU TRÚC GEL • Định nghĩa: – Polymer tạo màng lưới bao xung quanh tế bào – Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui ra khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn cho cơ chất và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng • Các phương pháp: – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong ion gel – Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong covalent gel – Phương pháp cố. .. khả năng bao xung quanh tế bào – Phương pháp cố định tế bào dung chất mang alginate phổ biến là phương pháp bẫy tế bào trong lòng chất mang – Hỗn hợp huyền phù của tế bào vi sinh vật và chất mang alginate được nhỏ vào dung dịch đa diện để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel – Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa được hình thành CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG CARRAGEENAN... xung quanh các hạt chứa tế bào cố định • Vi c gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch tán bên ngoài • Trong bất kỳ quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò hết sức quan trọng Ảnh hưởng của vi sinh vật • Thành phần hóa học, cấu tạo màng ế bào, kích thước, hình dạng…của những loài vi sinh vật khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến vi c lựa chọn kỹ thuật cố định tế bào đó vào chất mang... biệt là K+ và Ca2+ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG CARRAGEENAN • Được thực hiện theo phương pháp nhốt trong long chất mang – Làm lạnh đông huyền phù tế bào và carrageenan xuống nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy – Hỗn hợp huyền phù của tế bào vi sinh vật và chất mang carrageenan được nhỏ vào dung dịch đa diện để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel • Tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống... biến tính Cho phép dễ dàng kiểm soát được số lượng tế bào cố định – Các tế bào không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng hoặc bảo quản PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT CHẤT MANG • PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ • PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ • Định nghĩa: bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào với chất mang thông qua “cầu nối” Cầu nối này... nối tế bào • Chất mang: cellulose, dẫn xuất của cellulose, agarose, silicagel, bentonit… • Cách tiến hành: – Theo một giai đoạn: chất mang có khả năng liên kết trực tiếp tế bào Vi c gắn sẽ hiệu quả hơn nếu diện tích của tế bào và chất mang có dấu ngược nhau – Theo hai giai đoạn: hoạt hóa chất mang Thường được ứng dụng để cố định enzyme PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ • Định nghĩa: ??? Trong quá trình cố định vi sinh. .. vi sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau được hình thành: – Liên kết tĩnh điện Van der walls: giữa tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thế giữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào giúp tế bào và chất mang gắn liền nhau – Liên kết mao quản: chất mang có các mao quản, khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào