Polymerase Chain Reaction Tp Hồ Chí Minh 24-9-2014 Taq polymerase • DNA polymerase chịu nhiệt, dễ tinh nhiệt • Tổng hợp DNA theo chiều 5’  3’ • Exonuclease 5’  3’ • Tổng hợp 50 – 60 nu/s Taq polymerase • Không có hoạt tính sửa sai (proof-reading) – Tổng hợp sai 1/10.000 nu – Tạo sản phẩm PCR sai trình tự • Sản phẩm dài – kb • Bền nhiệt: 40 phút/95 oC, • Gắn thêm adenine (A) đầu 3’ sản phẩm – Có ích tạo dòng TA kit Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai • Tli : Thermococcus litoralis – Bền 95 oC Giữ hoạt tính sau 1h 95 oC • Pfu: Pyrococcus furiosus Thiết kế primer • Chiều dài – Ngắn: dễ bắt cặp  không chuyên biệt – Dài : Khó bắt cặp  chuyên biệt – 20 – 30 nu • Bắt cặp sai (mismatches) – Đầu 3’ primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?) – Đầu 5’ primer không cần bắt cặp hoàn toàn với khuôn mẫu  chèn trình tự nhận biết RE Thiết kế primer • Nhiệt độ nóng chảy (Tm) – mồi có nhiệt độ nóng chảy tương tự  thành phần ATGC tương đương • Cấu trúc thứ cấp nội – Tránh tự bắt cặp • Primer dimer: primer bắt cặp với Thiết kế primer • Primer dimer: primer bắt cặp với Thiết kế primer • Tránh thiết kế primer từ trình tự amino acid  why? • Tránh thiết kế primer từ trình tự nucleotid amino acid liên quan – Tránh tự bắt cặp ( sử dụng cloning gene tương đồng) • Primer dimer: primer bắt cặp với Cần quan tâm • Nhiễm lẫn – Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học phòng thí nghiệm – Thao tác cẩn thận, giữ nơi thí nghiệm • Sản phẩm không đồng – Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác bị suy thoái (degradation) – Hiệu enzyme polymerase Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Hot-start PCR – Giảm bắt cặp không đặc hiệu primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn – Cho enzyme polymerase vào dung dịch đạt nhiệt độ bắt cặp tối thích – Bọc enzyme muối Mg sáp – Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Touch-down PCR – Giảm bắt cặp không đặc hiệu primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn – Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Nested-PCR Tăng độ chuyên biệt Hardcopies Hard-copies Hardcopies Inverse PCR Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) RT-PCR Quantitative PCR (qPCR) – Kết khuếch đại DNA thể qua chu kỳ nhiệt – Sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (ex: SYBER Green) – Hoặc sử dụng đoạn đầu dò đặc hiệu mang chất phát huỳnh quang (ex: Taq man probe) Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống SYBER Green Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống Taqman probe PCR mỏ neo (anchored PCR) Các loại PCR khác • Multiplex – PCR • Mutagenesis • Asymmetric PCR • Isothermic amplification (Loop mediated isothermal amplification) [...]...Ứng dụng 1 Giải trình tự DNA 2 Chẩn đoán - Xác định tính trạng di truyền - Phát hiện sinh vật gây bệnh - Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm 3 Pháp y 4 Đa dạng di truyền quần thể 5 Khảo cổ học và tiến hóa Cần quan tâm • Kích thước sản phẩm – Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước sản phẩm khoảng 10 kb (Long-rang PCR) – Cần kéo dài thời... không đồng nhất – Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác nhau hoặc bị suy thoái (degradation) – Hiệu quả của enzyme polymerase Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Hot-start PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt nhiệt độ bắt cặp tối thích – Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp – Sử dụng antibody bất hoạt... (qPCR) Hệ thống SYBER Green Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống Taqman probe PCR mỏ neo (anchored PCR) Các loại PCR khác • Multiplex – PCR • Mutagenesis • Asymmetric PCR • Isothermic amplification (Loop mediated isothermal amplification)