TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ GVBM : NGUYỄN THỊ MỸ LỆ SVTH: NHÓM 12 PHÉP LAI PHÂN TỬ NỘI DUNG CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ KẾT LUẬN ĐẶC ĐIỂM *Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt nhiệt độ ĐỊNH  NGHĨA + Đặc hiệu tuyệt bắt cặp xảy nóng chảyđối: haitái mạch tách rời hai trình tự hoàn toàn bổ sung với phá vỡ liên kết H mạch + Các trình bổ 2sung cótách thể *Sautựkhi mạch rờiDNA nhau,hay RNA, dẫn đến hình thành phân tử nhiệt độ phản ứng đươc làm giảm DNA-DNA, RNA-RNA hay DNA-RNA xuống từ từ với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Và tượng gọi lai phân tử CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Ở nhiệt độ nhất định, số lượng các trình tự bổ sung càng n hiều thì  xác suất bắt cặp càng tăng Thời gian phản ứng càng dài, xác suất bắt cặp càng lớn, đồ ng thời  số lượng phân tử lai tăng dần Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm khoảng 25 % Độ dài trình tự: Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với bình phương độ dài trình tự bổ sung Lực ion  Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng tăng lên từ 5 đ ến 10  lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M hoàn toàn không có tác d ụng CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ LAI TRONG PHA RẮN LAI TẠI CHỖ LAI TRONG PHA LỎNG  Nguyên tắc:  Các  trình  tự  bô ̉ sung  (các  mach  ̣ đơn)  nằm  trong môi trường long la ̉ ̀ môt dung dich đêm. Lai phân t ̣ ̣ ̣ ử  Lai pha lỏng chi ̉ xay  ̉ ra  khi  các  trình  tự  này  găp  ̣ nhau  do  chuyên  ̉ đông  ̣ nhiêt  ̣ và  khi  nhiêt  ̣ đô ̣ môi  trường  thấp hơn nhiệt độ nóng chảy) ít nhất vài đô.̣ Phân ti ̣ ương  ượng cá c phân t Ph Ph ương  ́ ch đinh l Phương ử lai: pháp  pháp  pháp sắc kí  dùng  dùng  trên  Nuclease  quang  hydroxylapati S1 phô kế ̉ te  Phương phá p  dù ng quang phô ̉ kế Phương phá p  dù ng Nuclease S1 Phương phá p sắ c  kí  trên  hydroxylapatite DNA mach đôi hâ ̣ ́p  thu ánh sáng yếu  hơn DNA mach đ ̣ ơn.  Nên sự chuyên t ̉ ừ  DNA mach đôi sang  ̣ dang mach đ ̣ ̣ ơn được  xác đinh thông qua  ̣ giá tri cua mât đô  ̣ ̉ ̣ ̣ quang (OD) ở bước  sóng 260nm. Do đó,  trong phan  ̉ ứng lai,  sự tăng OD 260nm  tương ứng với sự  tăng số lượng các  Dung dich phan  ̣ ̉ ứng  lai được trích ra môt  ̣ phần, đem xử lý với  Nuclease S1. Các  mach đ ̣ ơn đều sẽ bi ̣ thuy giai, s ̉ ̉ ản phẩm  của phản ứng là  oligonucleotides hoặc  nhóm nucleotide 5'  phosphoryl Kĩ thuât na ̣ ̀y sử  dung  ̣ đê lai v ̉ ới DNA, RNA  hoăc v ̣ ới các protein  ở trong các tế bào  mà không cần tách  chiết Ở nồng đô muô ̣ ́i cao,  chi nh ̉ ững nucleic  mach đôi m ̣ ới gắn  vào giá thê,phâ ̉ ̀n  nucleic không gắn  vào giá thê se ̉ ̃ được  thu nhân.   ̣ Tính ti lê % ca ̉ ̣ ́c trình tự giống  nhau ở hai loài gần nhau +DNA có nguồn gốc từ hai loài gần  nhau, có thê lai đ ̉ ược với nhau. Đê ̉ tránh sự tái bắt căp gi ̣ ữa 2 mach  ̣ cua cu ̉ ̀ng môt phân t ̣ ử ban đầu, DNA  cua 2 loa ̉ ̀i phai co ̉ ́ nồng đô râ ̣ ́t khác  +Ty lê % ca ̉ ̣ ́c phân tử lai có thê đ ̉ ược  xem như tương ứng với ty lê % ca ̉ ̣ ́c  trình tự giống nhau giữa 2 loài đó.  Ty lê ca ̉ ̣ ̀ng cao thì 2 loài càng gần  nhau trong cây tiến hoá  Phân tích các trình tự lăp lai ̣ ̣ +Trong 1 dung dich DNA, môt tri ̣ ̣ ̀nh  tự lăp lai nhiê ̣ ̣ ̀u lần sẽ có nhiều cơ  may găp mach bô sung h ̣ ̣ ̉ ơn so với môt  ̣ trình tự duy nhất  So sánh kích thước các bô gen  ̣ ỨNG DỤNG  Nguyên tắc: ** Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai  trên pha   lỏng. Điểm khác biệt ở đây là môt  ̣ trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự  đích, trình tự cần tìm) được cố định trên môt giá  ̣ LAI TRÊN PHA RẮN thể rắn.   Northern blot Phương pháp: Souther n blot LAI  TRÊN  PHA  RẮN Dot (SLot)  blot Western  blot Southe rn blot MỤC ĐÍCH: Phương pháp dùng để định vị trình tự đặc biệt DNA gen, hay DNA kích thước nhỏ ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA PHƯƠNG PHÁP Southern blot Northern blot Western blot Trích DNA từ tế bào Trích RNA từ tế bào Trích protein từ tế bào Cắt với enzyme giới hạn Làm biến tính với formaldehyde Làm biến tính SDS Chạy gel (dùng agarose) Chạy gel (dùng agarose) Chạy gel (dùng polyacrylamide) Chuyển lên màng nitrocellulose( hoạt động mao dẫn) Chuyển lên màng nitrocellulose( hoạt động mao dẫn) Chuyển lên màng nitrocellulose( thường di chạy điện di) Tắc nghẽn với DNA dư Tắc nghẽn với RNA dư Tắc nghẽn với protein dư Lai với mẫu dò DNA đánh dấu Lai với mẫu dò DNA đánh dấu Lai với mẫu dò kháng thể đánh dấu Làm biến tính DNA Southern blot Rửa khỏi mẫu dò chưa liên kết ( kiểm soát nghiêm ngặt) Northern blot Rửa khỏi mẫu dò chưa liên kết ( kiểm soát nghiêm ngặt) Western blot Rửa khỏi mẫu dò chưa liên kết Ứng dụng: + Bản đồ giới hạn gen X chromosome + Phát fragment polymorphysm gen cá thể khác + Phát đột biến đoạn, điểm hay tái tổ hợp gen Ứng dụng: +Kĩ thuât na ̣ ̀y dùng  đê hiên thi s ̉ ̉ ̣ ự xuất  hiên qua ̣ ́ mức các gen  gây ung thư và giam  ̉ các gen ức chế quá  trình ung thư khi so  sánh với mô bình  thường Ứng dụng: +Các thử nghiệm  khẳng định HIV sử  dung ph ̣ ương pháp  Western blot để phát  hiện kháng thể chống  HIV trong một mẫu  huyết thanh của con  người.  +Western blot cũng có  thể được sử dụng như  một thử nghiệm xác  minh về nhiễm viêm  gan B +Một Western blot  cũng được sử dụng như  Lai chỗ một kiểu lai phân tử trình tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm tế bào hay mô Lai chỗ ***Nguyên tắc Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng khỏi mô hay tế bào  CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Lai NST Lai khuẩn lạc Lai tế bào và mô Các NST giai đoạn trung kì xử lí kỹ thuật tế bào học lame NST cố định lame đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Để phát phân tử lai, người ta phủ lên lame một huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame quan sát kính hiển vi, kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai LAI TRÊN  NST LAI TRÊN KHUẨN LẠC  Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng lai  Màng lai xử lí NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính DNA  Cố định DNA màng tiến hành phương pháp lai phương pháp lai pha rắn khác  Kết phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm hộp petri ban đầu Dòng thu nhận phân tích MỤC ĐÍCH: Trong tế bào mô, RNA, đặc biệt mRNA có phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian liên quan đến chức điều hòa tương tác mRNA với thành phần khác tế bào mô Để nghiên cứu mRNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể, người ta dùng phương pháp lai tế bào mô LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MÔ Mô xử lí phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành lát mỏng từ đến 10 micromet trải lame) Kết đọc trực tiếp lame nhờ kính hiển vi Phạm vi ứng dụng  Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác  Phương pháp cho phép phát protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trưng Khi phối hợp phương pháp miễn dịch tế bào lai chỗ, người ta phát đồng thời mRNA protein nó, từ xác định mối tương quan hoạt động phiên mã dịch mã gen  Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta xác định vị trí, phân bố tương tác mRNA tham gia vào trình sống ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ 1) Chăn nuôi Trong ngành thuỷ sản, phương pháp lai chỗ thường dùng để chẩn đoán bệnh virut đốm trắng tôm - Virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, có tên khoa học Systemic Ectodermal and Mesodorma Baculoviras (SEMBV) - Là virus xếp vào nhóm gây chết cấp tính tôm nuôi 2) Trong thực phẩm: Dùng để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen     Thực phẩm biến đổi gen (GMF - Genetically Modified Foods) thực phẩm mà thân chúng tạo từ thể sinh vật mang gen tái tổ hợp chuyển vào cách nhân tạo nhằm phục vụ số lợi ích kinh tế THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN Thực phẩm biến đổi gen ??? XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN  Sử dụng phương pháp Southern  Mục đích: xác định có mặt gen cần chuyển nhận, cho biết số lượng đưa vào  Mẫu dò đoạn gen chuyển có kích thước từ 100-300 bp đánh dấu phóng xạ XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN GEN Biểu gen có ý nghĩa quan trọng, mục đích chuyển gen Nếu gen đưa vào genome mà không biểu coi giá trị Quá trình biểu gen thể qua giai đoạn:  Phiên mã từ DNA sang mRNA  Dịch mã từ mRNA tổng hợp phân tử protein thông qua máy ribosome Và để xác định có mặt sản phẩm phiên mã thực phép lai Northern lai chỗ Còn muốn đánh giá có mặt protein gen chuyển tạo thực phép lai Western ELISA  LAI TẠI CHỖ Mục đích: xác định gen chuyển phận khác chuyển gen  Thực hiện:lai đoạn đơn đánh dấu bổ sung với trình tự mRNA đặc hiệu Chỗ mô cắt từ chuyển gen cố định cách làm lạnh nhanh, sau gắn vào màng lai lai với mẫu dò Kết quả: xuất mẫu gen chọn lọc mẫu mô, chứng tỏ gen chuyển biểu LAI WESTERN Mục đích: phát protein dựa phản ứng miễn dịch kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Quá trình hiển thị sản phẩm lai thực thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay phim thông qua phản ứng quang ECL  Công nghệ lai phân tử có nhiều ứng dụng quan trọng phổ biến rộng rãi ứng dụng dược phẩm, nông nghiệp, vật nuôi biến đổi di truyền Góp phần nâng cao chất lượng sống  Ngoài kỹ thuật góp phần không nhỏ vào lĩnh vực xét nghiệm y khoa, dùng để kiểm tra khiếm khuyết di truyền người Đây bước ngoặc cho ngành công nghệ vi sinh [...]... màng lai  Màng lai sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA  Cố định DNA trên màng và tiến hành các phương pháp lai như các phương pháp lai pha rắn khác  Kết quả phép này xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp petri ban đầu Dòng này sẽ được thu nhận và phân tích MỤC ĐÍCH: Trong tế bào và mô, các RNA, đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định Sự phân bố... minh về nhiễm viêm  gan B +Một Western blot  cũng được sử dụng như  Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô Lai tại chỗ ***Nguyên tắc Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng khỏi mô hay tế bào  CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Lai trên NST Lai trên khuẩn lạc Lai trên tế bào và mô Các NST ở giai đoạn trung... lame NST cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame một huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai LAI TRÊN  NST LAI TRÊN KHUẨN LẠC  Mỗi khuẩn lạc sẽ... vừa kể, người ta dùng phương pháp lai trên tế bào và mô LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MÔ Mô được xử lí bằng phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành những lát mỏng từ 7 đến 10 micromet trải trên lame) Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi Phạm vi ứng dụng  Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp bao gồm nhiều tập hợp các tế bào khác nhau  Phương pháp này cho phép phát... Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome Và để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể thực hiện phép lai Northern hoặc lai tại chỗ Còn muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện phép lai Western hoặc ELISA  LAI TẠI CHỖ Mục đích: xác định gen chuyển trong các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen  Thực hiện :lai giữa một đoạn đơn đánh... kháng thể đặc trưng của nó Khi phối hợp những phương pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó, từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen  Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham... Western  blot Là quá trình proteinprotein kết hợp đặc hiệu với nhau Thường sử dụng Antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn lưu huỳnh để phát hiện protein Mục đích: là phương pháp dùng để phát hiện protein ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA 3 PHƯƠNG PHÁP Southern blot Northern blot Western blot Trích DNA từ tế bào Trích RNA từ tế bào Trích protein từ tế bào Cắt với enzyme giới hạn Làm biến tính với formaldehyde Làm... cố định bằng cách làm lạnh nhanh, sau đó gắn vào màng lai và lai với mẫu dò Kết quả: xuất hiện mẫu gen chọn lọc trên mẫu mô, chứng tỏ gen chuyển đã được biểu hiện LAI WESTERN Mục đích: phát hiện protein dựa trên phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đó Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể được thực hiện thông qua phản ứng tạo màu... màng nitrocellulose( bằng hoạt động mao dẫn) Chuyển lên màng nitrocellulose( thường di chạy điện di) Tắc nghẽn với DNA dư Tắc nghẽn với RNA dư Tắc nghẽn với protein dư Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu Lai với mẫu dò kháng thể được đánh dấu Làm biến tính DNA Southern blot Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết ( dưới sự kiểm soát nghiêm ngặt) Northern blot Rửa sạch khỏi... nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ 1) Chăn nuôi Trong ngành thuỷ sản, phương pháp lai tại chỗ thường dùng để chẩn đoán bệnh của virut đốm trắng của tôm - Virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, có tên khoa học Systemic Ectodermal and Mesodorma Baculoviras (SEMBV)