1 MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Vi sinh vật có khắp nơi xung quanh phân, nước thải, rác, bụi, thực phẩm Trong không khí thể nơi vi sinh vật sinh sống, chúng sống kí sinh da (đặc biệt bàn tay), miệng, đường hô hấp, đường tiêu hóa, Đặc biệt thức ăn, nước uống đường để vi sinh vật xâm nhập gây bệnh cho người Hiện nay, ngộ độc thực phẩm vi sinh vật gây vấn đề cấp bách xã hội quan tâm Việc gây ngộ độc cho người phụ thuộc vào loại độc tố vi sinh vật, tuổi tác tình trạng sức khỏe người Một số loài vi sinh vật gây bệnh cho người cần phải quan tâm vi khuẩn Campylobacter spp Chúng nguyên nhân gây 4-15% trường hợp ngộ độc Đó vấn đề nước phát triển phát triển có liên quan đến sản phẩm sữa chưa tiệt trùng, nước bị ô nhiễm, gia cầm nông sản Đối với mặt hàng trên, thị trường nhập Hoa Kỳ, EU, Úc, Anh, Nhật Bản, Mexico, đưa tiêu chuẩn nghiêm ngặt mặt hàng Campylobacter spp tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh tiêu chảy giới Theo ước tính Trung tâm Kiểm soát Phòng ngừa Bệnh Mỹ năm có 2,4 triệu người Mỹ mắc “bệnh nhiễm khuẩn Campylobacter” Hầu hết bệnh nhân hồi phục sau vài ngày bị khó chịu, bệnh đe dọa mạng sống người có hệ miễn dịch bị tổn hại, kể bệnh nhận bị AIDS Ngoài ra, biến chứng nghiêm trọng gặp bệnh nhiễm khuẩn campylobacter làm khởi phát chứng rối loạn tự miễn dịch- gọi hội chứng liệt Guillain-Barré Ở nước phát triển, đối tượng chủ yếu bị nhiễm Campylobacter spp trẻ em tuổi bên cạnh tình hình nhiễm Campylobacter spp ngày gia tăng nước phát triển phát triển tỷ lệ chủng kháng thuốc không ngừng tăng lên đặc biệt với fluoroquinolone (FQ), họ kháng sinh thường dùng để điều trị tiêu chảy nhiễm Campylobacter spp Ở Việt Nam, Campylobacter spp tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy trẻ em tuổi thành phố Hồ Chí Minh Vi khuẩn chiếm 17,63% tổng số 363 trường hợp tác nhân vi khuẩn 1420 bệnh nhi tiêu chảy từ tháng 6/2009 đến tháng 5/2010 Xuất phát từ thực tiễn tình hình nhiễm Campylobacter spp giới Việt Nam tiến hành thực :”Đánh giá có mặt vi khuẩn Campylobacter spp mẫu thịt gà tươi số địa điểm Hải Phòng” nhằm đưa khuyến cáo vấn đề an toàn thực phẩm, hạn chế lây nhiễm Campylobacter spp địa bàn Hải Phòng Mục tiêu - Đánh giá có mặt Campylobacter spp thực phẩm tươi, đưa khuyến nghị định việc sử dụng thực phẩm thịt gà Hải Phòng - Cung cấp kiến thức Campylobacter spp phân lập thực phẩm để mở đầu cho nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng vi khuẩn Campylobacter spp - Phạm vi nghiên cứu: Trên mẫu thịt gà tươi thu thập chợ, phòng thí nghiệm siêu thị BigC địa bàn Hải Phòng • Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu thịt gà Hải Phòng - Phân lập nhận dạng Campylobacter spp từ mẫu thịt gà - Đánh giá có mặt Campylobacter spp từ mẫu thịt gà Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu mẫu: thu theo tiêu chuẩn TCVN 6507-2: 2005 - Phương pháp nuôi cấy: nuôi tăng sinh vi khuẩn môi trường chọn lọc - Phương pháp phát hiện: nhuộm Gram, thử nghiệm oxidase, thử nghiệm catalase, đách giá phát triển vi khuẩn Campylobacter spp điều kiện nuôi cấy khác CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN CAMPYLOBACTER SPP 1.1.1 Lịch sử phát Campylobacter spp chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh người gia súc toàn giới Chúng miêu tả lần vào năm 1886 Theodor Escherich Vào thời gian đó, Escherich miêu tả loại vi khuẩn hình que có ruột kết trẻ em chết bệnh “cholera infantum” Năm 1909, hai nhà bác sĩ thú y McFadyean Stockman miêu tả kết hợp vi sinh vật chưa biết với bệnh dịch sảy thai cừu cái, vi khuẩn giống với phẩy khuẩn – I Và vào năm 1919, điều tra trường hợp sảy thai truyền nhiễm bò Mỹ, Smith phân lập vi khuẩn ông miêu tả xoắn khuẩn – spirillum Sau Smith cho nhóm McFadyean Stockman nghiên cứu vi khuẩn Và với Taylor, Smith khẳng định điều đề xuất tên vi khuẩn ‘Vibirio fetus’ Cho đến tháng năm 1938, kiện lớn xảy Illinos (Mỹ), xem trường hợp có đầy đủ tài liệu dẫn chứng nhiễm Campylobacter người Sự kiện liên quan đến trận dịch tiêu chảy sữa nhiễm Campylobacter, ảnh hưởng đến 355 người Sau vào năm 1947, Vinzent phân lập V fetus từ máu ba người phụ nữ mang thai nhập viện sốt mà không rõ nguyên nhân Bệnh kéo dài tuần hai ba người phụ nữ bị sảy thai Vào năm 1957, Elizabeth King miêu tả phẩy khuẩn với nhiều đặc điểm chung với tác nhân miêu tả Vinzent khác đặc đểm sinh hóa tính kháng nguyên Mãi đến năm 1963 giống Campylobacter (nghĩa “vi khuẩn hình que có dạng cong”) đề xuất Sebald Veron nhận vi sinh vật không sử dụng đường có hàm lượng G+C khác với Vibrio spp Tuy nhiên chưa có phương pháp nuôi cấy, phân lập Campylobacter thích hợp có trường hợp nhiễm Campylobacter người báo cáo Mãi năm 1972, phương pháp phân lập loài Campylobacter chịu nhiệt phát triển Dekeyser Butzler Phương pháp liên quan đến việc lọc mẫu phân qua màng lọc 0,64 µm dịch lọc đem nuôi cấy Phương pháp tốn công thời gian vào năm 1977, Martin Skirrow từ phòng thí nghiệm sức khỏe cộng đồng Worcester, miêu tả kĩ thuật trực tiếp đơn giản nuôi cấy trực tiếp mẫu phân lên đĩa môi trường thạch máu có chứa vancomycin, polymyxin, trimethoprim Các đĩa sau ủ 42ºC môi trường vi hiếu khí chứa 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Từ trở có nhiều thay đổi phương pháp, điều cho phép phòng thí nghiệm vi sinh chẩn đoán lâm sàng phân lập Campylobacter từ mẫu phân bệnh nhân Đến năm 1983, Ruiz-Palacios C.S phát độc tố Campylobacter ruột non Cũng năm Park C.E, Stankiewiez ZK, Lowett J, Hunt J công bố ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian ấp trứng, pH môi trường đến phục hồi Campylobacter ruột gà Năm 1985, Lai-King N, Stiles ME, Tayler-DE ức chế thành công C.coli C.jejuni kháng sinh cách sử dụng môi trường kháng sinh chọn lọc Và đến năm 1987: Harris NV, Kimball TJ, Bennett T, Jonson Y phát bệnh lí Campylobacteriosis có liên quan đến việc sử dụng sữa chưa tiệt trùng Tính đến năm 1989, Campylobacter gồm có 18 loài, phân loài với 17 tên thức công nhận Ủy ban quốc tế vi khuẩn học có hệ thống tên loài đề xuất không thức Các phương pháp phân lập cải tiến dẫn đến đời báo cáo tính thường xuyên việc vi khuẩn Campylobacter gây bệnh người Từ dẫn đến loạt nghiên cứu dịch tễ Campylobacter nhận Campylobacter vấn đề báo động cho sức khỏe cộng đồng nước phát triển phát triển 1.1.2 Hình thái, cấu trúc số đặc điểm sinh hóa Campylobacter vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử Tế bào tất thành viên thuộc giống Campylobacter nhỏ, có dạng cong, có hình chữ S hay có dạng xoắn (dài 0,5-5 µm rộng 0,2-0,8 µm) Chúng di động với tiêm mao phân cực nằm đầu hay hai đầu tế bào tạo nên kiểu di động hình xoắn ốc Campylobacter vi khuẩn hiếu khí hiếu khí tùy ý Chúng sử dụng sản phẩm chu trình Kreb amino acid để phát triển không lên men hay oxi hóa carbohydrate Campylobacter spp có gen nhỏ 1,6 – 1,7 Mbp, điều giải thích phần nuôi cấy phòng thí nghiệm chúng lại đòi hỏi điều kiện dinh dưỡng phức tạp Các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm phản ứng khử fumarate thành succinate, methyl red âm tính, tạo acetoin indole Hầu hết loài khử nitrate oxidase dương tính Campylobacter thay đổi hình thái từ dạng xoắn sang dạng hình cầu chịu stress từ môi trường bên hay mẻ nuôi cấy thời gian dài Dạng vi khuẩn hình cầu có khuynh hướng khó nuôi cấy tính di động Trạng thái “còn sống không nuôi cấy được”(viable but non culturable-VBNC) có lẽ cho phép Campylobacter tồn môi trường khắc nghiệt C jejuni C coli sinh vật vi hiếu khí ưa nhiệt Nhiệt độ phát triển tốt 42ºC đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% nồng độ CO 3-5% Ưa nhiệt cho đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường ruột động vật chim Đặc điểm sinh lý học C jejuni C coli có độ tương đồng cao, khác kiểu hình C jejuni cho phản ứng thủy phân hippurate có khoảng 5% C jejuni không thực phản ứng Hình 1.1 Hình dáng Campylobacter quan sát kính hiển vi điện tử truyền suốt (A) sau nhuộm Gram (B) 1.1.3 Phân loại Từ giống Campylobacter đề xuất vào năm 1963 Sebald Veron có đời quy trình phân lập thích hợp, ngày có nhiều vi sinh vật giống Campylobacter (Campylobacter-like organisms - CLOs) phân lập từ nhiều nguồn người, động vật, môi trường Sau vi sinh vật giống Campylobacter xác định loài Campylobacter Từ năm 1974 đến 1988 có tất 14 loài loài Campyloacter phát môi trường sống khác gây bệnh khác (tổng kết Vandamme Goosens năm 1992) Bảng 1.1 Phân loại giống Campylobacter gồm có 18 loài loài: Giới Ngành Lớp Bộ Họ Giống Loài Bacteria Proteobacteria Epsilon Proteobacteria Campylobacterales Campylobacteraceae Campylobacter C.coli,C.concisus,C.curvus,C.fetus(C.fetussubsp.fetus ,C.fetus subsp.venerealis),C.gracilis,C.helveticus,C.hyoilei, C.hyointestinalis(C.hyointestinalis subsp.hyointestinalis,C.hyointestinali subsp.lawsonii),C.insulaenigrae,C.jejiun(C.jejiun subspjejiun,C.jejiunsubsp.doylei),C.lanienae, C.lari,C.mucosalis,C.rectus,C.showae,C.sputorum, C.upsaliensis, C.hominis 1.2 ĐẶC ĐIỂM GÂY BỆNH VÀ ĐIỀU TRỊ CAMPYLOBACTER SPP 1.2.1 Đặc điểm gây bệnh 1.2.1.1 Campylobacteriosis Campylobacteriosis bệnh truyền nhiễm lây từ động vật sang người – zoonosis, vi khuẩn thuộc giống Campylobacter gây Bệnh thường biết đến bệnh đường ruột hay bệnh viêm dày - ruột xảy người tiêu thụ thức ăn hay nước bị nhiễm khuẩn Dạng bệnh Campylobacteriosis gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng bệnh viêm dạ-dày ruột hai loài C coli C jejuni gây Liều nhiễm gây bệnh thấp, khoảng 10 - 500 tế bào, thể cao tùy theo nhạy cảm với vi khuẩn người Thời gian ủ bệnh thường từ 24 đến 72 lâu số lượng vi khuẩn ban đầu thấp 1.2.1.2 Khả gây bệnh Mỗi liều nhiễm độc từ Campylobacter spp cho người khoảng 500 tế bào Tuy nhiên mức độ biểu bệnh người khác phụ thuộc vào sức đề kháng người bị nhiễm Campylobacter spp Bệnh viêm đường ruột loại tiêu biểu cho khả tự đề kháng người bệnh Hầu hết tiêu chảy cấp tính gặp người khỏe mạnh đột ngột bị mắc bệnh, bệnh có khả tự khỏi sau nhiều ngày vài tuần Độc tố gây tiêu chảy chia làm loại: độc tố trợ lực gây tiết dịch hoạt hóa enzyme tế bào andenylat cyclase không gây tổn thương tế bào, độc tố gây độc gây tổn thương tế bào biểu mô gây tiết dịch không hoạt hóa enzyme Cơ chế gây bệnh Campylobacter spp bao gồm kết hợp gắn vào biểu mô ruột, xâm nhập vào biểu mô ruột tiết độc tố Bệnh nhiễm với vi khuẩn Campylobacter jejuni dẫn đến triệu chứng viêm khớp Lúc đầu chưa có biểu viêm khớp phát triển vòng từ vài ngày đến vài tuần sau giai đoạn nhiễm bệnh cấp tính Kháng thể để chống lại Campylobacter jejuni cao loài vi khuẩn bị tách ly khỏi khớp xương bị nhiễm 1.2.1.3 Các biểu lâm sàng  Nhiễm trùng dày- ruột Campylobacter chịu nhiệt (C coli C jejuni) hai tác nhân gây nhiễm trùng đường ruột chủ yếu toàn giới C jejuni gây 80-85% số trường hợp viêm dày - ruột nhiễm Campylobacter 10-15% trường hợp C coli Triệu chứng quan sát tiêu chảy Bệnh nhân tiểu nước, máu có tế bào máu màu trắng hay màng nhầy Các triệu chứng thường gặp khác đau bụng, kèm theo nôn mửa Ngoài sốt, đau đầu, suy nhược chán ăn triệu chứng xảy trước bị tiêu chảy Thông thường bệnh nhiễm trùng đường ruột phát triển vòng đến ngày sau tiêu thụ thức ăn nhiễm bẩn triệu chứng tự hết vòng tuần Liệu pháp dùng thuốc sử dụng trừ diễn biến bệnh trở nên nghiêm trọng hay bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Bệnh có tỉ lệ tái phát cao, lên đến 20% bệnh nhân triệu chứng bệnh thường nhẹ so với lần đầu  Nhiễm trùng hệ thống Campylobacter vi khuẩn xâm lấn, gây nhiễm trùng hệ thống Tuy vậy, tần số nhiễm trùng máu gây nên Campylobacter thấp (0,1%) đặc biệt so sánh với Salmonella Tỉ lệ C fetus gây nhiễm trùng hệ thống cao loài Campylobacter chịu nhiệt C jejuni C coli Đây loài Campylobacter phân lập trường hợp nhiễm trùng hệ thống mà không thấy trường hợp nhiễm trùng ruột Biểu bệnh sốt có tượng di số mô màng mạch máu (gây phình mạch máu, viêm tĩnh mạch, viêm màng tim), xương, khớp xương, màng não…Bệnh nhiễm trùng hệ thống không điều trị nguy hiểm có tới 15% trường hợp dẫn đến tử vong  Những biểu sau nhiễm trùng Cũng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác, C jejuni gây biểu sau nhiễm trùng hay gọi di chứng Mặc dù di chứng xảy sau nhiễm Campylobacter lại nghiêm trọng gây chết Di chứng quan trọng hội chứng Guillian – Barre (GBS), với tỷ lệ 1000 – 3000 trường hợp nhiễm Campylobacter, chủ yếu C jejuni (41%) Hội chứng bệnh lí viêm đa dây thần kinh cấp tính, sợi thần kinh bị bao myelin, gây cảm giác, yếu cơ, phản xạ dây chằng GBS xảy hệ miễn dịch thể tiết kháng thể công bao myelin có thành phần tương tự kháng nguyên Campylobacter tạo  Các yếu tố gây bệnh Cơ chế gây bệnh Campylobacter chưa biết xác gặp khó khăn trình thao tác gen, thiếu mô hình động vật mô hiệu bệnh nhiễm trùng đường ruột người hay thay đổi độc lực chủng khác Tuy nhiên vào năm 2000 sau gen C jejuni NCTC 11168 giải trình tự hoàn tất cho phép xác định số yếu tố gây độc đường ruột giả định Campylobacter sau: a) Tiêm mao Tính di động cần thiết để vi khuẩn di chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ tế bào đường ruột Nhờ tiêm mao phân cực hình dáng xoắn lại cho phép Campylobacter di động, thâm nhập cách hiệu qua lớp rào cản màng nhầy Vai trò di động yếu tố gây bệnh chứng minh đột biến không tiêm mao làm cho Campylobacter khu trú đường ruột động vật thí nghiệm Ngoài vai trò giúp cho Campylobacter di động, tiêm mao kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh suốt trình gây nhiễm trình tạo kháng thể chống lại tiêm mao có liên quan tới trình bảo vệ thể chống lại bệnh Cấu trúc tiêm mao có chứa vùng bảo tồn cao vùng hay thay đổi, biến đổi glycosyl hóa sau dịch mã Việc sử dụng thành công tiêm mao tái tổ hợp bao gồm vùng bảo tồn vắc xin chống lại Campylobacter hai mô hình chuột cho thấy tầm quan trọng tiêm mao chế gây bệnh C jejuni b) Tính hóa hướng động Tính hóa hướng động khả nhận biết thang nồng độ hóa chất di chuyển qua thang nồng độ Cả tính di động hóa hướng động cần thiết cho khu trú C jejuni đột biến tính hóa hướng động làm cho C jejuni sống đường ruột mô hình động vật 10 c) Sự bám dính xâm lấn Một đặc điểm quan trọng chế gây bệnh C jejuni khả bám thâm nhập vào tế bào chủ Trong trình gây nhiễm, Campylobacter di chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ tế bào biểu mô, bám chặt vào tế bào này, sau xâm lấn tế bào biểu mô Sự xâm lấn dẫn đến phá hủy lớp màng nhầy gây tượng viêm mà thường quan sát thấy trường hợp nhiễm Campylobacter Nguyên nhân trình xâm lấn C jejuni cảm ứng nhiều yếu tố kích hoạt trình viêm cytokine interleukine Tiêm mao lần yếu tố C jejuni xác định liên quan đến bám dính xâm lấn đột biến tiêm mao làm cho C jejuni giảm tính di động đồng thời giảm tính bám dính khả xâm nhập Một số yếu tố khác giúp cho Campylobacter bám vào tế bào biểu mô protein gắn vào khoảng gian bào PEP, protein nằm màng gắn vào fibronectin CadF số yếu tố khác d) Sản sinh độc tố Sự sản sinh độc tố góp phần vào trình gây bệnh Campylobacter bên tế bào chủ Mặc dầu có nhiều nghiên cứu cho có sản sinh cytotoxin độc tố đường ruột – enterotoxin hay hai Campylobacter chế hoạt động vai trò gây bệnh chúng chưa rõ ràng Cho đến có độc tố CDT (cytolethal distending toxin) độc tố Campylobacter xác nhận trình tự gen C jejuni NCTC 11168 có chứa gen gây độc cdt Độc tố CDT C jejuni mã hóa operon gồm gen (cdtABC) thể đột biến cdt gồm gen làm hoạt tính CDT Độc tố CDT khiến cho phần lớn loại tế bào thể người trở nên sưng phồng lên từ từ cuối dẫn đến tiêu hủy tế bào Hầu hết chủng C jejuni có hoạt tính CDT cao chủng C coli thường cho thấy hoạt tính độc tố thấp Nguyên nhân khác chưa giải thích 1.2.2 Chuẩn đoán điều trị 1.2.2.1 Chuẩn đoán lâm sàng Triệu chứng nhiễm Campylobacter tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau đầu, suy nhược Tuy nhiên triệu chứng khó phân biệt với bệnh đường ruột vi khuẩn khác Salmonella, Shigella E.coli 0157:H7 34 Bảng 3.5 Mẫu lấy trực tiếp phòng thí nghiệm Tên mẫu Kết khẳng định catalase Có bọt khí Không có bọt khí Mẫu A – (-) Mẫu A – (+) Mẫu A – (-) Mẫu A – (-) Mẫu A – (+) Mẫu B – (+) Mẫu B – (-) Mẫu B – (-) Mẫu B – (+) Chú thích: Mẫu A: mẫu lấy chợ Đôn, quận Lê Chân Mẫu B: mẫu lấy chợ Đầm Triều, quận Kiến An 1-5: vị trí khuẩn lạc lấy đĩa thạch Còn mẫu lấy phòng thí nghiệm, kết cho thấy: mẫu A với khuẩn lạc thứ và mẫu B với khuẩn lạc thứ cho kết dương tính Các khuẩn lạc lại cho kết âm tính Như vậy, có xuất vi khuẩn Campylobacter spp mẫu A với khuẩn lạc thứ và mẫu B với khuẩn lạc thứ 35 Bảng 3.6 Mẫu lấy siêu thị Big C: Tên mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu A A A A A B B B B B C C C C C D D D D D D E E E E E E – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 5 5 6 Kết khẳng định catalase Có bọt khí Không có bọt khí (+) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) Chú thích: Mẫu A: mẫu rửa cánh gà Mẫu B : mẫu rửa chân gà Mẫu C: mẫu rửa toàn thân gà Mẫu D E: mẫu rửa đùi gà 1-6: vị trí lấy khuẩn lạc đĩa thạch Đối với mẫu rửa thân thịt BigC ta nhận kết sau: khuẩn lạc 1, mẫu A, khuẩn lạc mẫu B, khuẩn lạc mẫu C, khuẩn lạc 36 mẫu D khuẩn lạc mẫu E cho kết dương tính Các khuẩn lạc lại cho kết âm tính Như thấy xuất khuẩn lạc Campylobacter spp vị trí mẫu A, mẫu B C, mẫu D mẫu E Các khuẩn lạc đánh số thứ tự lấy mẫu thịt gà nuôi môi trường thạch máu cừu kết thử nghiệm oxidase catalase Khuẩn lạc giả định Campylobacter spp thông qua phản ứng sinh hóa nghi ngờ có mặt mẫu thịt gà thí nghiệm Để khẳng định xác có mặt vi khuẩn Campylobacter spp đem khuẩn lạc dương tính thử nghiệm tiếp môi trường thạch huyết Columbia 3.2.5 Thử nghiệm thạch huyết Columbia Thử nghiệm sinh hóa catalase oxidase khẳng định có mặt vi khuẩn Campylobacter spp .Tiếp tục tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc lên môi trường thạch huyết Columbia Khả làm tan huyết môi trường thạch máu giúp ta khẳng định thêm lần xác có xuất Campylobacter spp mẫu thịt gà thí nghiệm hay không Đồng thời dựa vào khả sinh trưởng điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện có khả sống điều kiện nhiệt độ tương đối cao với nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng tốt 42 0C, tiến hành với hai điều kiện nhiệt độ 25ºC 41,5ºC Sau nuôi cấy môi trường thạch máu, để khuẩn lạc phát triển nhiệt độ khác môi trường ủ khác đĩa thạch mẫu lấy chợ cho thấy khuẩn lạc nghi ngờ khuẩn lạc điển hình cho Campylobacter khuẩn lạc nghi ngờ đem nuôi cấy cho dương tính Bước đầu cho thấy hai mẫu thịt gà lấy chợ chưa có thấy xuất Campylobacter Mẫu chợ 37 A-2 A-2 B-3 B-3 Hình 3.8:Khuẩn lạc phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí Hình 3.9: Khuẩn lạc phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí Mẫu phòng thí nghiệm B-1 B-1 B-4 A-2 A-5 B-4 A-2 A-5 Hình 3.10: Khuẩn lạc phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí Hình 3.11: Khuẩn lạc phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí Tiếp tục thử khuẩn lạc nghi ngờ hai mẫu thịt gà lấy phòng thí nghiệm Mỗi mẫu lấy khuẩn lạc nghi ngờ Sau nuôi cấy môi trường khác ủ thời gian khác kết cho thấy, khuẩn lạc nghi ngờ dương tính Bước đầu cho thấy hai mẫu thịt gà lấy phòng thí nghiệm chưa phát vi khuẩn Campylobacter Mẫu bigC 38 B-1 C-1 B-1 B-2 C-2 B-2 Hình 3.12: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa chân toàn thân gà phát triển 41,5º môi trường hiếu khí A-1 D-3 C-1 A-5 E-6 Hình 3.14: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa cánh đùi thứ 1, phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí C-2 Hình 3.13: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa chân toàn thân gà phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí D-3 A-1 E-6 A-5 Hình 3.15: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa cánh đùi thứ 1, phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí 39 Sau thời gian nuôi cấy để xác định xuất khuẩn lạc mẫu rửa thân thịt Big C, ta nhận thấy mẫu rửa toàn thân chân khuẩn lạc cho dương tính Tuy nhiên mẫu rửa đùi số sau thời gian nuôi cấy khuẩn lạc lên âm tính Chứng tỏ khuẩn lạc đem thử mẫu rửa đùi có xuất khuẩn lạc Campylobacter Nhìn vào kết sau tiến hành thử nghiệm sinh hóa ta thấy khuẩn lạc nghi ngờ đem thử nghiệm có xuất Campylobacter spp Các khuẩn lạc lại có hình dạng giống với khuẩn lạc điển hình Campylobacter spp thực chất lại Campylobacter spp Mặc dù phản ứng catalase oxidase phản ứng hóa sinh đặc trưng nhận biết vi sinh vật hiếu khí kỵ khí, tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc giả định dương tính lại không xác Campylobacter spp .Thử nghiệm sinh hóa môi trường thạch máu thấy có xuất vi khuẩn Campylobacter mẫu rửa đùi số siêu thị Big C 40 41 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Bằng Phương pháp phân tích vi sinh vật nuôi cấy môi trường chọn lọc đặc trưng qua thử nghiệm sinh hóa, bước đầu khẳng định có xuất vi khuẩn Campylobacter spp mẫu thịt gà chợ địa bàn Hải Phòng, cụ thể siêu thị BigC - Có xuất vi khuẩn Campylobacter spp phần da đùi gà Khuyến cáo: - Bảo quản chế biến thịt gà riêng tránh làm nhiễm với loại thực phẩm khác - Luôn sử dụng dụng cụ nấu riêng cho loại thực phẩm sống chín - Đối với thịt gà nên giữ điều kiện đông lạnh giúp kìm hãm phát triển Campylobacter spp - Rửa tay sau chế biến gà sống nấu chín hoàn toàn trước ăn - Để tránh lây nhiễm chéo Campylobacter spp có thịt gà, nên vệ sinh nhà bếp dụng cụ xà nước nóng, trước chế biến thực phẩm khác 4.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục khảo sát số mẫu thịt gà địa điểm khác nhằm đưa đánh giá chuẩn xác định tính định lượng vi khuẩn Campylobacter spp Sử dụng thêm phương pháp sinh học phân tử đại PCR, ELISA bên cạnh phương pháp phân tích vi sinh vật truyền thống để xác định xác cụ thể tên chủng loài vi khuẩn Campylobacter spp thịt gà loại thực phẩm khác Việt Nam cần xem xét xây dựng rào cản pháp lý chặt chẽ, góp phần quản lý nghiêm ngặt sản phẩm thực phẩm thịt gà thực phẩm khác có vi sinh vật Campylobacter spp , nhằm hạn chế khả nhiễm bệnh ngộ độc thực phẩm 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bộ Y tế (2009), “Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy trẻ em” Merck, An toàn vệ sinh thực phẩm, tiêu chuẩn ISO môi trường dạng hạt TCVN 7715-3:2013 ( ISO/ TS 10272-3: 2010) Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 2010 Tài liệu nước ngoài: Allos, B (2001), "Campylobacter jejuni Infections: update on emerging issues and trends", Clin Infect Dis, 32, pp 1201-6 Coker AO, I R., Thomas BN, Amisu KO, Obi CL (2002), "Human campylobacteriosis in developing countries", Emerging Infectious Diseases, 8, pp 237-243 Dao, H.-T A Y., PT (2006), "Study of Salmonella, Campylobacter, and Escherichia coli Contamination in Raw Food Available in Factories, Schools, and Hospital Canteens in Hanoi, Vietnam", Annals of the New York Academy of Sciences, 1196, pp 262–265 Friedman CR, e a 2000 Epidemiology of Campylobacter jejuni infections in the United States and other industrialized nations Oberhelman RA, T D 2002 Campylobacter infection in developing countries 10 Padungton, P., and J B Kaneene (2003), "Campylobacter spp in human, chickens, pigs and their antimicrobial resistance", J Vet Med Sci, 65, pp 161-70 11 Westrell, N C., F Boelaert, B Helwigh, H Korsgaard, M Chríel, A Ammon, P Mäkelä (22 January 2009), "Zoonotic infections in Europe in 2007: a summary of the EFSAECDC annual report", Eurosurveillance, 14 43 PHỤ LỤC Mẫu gà lấy chợ Lạc Viên, quận Ngô Quyền, thành phố Hải Phòng Mẫu gà lấy chợ Ngô Quyền, quận Ngô Quyền, thành phố Hải Phòng Lấy mẫu gà trực tiếp chợ phòng thí nghiệm Bổ sung dung dịch tăng sinh Bolton Broth Dập mẫu máy dập Mẫu sau dập trước đem ủ 44 Lấy mẫu rửa thân thịt đùi gà Lấy mẫu rửa thân thịt cánh gà Bổ sung dung dịch tăng sinh sau rửa mẫu Mẫu sau ủ môi trường vi hiếu khí Cách lấy máu cừu điều kiện vô trùng Bổ sung nước vào gói vi hiếu khí trước đem ủ mẫu 45 Cấy ria mẫu lên môi trường chọn lọc sau ủ mẫu Mẫu sau cấy ủ môi trường vi hiếu khí 46 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại giống Campylobacter gồm có 18 loài loài: Error: Reference source not found Bảng 1.2 Tỉ lệ phân lập Campylobacter nước phát triển từ nghiên cứu bệnh tiêu chảy trẻ em tuổi [9] Error: Reference source not found Bảng 1.3 Các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy trẻ em tuổi phân lập Hồ Chí Minh từ năm 2009 – 2010 (n =1420) Error: Reference source not found Bảng 2.1 Thành phần môi trường tăng sinh Bolton Broth Error: Reference source not found Bảng 2.2 Thành phần môi trường thạch mCCD .Error: Reference source not found Bảng 2.3 Thành phần môi trường thạch huyết Columbia Error: Reference source not found Bảng 3.1 Mẫu lấy chợ Error: Reference source not found Bảng 3.2 Mẫu lấy trực tiếp phòng thí nghiệm Error: Reference source not found Bảng 3.3 Mẫu lấy siêu thị Big C Error: Reference source not found Bảng 3.4 Mẫu chợ: Error: Reference source not found Bảng 3.5 Mẫu lấy trực tiếp phòng thí nghiệm Error: Reference source not found Bảng 3.6 Mẫu lấy siêu thị Big C: Error: Reference source not found 47 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dáng Campylobacter quan sát kính hiển vi điện tử truyền suốt (A) sau nhuộm Gram (B) Error: Reference source not found Hình 1.2 Các nguồn chứa đường lan truyền Campylobacter quan trọng .14 Hình 3.3: Khuẩn lạc có mẫu lấy siêu thị BigC Error: Reference source not found Hình 3.4: Khuẩn lạc môi trường thạch máu Error: Reference source not found Hình 3.5: Khuẩn lạc môi trường thạch máu mẫu phòng thí nghiệm Error: Reference source not found Hình 3.6: Khuẩn lạc môi trường thạch máu mẫu thu siêu thị BigC Error: Reference source not found Hình 3.7: Thử nghiệm oxidase sau 10 giây Error: Reference source not found Hình 3.8:Khuẩn lạc phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí Error: Reference source not found Hình 3.9: Khuẩn lạc phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí Error: Reference source not found Hình 3.10: Khuẩn lạc phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí Error: Reference source not found Hình 3.11: Khuẩn lạc phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí Error: Reference source not found Hình 3.12: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa chân toàn thân gà phát triển 41,5º môi trường hiếu khí Error: Reference source not found Hình 3.13: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa chân toàn thân gà phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí .Error: Reference source not found Hình 3.14: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa cánh đùi thứ 1, phát triển 41,5ºC môi trường hiếu khí .37 Hình 3.15: Khuẩn lạc lấy mẫu rửa cánh đùi thứ 1, phát triển 25ºC môi trường vi hiếu khí 37 [...]... lạc thứ 1 và 4 cho kết quả dương tính Các khuẩn lạc còn lại cho kết quả âm tính Như vậy, đã có sự xuất hiện của vi khuẩn Campylobacter spp trên mẫu A với khuẩn lạc thứ 2 và 5 và mẫu B với khuẩn lạc thứ 1 và 4 35 Bảng 3.6 Mẫu lấy ở siêu thị Big C: Tên mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu A A A A A B B B B B C C C C C D D D D... mẫu A với khuẩn lạc thứ 2, thứ 5 và mẫu B với khuẩn lạc thứ 1, thứ 4 Bảng 3.3 Mẫu lấy ở siêu thị Big C Tên mẫu Mẫu A – 1 Mẫu A – 2 Mẫu A – 3 Mẫu A – 4 Mẫu A – 5 Mẫu B – 1 Mẫu B – 2 Mẫu B – 3 Mẫu B – 4 Mẫu B – 5 Mẫu C – 1 Mẫu C – 2 Mẫu C – 3 Mẫu C – 4 Mẫu C – 5 Mẫu D – 1 Mẫu D – 2 Mẫu D – 3 Mẫu D – 4 Mẫu D – 5 Mẫu D – 6 Mẫu E – 1 Mẫu E – 2 Mẫu E – 3 Mẫu E – 4 Mẫu E – 5 Mẫu E – 6 Kết quả khẳng định oxidase... Campylobacter spp - Vật liệu: + Các mẫu thịt gà được thu thập tại các chợ trên địa bàn Hải Phòng: 17 • Mẫu thịt gà lấy ở chợ Lạc Vi n, quận Ngô Quyền, Hải Phòng: tại đây mẫu chủ yếu lấy trên phần đùi, vào lúc sáng sớm • Mẫu thịt gà lấy ở chợ Ngô Quyền, quận Ngô Quyền, Hải Phòng: tại đây mẫu chủ yếu lấy trên phần lườn gà, và cũng vào lúc sáng sớm + Trong phòng thí nghiệm: tại đây các mẫu được lấy trực tiếp trong. .. thích: Mẫu A: mẫu rửa trên cánh gà Mẫu B : mẫu rửa trên chân gà Mẫu C: mẫu rửa trên toàn thân gà Mẫu D và E: mẫu rửa trên đùi gà 1-6: vị trí lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch Đối với mẫu rửa thân thịt tại BigC ta nhận được kết quả như sau: khuẩn lạc 1 và 5 của mẫu A, khuẩn lạc 1 và 2 của mẫu B, khuẩn lạc 1 và 2 của mẫu C, khuẩn lạc 2 của mẫu D và khuẩn lạc 6 của mẫu E là cho kết quả dương tính Các khuẩn. .. Hình 3.3: Khuẩn lạc có trong mẫu lấy tại siêu thị BigC (A) toàn thân gà, (B) chân gà, (C) cánh gà, (D) đùi gà số 1, (E) đùi gà số 2 Trên các mẫu lấy tại chợ, phòng thí nghiệm và tại siêu thị Big C, trên các đĩa thạch đều xuất hiện các khuẩn lạc nghi ngờ được cho là vi khuẩn Campylobacter Khuẩn lạc giả định là Campylobacter spp có đặc điểm mờ hoặc nhầy, sáng lấp lánh, dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu... Chuẩn pH: 7,4 ± 0,2 ở 25ºC Bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa sử dụng  Tiến hành thu mẫu: Mẫu được tiến hành thu theo TCVN 6507-2:2005 Phần 2: các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thịt và mẫu sản phẩm thịt Tiến hành thu thập mẫu thịt gà ngẫu nhiên tại một số chợ ở Hải Phòng, tại siêu thị BigC và các mẫu sẵn có tại phòng thí nghiệm Lấy mẫu tại các vị trí khác nhau trên gà: thân, cánh, đùi,... catalase Có bọt khí Không có bọt khí Mẫu A – 1 (-) Mẫu A – 2 (+) Mẫu A – 3 (-) Mẫu A – 4 (-) Mẫu A – 5 (+) Mẫu B – 1 (+) Mẫu B – 2 (-) Mẫu B – 3 (-) Mẫu B – 4 (+) Chú thích: Mẫu A: mẫu lấy ở chợ Đôn, quận Lê Chân Mẫu B: mẫu lấy ở chợ Đầm Triều, quận Kiến An 1-5: vị trí khuẩn lạc lấy trên đĩa thạch Còn đối với mẫu lấy ở phòng thí nghiệm, kết quả cho thấy: mẫu A với khuẩn lạc thứ 2 và 5 và mẫu B với khuẩn. .. trong mẫu khá cao Thực hiện thao tác cấy ria, đường cấy càng dày càng thể hiện rõ khuẩn lạc rời Nuôi trong điều kiện vi hiếu khí, với thời gian nuôi 44 ± 4h ta có kết quả thu được thể hiện ở các đĩa nuôi cấy chọn lọc A B Hình 3.1: Khuẩn lạc có trong mẫu lấy tại chợ (A) trên da gà, (B) da và thịt của gà 25 B A Hình 3.2: Khuẩn lạc có trong mẫu tại phòng thí nghiệm (A) thịt ở lườn gà, (B) da ở đùi gà A... trên mẫu A tại khuẩn lạc thứ 1 và trên mẫu B tại khuẩn lạc thứ 3 cho kết quả dương tính Các khuẩn lạc còn lại đều cho kết quả âm tính Như vậy, đã thấy có sự xuất hiện của khuẩn lạc Campylobacter spp trên mẫu A thứ 1 và mẫu B thứ 3 Bảng 3.2 Mẫu lấy trực tiếp trong phòng thí nghiệm Tên mẫu Mẫu A – 1 Mẫu A – 2 Mẫu A – 3 Mẫu A – 4 Mẫu A – 5 Mẫu B – 1 Mẫu B – 2 Mẫu B – 3 Mẫu B – 4 Kết quả khẳng định oxidase... thích: Mẫu A: mẫu lấy ở chợ Đôn, quận Lê Chân Mẫu B: mẫu lấy ở chợ Đầm Triều, quận Kiến An 1-5: vị trí khuẩn lạc lấy trên đĩa thạch 31 Còn đối với mẫu lấy ở phòng thí nghiệm, kết quả cho thấy: mẫu A với khuẩn lạc thứ 2, thứ 5 và mẫu B với khuẩn lạc thứ 1, thứ 4 cho kết quả dương tính Các khuẩn lạc còn lại cho kết quả âm tính Như vậy, đã có sự xuất hiện của vi khuẩn Campylobacter spp trên mẫu A với khuẩn