Chương Các enzyme chủ yếu Nguyễn Vũ Phong Enzyme cắt giới hạn • Loại I: Cắt đoạn vài chục nu cách vị trí nhận biết từ 1000 - 5000 nu • Loại II: nhận biết trình tự chun biệt cắt vị trí nhận biết • Loại III: Nhận biết trình tự cắt cách trình tự nhận biết khoảng 20 nu Enzyme cắt giới hạn • RE cắt DNA vị trí chun biệt, có trình tự xác định Enzyme cắt giới hạn Trình tự nhận biết số enzym cắt hạn chế Gắn đoạn linker Enzyme terminal transferase Isochizomer • MboI Sau3AI nhận biết trình tự • Trình tự nhận biết BamHI Methyl hóa (methylation) EcoRI khơng cắt Methyl hóa (methylation) • dam (DNA adenine methylase) • dcm (DNA cytosine methylase) Phản ứng cắt RE • Buffer (dung dịch đệm) – (H): dung dịch đệm hoạt độ ion cao – (M): hoạt độ ion trung bình – (L): hoạt độ ion thấp Thường chuẩn bị dạng stock (X10), giữ 0C/ 1-2 tuần; -20 0C Reverse transcriptase • Tổng hợp DNA mạch đơn (c-DNA, complementary DNA) từ sợi mRNA từ polyribonucleotide tổng hợp RNA polymerase • Tổng hợp RNA từ khn DNA theo chiều 5’3’ • SP6 RNA pol : 96 kDa , từ Salmonella typhimurium LT2 bị xâm nhiễm thực khuẩn thể SP6 • T7 RNA pol : 98 kDa sản xuất thực khuẩn thể T7 • RNA pol sử dụng tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn • SP6 T7 RNA pol cần Mg2+ khn DNA sợi đơi • Mỗi loại SP6 T7 RNA pol cần promoter đặc hiệu phiên mã DNA DNA ligase • Tạo liên kết phosphodiester nhóm 5’ phosphate 3’-OH vị trí hở sợi đơn DNA sợi đơi • Nối đoạn DNA đầu đầu dính, thêm linker/adaptor hay sửa vị trí hở (nick) • Khơng bền nhiệt gồm DNA ligase từ Chlorella virus thực khuẩn thể T7 (34 kDa, 41 kDa), thực khuẩn thể T4 (68 kDa) • DNA ligase bền nhiệt phân lập từ nguồn vi khuẩn chịu nhiệt, hoạt động nhiệt độ từ 45 – 80 oC DNA ligase • E coli DNA ligase: nối đầu so le • T4 DNA ligase sử dụng nhiều SHPT, đơn phân có khối lượng 68 kDa cần Mg2+ ATP để hoạt động • T4 DNA ligase nối đầu đầu so le hay sửa vị trí hở (nick) sợi đơn sợi đơi DNA, RNA tổ hợp lai DNA/RNA RNA ligase • RNA ligase xúc tác hình thành nối phosphodiester đầu 5’ phosphate 3’-OH RNA sợi đơn hay phân tử DNA • T4 RNA ligase Loại nhóm phosphate • Alkaline phosphatase (AP) – Tinh từ E coli sinh vật bậc cao, – Sử dụng để loại nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acid nhằm ngăn chặn đóng vịng DNA vector thí nghiệm tạo dịng • AP bị bất hoạt tác nhân tạo phức (chelating agents) EGTA, nồng độ thấp phosphate vô Chuyển nhóm phosphate • T4 polynucleotide kinase xúc tác phản ứng chuyển nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH nucleic acid • Hay phosphoryl hố đầu 3’ mononucleotide Nuclease • Phân cắt liên kết phosphodiester chuỗi nucleic acid – Exonuclease cắt hai đầu phân tử nucleic acid – Endonuclease phân cắt vùng bên phân tử • Deoxyribonuclease phân cắt DNA tạo khe hở (nicks) • Ribonuclease cắt RNA Nuclease DNase I (deoxyribonuclease I): endonuclease phân cắt sợi đơi/đơn DNA có mặt ion hóa trị vị trí nằm sau base pyrimidine (T, C) - Có Mg2+ : enzyme tạo nick sợi đơi DNA - Có Mn2+ : enzyme cắt hai sợi DNA • Nick translation • Cắt ngẫu nhiên đoạn DNA • Tinh RNA từ tế bào hay hỗn hợp phiên mã Nuclease DNase I (deoxyribonuclease I) • Glycoprotein, 31 kDa , thường dạng hỗn hợp gồm isoenzyme (A, B, C, D) • Bị bất hoạt 75 oC 5’ với EGTA mM • Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt vị trí 3’ pyrimidine (C/T) Nuclease Exonuclease III (exodeoxyribonuclease III) 3’-exonuclease, xúc tác loại bỏ nucleotide khỏi đầu 3’-OH sợi đôi DNA Phosphatase, loại bỏ gốc phosphate chuỗi DNA kết thúc với nhóm 3’-phosphate Rnase H, phân giải sợi RNA tổ hợp lai DNA/RNA Endonuclease, phân cắt base lỗi (apurinic, apyrimidic) khỏi khung đường phosphate DNA Nuclease Rnase T1 : 11 kDa , Aspergillus oryzae, có hoạt tính endonuclease phân cắt đặc hiệu RNA sợi đơn base G Rnase T2 : 36kDa, Aspergillus oryzae, cắt tất liên kết phosphodiester RNA S1 nuclease: 31 kDa, phân cắt RNA DNA sợi đơn thành 5’ mononucleotide Dùng xác định dạng lai nucleic acid, đánh dấu vùng DNA sợi đôi, loại vùng sợi đơn DNA dạng so le Nuclease Exonuclease VII: 88 kDa Phân giải đặc hiệu DNA sợi đơn (từ đầu phân tử) Dùng để tạo DNA đầu bằng; Đặc biệt dùng loại bỏ primer khỏi phản ứng PCR Ribonuclease Ribonuclease tuỵ (RNAse A) Cắt sợi đơn RNA nucleoside 3’-phosphate 3’phospho-oligonucleotide kết thúc với Cp/Up Giảm nhiễm RNA ly trích plasmid DNA Lập đồ đột biến DNA/RNA cách phân cắt vị trí khơng tương đồng RNAse A hoạt động điều kiện khác khó bất hoạt Ribonuclease Ribonuclease H (RNAse H) Phân giải đặc hiệu RNA phức hợp lai RNA/DNA Phân giải RNA probe phản ứng lai Loại bỏ đuôi poly-A đầu 3’ mRNA RNAse H có hoạt tính tối đa điều kiện pH 7,5 – 9,1 với có mặt tác nhân khử, ion Mg2+/Mn2+ Enzyme bị ức chế N-ethylmaleimide mức thấp nồng độ ion cao