CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH THỰC PHẨM I PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP - Dùng để xác định loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc - Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật -Không phân biệt tế bào sống chết -Không phân biệt tế bào vi sinh vật hạt vật thể -Hạn chế huyền phù có mật độ thấp Buồng đếm vi sinh vật Đếm trực tiếp buồng đếm Goriep Pha loãng mẫu cần đếm cho ô nhỏ buồng đếm có khoảng - 10 tế bào Cách đếm tế bào buồng đếm Qui trình xác định số lượng tế bào vsv trực tiếp buồng đềm hồng cầu Quy trình: - Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ) - Nạp mẫu vào buồng đếm - Đếm số lượng tế bào diện ô lớn Tính mật độ: Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml II PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC - Dùng để xác định loại vi sinh vật sống mẫu - Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật mật độ thấp - Có thể định lượng vi sinh vật kích thước nhỏ, di động ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN 1ml 1.1 10 -1 1.2 1.3 1.4 1.5 1ml 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 10-2 Tra Bảng 1ml 3.1 3.2 3.3 10-3 3.4 3.5 Số vsv: 70 MPN/ml IV PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Phương pháp MPN (loạt ống) Số lượng ống dương tính Bảng tra MPN (loạt ống) Số ml mẫu sử dụng 10 0,1 0 0 … 3 0 0 … 3 3 … Số MPN/100 ml 240 460 1100 Bảng tra MPN (loạt ống) Quy trình: - Pha loãng mẫu bậc 10,chọn nồng độ liên tiếp - Cấy vào loạt ống nghiệm (9 15 ống) chứa môi trường chọn lọc lượng mẫu xác định từ nồng độ chọn - Nuôi ủ, xác định số ống dương tính nhóm - Tra bảng Mac Crady→trị số MPN (a) Tính mật độ: V2 V1 Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x xd Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady V1: thể tích mẫu sử dụng (thường 1) V2: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady loạt ống (10ml) VI PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC - Độ đục huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có môi trường Trong thời gian định, mối quan hệ số lượng vi sinh vật nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục môi trường - Định lượng vi sinh vật môi trường máy đo độ đục hay máy so màu bước sóng 550610nm - Trong phương pháp cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính độ đục số lượng vi sinh vật môi trường phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC • Phương pháp tiến hành: - Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm cho dung dịch thu đo máy so màu bước sóng 610nm trị số OD gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 - Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định số lượng tế bào vi sinh vật có 1ml kí hiệu N/ml - Tính giá trị log(N/ml) cho nồng độ pha loãng, Vẽ đồ thị biểu diễn log(N/ml) theo giá trị OD Xác định khoảng tuyến tính log(N/ml) với OD • Tính mật độ - Từ trị số OD đo đối chiếu đồ thị tương quan mật độ tế bào OD để xác định số lượng tế bào VII PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzym linked immunosorbent asay) - ELISA (Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme) dựa nguyên tắc phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu - Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết qua ngưng tủa, kết dính kháng nguyên kháng thể kháng thể đánh dấu (phát huỳnh quang đồng vị Đĩa giếng ELISA HỆ THỐNG ELISA Máy rửa Máy đọc QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨM CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨM 1.Tổng vi sinh hiếu khí Tổng nấm men, nấm mốc Coliform tổng số E.coli Sallmonella Staphylococcus aureus Bacillus aureus … [...]... khí/g (TPC) N TPC = n1V1F1 + ….+ niViFi N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ III PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC - Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp - Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương pháp MPN - Kích thước lỗ lọc: 0,45 µm hoặc 0,2 µm - Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc Bộ lọc và màng lọc vô trùng Phương pháp màng lọc • Kích thước lỗ lọc... mặt Film Phương pháp cấy bề mặt Ưu điểm - Định lượng được các VSV nhạy nhiệt - Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng - Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu Nhược điểm - Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ - Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc Bút đếm khuẩn lạc Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động PHƯƠNG PHÁP ĐẾM... tích mẫu lớn (1ml) - Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía - Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn lạc Nhược điểm - Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt - Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định - Khó làm thuần một dòng VSV Phương pháp cấy bề mặt • Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt • Phương pháp - Cấy 0.1 – 0,3ml... đếm số lượng Cấy mẫu vào môi trường - Phương pháp cấy bề mặt - Phương pháp đổ đĩa Phương pháp đổ đĩa • Chuẩn bị đĩa petri vô trùng • Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt • Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp) • Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều • Để nguội môi trường (thạch đông đặc) • Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp Phương pháp. .. ) = ∑C (n1vd1 + + ni vd i ) Với : N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni : Số hộp petri cấy mẫu tại độ pha loãng thứ i di: nồng độ pha loãng thứ i v: Thể tích mẫu cấy vào trong mỗi đĩa ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH HIẾU KHÍ TRONG MẪU THỰC 10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây Dung... cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩm Các dung dịch pha loãng mẫu  Saline peptone water (SPW) NaCl Peptone Nước cất vừa đủ 8,5g 1,0g 1 lít • Buffered peptone water (BPW) NaCl Peptone Nước cất vừa đủ 5g 10g 1 lít Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập Đối vớiphân các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101 Các bước tiếp theo... phụ thực vào đường kính phễu lọc • Đường kính màng thường là 45mm Thiết bị lọc nhiều phễu Phương pháp lọc VSV • Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc • Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: