Đang tải... (xem toàn văn)
Huyết nhung trơn là loài sống phụ. Cây thuộc nhóm đơn thân không có giả hành, mọc thẳng đứng dài 50 – 60 cm, thân cây to 5,0 mm với nhiều rễ dài và thòng làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, quang hợp. Lá có hình thuôn và phân thùy, dài 5 11 cm, rộng 1,5 cm, hẹp, màu lục đậm, đầu có 2 thùy không bằng nhau. Phát hoa nằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa mọc song song với lá và thẳng gốc với rễ. Hoa to 4 cm, không thơm, có màu đỏ đậm, cánh hoa cạnh cao bằng nửa lá đài ở giữa, vàng cam, có đốm đỏ, lá đài cạnh to nhất. Hoa thường nở vào mùa nắng, nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3 5, 6. Có 12 chủng rải rác từ miền Trung Quốc xuống đến Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, Philippinesis. Phân nửa chúng được thuần dưỡng phổ biến như Ren.coccinea, Ren.monichica, Ren.imschootiana, Ren.Philippinnesis và Ren.clongata 7.
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Nguyễn Thị Hoài Phương DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid AC : Active carbon (than hoạt tính) BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) CW : Coconut water (nước dừa) IBA : Indole - butyric acid I&Y : Ichihashi & Yamashita KC : Knudson C (1965) KIN : Kinetin ĐHST : Điều hòa sinh trưởng M : Mitra et al MKC : Modified Knudson ‘C’ MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid PM : Phytamax RE : Robert Ernst (1979) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) THT : Than hoạt tính IUCN : International Union for Conservation of Nature MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tên bảng Ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả nhân nhanh 3.2 protocorm sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân chồi in vitro lan 3.3 sau 12 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả kéo dài chồi in vitro sau 12 3.4 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi 3.5 cấy Đánh giá khả sống sót đưa trồng vườn ươm sau tuần Trang 21 25 27 29 31 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Tên hình Cây lan Huyết nhung trơn tự nhiên 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 2.3 Sơ đồ mô tả bước thí nghiệm 3.1 Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân nhanh protocorm 3.2 sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến 3.3 khả nhân nhanh protocorm sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân chồi in vitro sau 3.4 12 tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả kéo dài chồi in vitro sau Trang 18 18 18 22 24 26 28 12 tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi 3.6 cấy Cây vườn ươm trồng giá thể tốt MỞ ĐẦU 30 31 Đặt vấn đề Cùng với phát triển nhanh chóng xã hội, nhu cầu hoa giới nói chung Việt Nam nói riêng ngày gia tăng Chính hoa tươi trở thành loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao chiếm vị trí đặc biệt thị trường [31] Trong đó, hoa lan loài hoa nhiều người ưa chuộng lẽ mang vẻ đẹp sang trọng, khiết, đa dạng màu sắc, hình dáng hương thơm quyến rũ [7] Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) loài phong lan đẹp quý [68, 77, 79] Hoa thường nở vào mùa hạ, có màu đỏ tiếng với đặc điểm trang trí độc đáo Ở Việt Nam, Huyết nhung trơn phân bố chủ yếu số tỉnh Tây Nguyên Nam Trung Bộ Kontum, Lâm Đồng, Khánh Hòa Tuy nhiên, số lượng nhiều loài lan tự nhiên, có loài Huyết nhung trơn có xu hướng giảm ảnh hưởng bất lợi điều kiện môi trường nạn khai thác bừa bãi Bên cạnh đó, tự nhiên lan thường nhân giống chủ yếu hình thức sinh sản vô tính (nhân chồi) hạt với hệ số nhân khả mầm thấp [57] Điều góp phần làm cho nhiều loài lan đứng trước nguy tuyệt chủng Nhân giống in vitro kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xem phương pháp hữu hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều loài lan quý [4, 68, 78] Đã có nhiều tác giả nước nhân giống loài lan quý phương pháp nhân giống in vitro (Nguyễn Văn Song cs, (2011); Nguyễn Thị Sơn cs, (2012); Vũ Ngọc Lan cs, (2013); Luan cs, (2006)) [18, 10, 19, 55] Năm 2014, tác giả Phạm Thị Thu cs lần tiến hành nghiên cứu nảy mầm in vitro nhân nhanh protocorm loài lan Huyết nhung trơn với hệ số nhân protocorm tương đối cao [27] Tuy nhiên, nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nhân giống loài lan chưa đề cập đến Chính vậy, việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan Huyết nhung trơn cần thiết, từ vừa bảo tồn loài lan không bị tuyệt chủng, vừa cung cấp số lượng lớn lan cho thị trường tiêu thụ cảnh Xuất phát từ sở trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan quý Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe)” Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống lan Huyết nhung trơn với hệ số nhân giống cao, chất lượng giống tốt 2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định môi trường nuôi cấy dinh dưỡng phù hợp cho giai đoạn: + Nhân nhanh protocorm + Tái tạo chồi từ protocorm + Kéo dài chồi in vitro + Tạo rễ in vitro hình thành hoàn chỉnh - Xác định giá thể để thích hợp Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học nhân giống vô tính lan Huyết nhung trơn phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú sở liệu kĩ thuật nuôi cấy hoa lan 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài giúp đề xuất quy trình nhân giống lan Huyết nhung trơn kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, góp phần sản xuất giống có hiệu cao, chất lượng tốt, khắc phục hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống Ứng dụng vào sản xuất góp phần phục tráng giống, góp phần bảo tồn nâng cao hiệu kinh tế ngành sản xuất hoa lan Huyết nhung trơn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược hoa phong lan Họ phong lan đánh giá loài hoa cao cấp vương quốc thảo mộc, bao gồm 750 chi 25.000 loài khác [8] Lan loại thân thảo, thân leo sống lâu năm Những loài sống chủ yếu môi trường đất, có thân dạng củ, rễ chùm gọi địa lan, sống vách đá gọi thạch lan, sống thân tách khỏi mặt đất gọi phong lan với loài khám phá mô tả theo năm Họ phong lan có phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo Bắc Cực, từ đồng vùng núi băng tuyết nên loài có khác biệt [29] Các loài lan xếp thành hai nhóm: [25] - Nhóm đa thân (polypodial) bao gồm chi Dendrobium, Cymbidium, Cattleya… Cây đa thân gồm nhiều giả hành Mỗi giả hành có số bao che mang rễ đáy Đáy to tạo thành bẹ bao quanh giả hành, nách bẹ có chồi mà chồi phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay tạo quan dinh dưỡng (giả hành mới) - Nhóm đơn thân (monopodial) bao gồm chi như: Monkara, Vanda, Aerides,… Thân mọc cao phía đỉnh.Sự mọc dài đỉnh không giới hạn nên có thân phát triển vô hạn theo chiều thẳng đứng Sự phát triển ngừng đỉnh bị tổn thương, lúc chồi bên xé rách bẹ để mọc dài thành nhánh Các nhánh phát triển vô hạn định phía đỉnh Có thân lan cao với lóng dài, mọc xa (Vanda), có khít hơn, thân ngắn lại (lan Đai châu, Hồ điệp) Việt Nam với vị trí địa lý, địa hình đặc trưng kiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hoa lan phong phú đa dạng Mặc khác, tiếp nhận ba luồng thực vật di cư vào từ ba hướng: từ phía Nam lên, từ Tây Bắc xuống, từ Tây Tây Nam làm cho hoa lan Việt Nam phong phú, đa dạng thêm nhiều xem nơi tập trung nhiều lan đẹp giới 1.2 Tình hình sản xuất hoa lan giới Việt Nam 1.2.1 Trên giới Hiện nhu cầu hoa lan thị trường giới lớn, ngày tăng Các nước có truyền thống sản xuất hoa lan Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan , hàng năm thu hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất hoa lan Hoa lan mặt hàng xuất quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao cho nhiều quốc gia, đặc biệt số nước Châu Á Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô ngày lớn phục vụ cho xuất Có thể nói Thái Lan nước điển hình cho ngành nuôi trồng xuất hoa lan nước châu Á với sản phẩm chủ lực lan Dendrobium, cho doanh thu năm từ xuất gần 600 triệu USD [26] Trong thập niên cuối kỉ 20, châu Âu, lan trở thành mặt hàng thương mại, từ Anh sang Pháp… sau lan sang Mỹ Nước có tốc độ phát triển lan nhanh Trung Quốc Vào đầu thập kỷ 80, Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan Hồ Điệp Năm 2002, sản lượng lan Hồ điệp Trung Quốc triệu cây, bao gồm 50 - 60 xí nghiệp có quy mô lớn, Quảng Đông có 10 công ty sản xuất 1,2 triệu (chiếm 40% sản lượng lan Hồ điệp Trung Quốc) Hiện nước châu Âu, hoa lan trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa đầy 500 lan Hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan thu 35 triệu USD từ xuất sản phẩm hoa [15] Ngày nay, thị trường xuất hoa lan giới ngày mở rộng Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành giới năm 2000 đạt 150 triệu, Nhật Bản nước nhập hoa lan cắt cành số giới, thứ hai Ý, Pháp…[18] 1.2.2 Trong nước Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung lan nói riêng vòng 10 năm trở lại phát triển, với nhiều chủng loại Tham gia sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh 100% vốn đầu tư nước ngoài) Tuy nhiên sản xuất chưa áp dụng khoa học kỹ thuật nên ngành trồng hoa lan nói riêng chưa thực phát triển, sản xuất lan Việt Nam phát triển mạnh mẽ tỉnh phía Nam, đặc biệt thành phố Đà Lạt thành phố Hồ Chí Minh [3] 1.3 Tình hình nghiên cứu hoa lan giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống đại phương pháp nuôi cấy mô hỗ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theo kiểu tách chiết, nên nhân số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường Ban đầu Morel khám phá phương pháp nuôi cấy mô thành công loài lan đa thân Năm 1970, N.Vajrabhaya T.Vajrabhaya cấy mô thành công loài lan đơn thân Năm 1974, nhà khoa học cấy mô thành công hầu hết loại lan thuộc nhóm đơn thân khác nhờ có phương pháp nuôi cấy mô tế bào, lan chọn lọc từ phương pháp lai hữu tính nhân nhanh đáp ứng nhu cầu sản xuất, kinh doanh Để đạt thành công nuôi cấy mô, môi trường có vai trò quan trọng trình nuôi cấy, cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sinh trưởng phát triển mô Và nghiên cứu cho thấy, môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi môi trường MS (Marushige - Shoog, 1962), VW (Vacine – went, 1949), KC (Knudsonc)…[14] Trên giới có nhiều nghiên cứu lan phương pháp nhân giống in vitro, kết công trình nghiên cứu góp phần lớn vào việc bảo tồn nhân nhanh nhiều loài lan quý Vào năm 2000, Sheelavantmath cs (2000) thành công việc nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr - loài lan quý Những năm tiếp theo, H.N.Murthy cs (2005) nhân giống in vitro loài lan Aerides crispum – loài lan quý Ấn Độ Năm 2010, Basker cs nghiên cứu nhân giống loài lan Epiphytic [37] Cũng năm đó, Chyuam Yih Ng cs nhân giống loài lan có nguy tuyệt chủng Paphiopedilum rothschildianum núi Kinabalu, Sabah Malaysia [41] Sana Asghar cs (2011) nghiên cứu nhân giống phong lan Dendrobilum Nobile var Emma trắng [34] Trong tạp chí Ấn Độ nói nghiên cứu Sharma U., Rama Rao V., Mohan JSS Reddy AS., nhân giống in vitro phong lan quý Dendrobilum microbuibon A.Rich có tác dụng làm thuốc chữa đau bụng, dày [70] 1.3.2 Ở Việt Nam 1.3.2.1 Nghiên cứu thu nhập, chọn tạo đánh giá nguồn gen Hình 3.4 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả kéo dài chồi lan Huyết nhung trơn Các chồi môi trường P (A) P bổ sung 1,0 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA (B), 1,0 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA (C), 1,0 mg/L BA + 0,75 mg/L NAA (D), 1,0 mg/L BA + 1,0 mg/L NAA (E), 2,0 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA (F), 2,0 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA (G), 2,0 mg/L BA + 0,75 mg/L NAA (H), 2,0 mg/L BA + 1,0 mg/L NAA (I) sau 12 tuần nuôi cấy Thanh tỉ lệ: 1,0 cm Theo tác giả Khatun cs (2010), tiến hành nhân giống in vitro lan Dendrobium hybrid cho thấy, môi trường có kết hợp BA NAA sinh trưởng phát triển tốt hơn, đặc biệt môi trường 1,0 mg/L BA 1,0 mg/L NAA phát triển tốt [53] Năm 2014, Sopa Choopeng cs tiến hành nghiên cứu sinh trưởng phát triển chồi đối tượng lan Hygrochilus parishii, kết cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L BA 0,5 mg/L NAA thích hợp cho kéo dài chồi in vitro [40] Tuy nhiên, nghiên cứu chúng tôi, môi trường MS có 2,0 mg/L BA 0,25 mg/L NAA môi trường thích hợp để kéo dài chồi lan Huyết nhung trơn 3.4 Đánh giá ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro Theo Nguyễn Quang Thạch cs (2012), auxin có ảnh hưởng tích cực đến hình thành rễ chồi lan [24] Ngoài ra, nhiều tác giả cho thấy NAA riêng lẻ kích thích tạo rễ tốt số loài lan như: Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium strongylanthum Rchb.f [18, 51] Trong nghiên cứu này, bổ sung NAA nồng độ từ 0,25 – 1,0 mg/L môi trường nuôi cấy để đánh giá khả cảm ứng tạo rễ từ chồi in vitro lan Huyết nhung trơn Kết thu bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro lan Huyết nhung trơn sau tuần nuôi cấy NAA (mg/L) 0,25 0,5 0,75 1,0 Thời gian xuất rễ (ngày) 41 46 35 31 25 Khả hình thành rễ Tỉ lệ chồi Số Chiều dài rễ (%) rễ/chồi rễ (cm) c 60,00 1,26 1,30b 53,33 0,86d 0,63d bc 66,67 1,34 0,76c 80,00 1,51b 1,35b 93,30 2,40a 1,74a Đặc điểm rễ Rễ dài, nhỏ Rễ ngắn, mập Rễ to, ngắn Rễ dài, mập Rễ dài, to, khỏe Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p[...]... Nguyễn Thị Pha và cs năm 2011, tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồ điệp từ mầm ngủ phát hoa không qua giai đoạn tạo mô sẹo [16] Nguyễn Quang Thạch và cs (2005) đã thiết lập quy trình nhân giống in vitro lan Hồ điệp Phalaenopsis [23] 1.4 Một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu nhân giống in vitro 1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro hoa lan 1.4.1.1 Môi trường nuôi cấy Thành phần... có thể sử dụng Cytokinin kết hợp với Auxin theo một tỉ lệ nào đó để thu được các sản phẩm như mong muốn [22] 1.4.2 Các con đường nhân giống in vitro các loài lan 1.4.2.1 Nhân giống từ hạt Hiện nay, một số loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên đã được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [50] Với công nghệ nhân giống in vitro hiện nay hệ số nhân giống từ một trái lan là một số rất lớn,... (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy cơ bị tuyệt chủng [18] Hoàng Thị Giang và cs (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài quý Paphiopedilum hangianum perner Gurss (Hài hằng) thu nhập ở Việt Nam [2] Vào năm tiếp theo (2012), Nguyễn Thị Sơn và cs đã nhân giống in vitro loài lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook.) là loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh... Việc nghiên cứu áp dụng công nghệ này đã mở ra một bước mới về cải tiến giống cây trồng và nhân giống vô tính Nó còn là phương tiện cho các nhà chọn giống rút ngắn giai đoạn chọn lọc Hiện nay, việc nhân giống bằng phương pháp này đang tiếp tục mở rộng và nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Song (2011), đã nghiên cứu nhân giống bằng kĩ thuật in vitro ở loài lan Kim... như Kon Ka Kinh, Lâm Đồng, Đồng Nai [54] 1.5.3 Thực trạng Huyết nhung trơn là loài lan quý hiếm đang bị đe dọa và nằm trong sách đỏ IUCN, cũng như trong Sách đỏ thực vật của Ấn Độ, Huyết nhung trơn nổi tiếng với những đặc điểm trang trí độc đáo của nó [66] Chính vì vậy, phương thức nảy mầm hạt lan in vitro cũng là một phần quan trọng của chương trình bảo tồn và nhân giống các loài lan hiếm, cung cấp... chương trình phục hồi rừng tái sinh [58] 1.5.4 Một số nghiên cứu liên quan Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) là một loài lan quý hiếm đang bị đe dọa do khai thác quá mức và mất môi trường sống phù hợp Vì vây, việc bảo tồn và nhân giống thông qua phương pháp nuôi cấy mô là rất cần thiết Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về loài lan này Theo Seeni S và cs (1922), nghiên cứu. .. giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống phong lan Hồ điệp nhập từ Hà Lan đã đi đến kết luận: Các giống lan Hồ điệp nhập nội đều có khả năng sinh trưởng, phát triển và cho ra tỉ lệ hoa tốt hơn các giống có nguồn gốc từ hạt [11] 1.3.2.2 Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lan Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kĩ thuật nhân giống được áp... bổ sung 2,0 mg/L KIN là môi trường thích hợp nhất để tạo thành thể protocorm của hạt sau khi nảy mầm Môi trường MS cơ bản có 2,0 mg/L KIN kết hợp 0,75 mg/L NAA là môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh protocorm của lan Huyết nhung trơn [27] CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là loài lan Huyết nhung trơn hay còn gọi là lan Phượng vĩ, có... kết hợp NAA Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ KIN, NAA đến khả năng nhân chồi in vitro của lan Huyết nhung trơn Các chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường P (A) và P có bổ sung 0,5 mg/L KIN (B), 1,0 mg/L KIN (C), 1,5 mg/L KIN (D), 2,0 mg/L KIN (E), 0,5 mg/L KIN + 0,3 mg/L NAA (F), 1,0 mg/L KIN + 0,3 mg/L NAA (G), 1,5 mg/L KIN + 0,3 mg/L NAA (H), 2,0 mg/L KIN + 0,3 mg/L NAA (I) sau 12 tuần nuôi cấy... 150 g/L BH, và 1,0 g/L AC là thích hợp cho sự phát triển in vitro của cây con, cây con cao khoảng 2,0 cm Khi đưa cây huấn luyện ngoài nhà kính thì 95% cây con sống sót sau 60 ngày [78] Tại Việt Nam, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thu và cs (2014) cũng tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Huyết nhung trơn Nguyên liệu sử dụng là hạt lan có đường kính 2,0 cm, dài khoảng 8,0 cm Khử trùng bằng