Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM  TIỂU LUẬN Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Nhóm thực hiện: Nhóm Buổi: Thứ 3, tiết 11+12, phòng B106 TP HCM, tháng năm 2016 Trang NHÓM Tp.HCM, Tháng 05/2014 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Mục lục Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP .14 ĐẾM KHUẨN LẠC 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI 1.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) Escherichia coli Theodore Escherich (1857-1911), nhà vi khuẩn học người Áo, phát lần năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột Trong các loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình có vai trò quan trọng y học E.coli thành viên hệ vi khuẩn bình thường ruột nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng, có bệnh nguyên đứng đầu Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli kính hiển vi với kích thước µm E.coli được sử dụng làm mô hình nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực vi sinh học nói riêng sinh học nói chung E.coli K12 vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhiều thành tựu di truyền học, hóa sinh học được thu sở nghiên cứu vi khuẩn Ngày E.coli được sử dụng nhiều công nghệ sinh học Mặc dù E.coli loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với nhiều phát tầm phân tử, đặc biệt chế bệnh sinh các type gây bệnh (pathotype) 1.2 Đặc điểm sinh học 1.2.1 Hình thái NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc E.coli trực khuẩn Gram (-) Kích thước trung bình từ đến 3µm x 0,5µm; điều kiện không thích hợp (ví dụ môi trường có kháng sinh) vi khuẩn dài sợi Rất chủng E.coli có vỏ, hầu hết có lông có khả di động NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1.2.2 Tính chất nuôi cấy E.coli phát triển dễ dàng các môi trường nuôi cấy thông thường Một số phát triển môi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý Có thể phát triển nhiệt độ từ 5-400C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển nhanh, thời gian thế hệ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau đến làm đục nhẹ môi trường, sau 24 làm đục đều; sau hai ngày mặt môi trường có váng mỏng Những ngày sau, đáy ống thấy lắng cặn E.coli không mọc canh thang Selenit Trên môi trường thạch thường, sau khoảng đến 10 giờ, dung kính lúp quan sát được khuẩn lạc Sau 24 khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, gặp dạng R, M Trên môi trường phân lập, tùy theo chất thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạch lactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) Không mọc được môi trường SS Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị sàng lọc nhanh, EAEC tạo thành váng đặc trường nuôi cấy canh thang Muller-Hinton 1.2.3 Tính chất hóa sinh E.coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Hầu hết E.coli lên men lactose sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong có EIEC) không lên men chậm Một số chi khác họ vi khuẩn đường ruột có khả lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia Citrobacter) được gộp vào nhóm vi khuẩn có tên chung coliform E.coli có khả sinh indole Không sinh H 2S Không sử dụng được nguồn carbon citrate môi trường Simmons Có decarboxylase, có khả khử carboxyl lysine, ornithin, arginin acid glutamic Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 âm tính, sau 48 dương tính NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bảng 1.2: Tính chất hóa sinh số loài thuộc chi Escherichia Các loài E.coli E.coli (bình (inactive thường) + + + ) T T + - E.blatta E.fergus E.herma e onii nnii s i + T + + + + + + + ? - - - - - - - - T T - - - T T + + - T + T - - - - T - T T + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + T + + T T T + T T + + + + + T T + + + T + + + + + vàng ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside + T - Thử nghiệm CNPG Indole Đỏ methyl VogesProskauer Citrate (Simmons) Lysine decarboxylase Arginine dihydrolase Ornithine decarboxylase Di động D-Glucose acid D-Glucose sinh Lactose Sucrose D-Mannitol Adonitol Cellobiose D-Sorbitol D-Arabitol L-Ramnose Sinh sắc tố E.vulneri E.alberti +: >90% dương tính -: < 10% dương tính T: 10-90% dương tính 1.3 Phân loại NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết Với tổ hợp các yếu tố kháng nguyên O, K H có nhiều type huyết khác Mỗi type huyết được ký hiệu bằng kháng nguyên O K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số loại B) Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả gây bệnh người được chia thành nhóm: thứ nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai nhóm gây bệnh đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli) - Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) được biết gồm: EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột - Hai loại E.coli gây bệnh đường ruột quan trọng là: MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu 1.4 Khả gây bệnh E.coli thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường đường tiêu hóa, chiếm tỷ lệ cao số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Tuy nhiên, E.coli vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu các nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E.coli nguyên thường gặp viêm màng não, viêm phổi trẻ sinh E.coli gặp nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng bỏng Theo NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc báo cáo chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988-1994) E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) tỷ lệ phân lập được (tính chung tất các loại bệnh phẩm) nước ta Những type huyết có khả gây bệnh thường gặp lâm sàng là: O111B4, O86B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12 Cơ chế gây bệnh E.coli khác tùy loại Bảng 1.4: Tóm tắt các đặc điểm liên quan đến khả gây bệnh các E.coli gây bệnh đường ruột Loại E.coli Gen động lực yếu tố độc lực Plasmid 50-70 MDa (EAF): Cơ chế gây bệnh Đặc điểm lâm sàng Bám dính tại chỗ nhờ Các tổn Mã hóa BFP (bundle-forming pilus), BFP thương Per (plasmid-encoded regulator) A/E Ler (LEE-encoded regulator PAI Tổn thương mô A/E EPEC nhiễm sắc thể (LEE) Tiêu chảy TTSS gồm: intimin (eaeA), các cấp protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG MAP (mitochondriaassociated protein) EAST-1 CDT (Cytolethal distending toxin) Các CFA mã hóa plasmid: CFA-I Bám vào niêm mạc Tiêu chảy (fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó), ruột non (CFA I-IV) cấp, phân CFA-II CFA-IV (fimbriae mềm) và sản xuất các độc tố thường ETEC pili dài liên quan với type IV ruột LTI, LTII, STa, toàn nước STb Độc tố chịu nhiệt LT I LT II (mã hóa plasmid) nhầy máu Hoạt hóa adenylate cyclase- tăng cAMP – giảm hấp thu Na+/tăng tiết Cl- - tiêu chảy NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Độc tố vững bền với nhiệt STa STb Hoạt hóa guanylate (mã hóa plasmid transposon) cyclase- tăng cGMP – tiết chloride và/hoặc ETEC giảm hấp thu NaCl – tiêu chảy Các gen plasmid 140 MDa mã Vi khuẩn bám xâm Hội chứng hóa các kháng nguyên xâm nhập nhập vào biểu mô đại lỵ EIEC trực (invasion plasmid antigen) IPaA – tràng, nhân lên gây khuẩn IpaD Điểm viêm loét hoại tử niêm bám dính kết tập mạc đại tràng AAF AAF tạo nên kiểu bám Tiêu chảy (aggregative adhesion fimbriae) dính hình chồng gạch kéo dài aggR điều hòa biểu Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr AAF Protein pet gây tích tụ dịch gây độc tố cho biểu mô EAEC tiêu hóa Độc tố EAST-1 (enteroaggregative EAST-1 phá hủy tế heat-stable toxin-1) bào biểu mô Protein làm tan máu thăng Protein làm tan máu bằng vận chuyển ion qua màng làm thăng bằng vận chuyển ion qua màng Plasmid 60 MDa mã hóa heamolysin, Độc tố Shiga: LCT, EspP Tiêu chảy - Hủy hoại các vi máu (do nhung mao hấp thu xuất huyết tế bào biểu mô ruột EHEC/ PAI nhiễm sắc thể VTEC đại tràng) - ức chế quá trình tổng hợp protein tế bào biểu mô đại tràng, dẫn đến làm chết tế bào, Độc tố Shiga (Stx1, Stx2, Stx2v) mã - gây hội chứng HUS hóa các gen nhiễm sắc thể NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc DAEC Các yếu tố bám dính Afa/Dr Afa/Dr gây bám dính Tiêu chảy (AIDA) phân tán EAST-1 EAST-1 phá hủy tế thường bào biểu mô Các geb set (enterotoxin) phân máu Có thể có TTSS với esc NHÓM Trang Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1.5 Nguyên tắc điều trị phòng bệnh 1.5.1 Điều trị E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, các chủng phân lập được từ nước tiểu, cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp Ngoài việc sử dụng kháng sinh, số việc khác có giá trị điều trị bồi phụ nước, điện giải trường hơp ỉa chảy (việc nhiều có vai trò quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở đường tiết niệu, rút ống thông sớm nếu được 1.5.2 Phòng bệnh Hiện chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu Để đề phòng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa E.coli, thực các biện pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu giống các vi khuẩn đường ruột khác Thực các biện pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viên E.coli các vi khuẩn gây bệnh hội quan trọng Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu E.coli: thực vệ sinh vùng hậu môn phận sinh dục ngoài, thực nghiêm túc nguyên tắc vô trùng phải tiến hành thăm dò đặt thông đường tiết niệu Điều trị loại trừ các yếu tố nguy khác NHÓM Trang 10 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI 2.1 Phương pháp truyền thống 2.1.1 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc  Nguyên tắc Cấy lượng mẫu xác định môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) chứa lactose chất thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau ủ môi trường 44oC 24 Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình môi trường TBX Kết được biểu thị bằng số E.coli 1g mẫu chưa pha loãng  Ưu điểm nhược điểm Ưu điểm: - Cho phép xác định số tế bào sống - Định lượng chọn lọc vi sinh vật Nhược điểm: - Mất nhiều thời gian, hóa chất công sức - Đòi hỏi kĩ thuật phân tích khắc khe 2.1.2 Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN  Nguyên tắc Số lương E.coli mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác 10 lần); mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ đến ống lặp lại Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống thử nghiệm; các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha loãng được vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu NHÓM Trang 11 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc  Ưu điểm nhược điểm Ưu điểm: - Khắc phục được nhược điểm phương pháp đếm trực tiếp - Cho biết được số lượng vi sinh vật có mẫu Nhược điểm - Dễ nhằm lẫn - Độ xác không cao - Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp 2.2 Phương pháp hiện đại 2.2.1 Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)  Nguyên tắc Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA  Ưu điểm nhược điểm: Ưu điểm: - Thời gian cho kết nhanh Có thể áp dụng với vi sinh vật khó nuôi cấy Khá đơn giản, tốn Phát được bào tử tiềm sinh Nhược điểm: - Mật độ vi sinh thấp cần thời gian nuôi cấy để làm giàu - Không phân biệt được tế bào sống tế bào chết 2.2.2 Phương pháp ELISA  Nguyên tắc Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng (microplate) Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên được giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên được phát bằng cách sử dụng NHÓM Trang 12 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxidase hay alkaline phosphate Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo các phản ứng có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu, phát diện định lượng kháng nguyên  Một số phương pháp ELISA thường sử dụng - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - Sandwich ELISA: - ELISA cạnh tranh  Ưu điểm phương pháp Elisa Ưu điểm: - Nhanh chóng thuận tiện - Kháng nguyên nồng độ thấp không biết được phát kể từ bắt giữ kháng thể lấy kháng nguyên cụ thể Nhược điểm: - Thời gian xét nghiệm lâu Chỉ có các kháng thể đơn dòng được sử dụng cặp phù hợp Kháng thể đơn dòng chi phí nhiều so với các kháng thể đa dòng Enzyme / chất phản ứng microwells phải được đọc sớm tốt NHÓM Trang 13 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 3.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo tiêu chuẩn ISO 16649 – 2:2001 được áp dụng cho tất các loại thực phẩm 3.2 Nguyên tắc Cấy lượng mẫu xác định môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) chứa lactose chất thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau ủ môi trường 44oC 24 Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình môi trường TBX Kết được biểu thị bằng số E.coli 1g mẫu chưa pha loãng 3.3 Môi trường hóa chất 3.3.1 Dung dịch pha loãng SPW Dung dịch pha loãng được tham chiếu theo TCVN 6507-1:2005 (ISO 68871:2003)  Thành phần - NaCl: 8.5g - Pepton: 1g - Nước cất: lít  Chuẩn bị Hòa tan các thành phần nước, đun nóng nếu cần Phân phối 90ml dịch pha loãng vào các bình (hoặc lọ có nấp vặn) 9mlvào các ống nghiệm Đậy nấp bình ống nghiệp, hấp khử trùng Chỉnh pH cho sau khử trùng, pH ± 0,2 25oC (nếu cần)  Mục đích Dùng để pha loãng mẫu 3.3.2 Môi trường Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX) NHÓM Trang 14 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Tham chiếu theo TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2: 2001)  Thành phần Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 20,0 g Muối mật No.3 1,5 g Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG) Dimetyl sulfoxit (DMSO)(b) 144 μmol(a) ml Thạch g đến 18 g(c) Nước 000 ml (a) Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni (b) Dimetyl sulfoxit độc hít tiếp xúc phải Cần sử dụng tủ hút khói Vì độc tính nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng (c) Phụ thuộc vào sức đông thạch  Chuẩn bị Hòa tan BCIG dimety sulfoxit dung dịch loãng theo khuyến cáo nhà sản xuất Hòa tan tất các thành phần nước đun đến sôi Chỉnh pH để sau khử trùng pH phải 7,2 ± 0,2 25 oC, nếu cần Khử trùng môi trường 15 phút nhiệt độ 121oC nồi hấp áp lực Làm nguội môi trường nồi cách thủy đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC  Mục đích Dùng làm môi trường nuôi cấy chọn lọc NHÓM Trang 15 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3.4 Quy trình phân tích Hình 3.4.1: Quy trình định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bước Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g/25g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml/25ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu Đồng mẫu dung dịch pha loãng SPW máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dịch pha loãng suốt quá trình thao tác phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng Do các bào tử lắng xuống nhanh pipet, nên để pipet tư thế nằm ngang (không để đứng) được làm đầy với thể tích huyền phù dung dịch pha loãng thích hợp NHÓM Trang 16 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Lắc huyền phù ban đầu các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống Hình 3.4.2:Túi nhựa dập mẫu có màng lọc Hình 3.4.3: Máy dập mẫu Hình 3.4.4: Hút lấy mẫu bằng Micropipet Bước Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu vời sai số ±5% cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng nhiệt độ thích hợp Trộn kỹ bằng máy vortex – 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thu được dung dịch pha loãng 10 ) Nếu cần, lặp lại thao tác để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho đến thu được lượng vi khuẩn thích hợp NHÓM Trang 17 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Hình 3.4.5: Quy trình pha loãng Bước Cấy ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng 1ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào đĩa petri Sử dụng nồng độ pha loãng liên tiếp, nồng độ đĩa petri Rót vào đĩa khoảng 15ml môi trường TBX Lật úp đĩa ủ 440C 24 Hình 3.4.6: Quy trình cấy ủ mẫu NHÓM Trang 18 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bước Đếm chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc 150 sau 24 nuôi cấy Khuẩn lạc E coli đặc trưng môi trường TBX có màu xanh Đếm các khuẩn lạc E coli đặc trưng đĩa có số đếm phù hợp Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy số E coli 1g mẫu Hình 3.4.7: Hình ảnh khuẩn lạc môi trường TBX 3.5 Kết Tổng số E coli 1g mẫu (X) được tính theo công thức: (CFU/g hay CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm được đĩa hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính bang mililit : Số đĩa được giữ lại độ pha loãng thứ NHÓM Trang 19 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc : Số đĩa được giữ lại độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ KẾT LUẬN Hiện nay, ngộ độc thực phẩm trở thành mối quan tâm toàn xã hội Có nhiều nguyên nhân gây các vụ ngộ độc thực phẩm phần lớn các trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật Ngộ độc thực phẩm thường xảy nguyên liệu dùng chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn độc tố vi khuẩn Một loại ngộc độc thực phẩm gây vi sinh vật thường gặp ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E.coli Trong thực tế sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm để hạn chế ô nhiễm tác hại vi khuẩn quá trình thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến nấu nướng tới tay người tiêu dùng thường phức tạp gặp nhiều khó khăn Do các phương pháp phát vi khuẩn E.coli có vai trò quan trọng nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm làm giảm tỷ lệ ngộ độc vi khuẩn gây nên NHÓM Trang 20 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc TÀI LIỆU THAM KHẢO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2: 2001) Vi sinh vật thực phẩm, tập Kỹ thuật kiểm tra tiêu dánh giá chất lượng an toàn thực phẩm, NXB Y học Trần Linh Thước, Các phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục Vi khuẩn y học, Bộ y tế, NXB Giáo dục Việt nam, chủ biên PGS TS Lê Văn Phủng Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm (Lưu hành nội bộ) , Đinh Thị Hải Thuận (chủ biên), tháng năm 2013 Leo Heijnen and Gertjan Medema , Journal of water and health 04.04.2006, Quantitative detection of E coli, E coli O157 and other shiga toxin producing E.coli in water samples using a culture method combined with real-time PCR Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis Littledike, Jimmy Kwang (1996) “Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of Escherichia Coli”, Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No 9p 3325-3332 NHÓM Trang 21 [...].. .Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG E. COLI 2.1 Phương pháp truyền thống 2.1.1 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc  Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) chứa lactose và một chất chỉ thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu... 04.04.2006, Quantitative detection of E coli, E coli O157 and other shiga toxin producing E. coli in water samples using a culture method combined with real-time PCR 7 Youngsheng He, James, E. Keen, Ralph B.Westama, E. Travis Littledike, Jimmy Kwang (1996) “Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of Escherichia Coli , Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No 9p 3325-3332 NHÓM 5 Trang 21... NHÓM 5 Trang 18 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc E coli đặc trưng trên môi trường TBX có màu xanh Đếm các khuẩn lạc E coli đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy về số E coli trong 1g mẫu... nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt NHÓM 5 Trang 13 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E. COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 3.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp này tham chiếu theo tiêu chuẩn ISO 16649 – 2:2001 được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm 3.2 Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn... như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên  Một số phương pháp ELISA thường sử dụng - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - Sandwich ELISA: - ELISA cạnh tranh... trường trên nồi cách thủy đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC  Mục đích Dùng làm môi trường nuôi cấy chọn lọc NHÓM 5 Trang 15 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3.4 Quy trình phân tích Hình 3.4.1: Quy trình định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml... ảnh khuẩn lạc trên môi trường TBX 3.5 Kết quả Tổng số E coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức: (CFU/g hay CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bang mililit : Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất NHÓM 5 Trang 19 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. .. 44oC trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc E. coli điển hình trên môi trường TBX Kết quả được biểu thị bằng số E. coli trên 1g mẫu chưa pha loãng  Ưu điểm và nhược điểm Ưu điểm: - Cho phép xác định số tế bào sống - Định lượng chọn lọc vi sinh vật Nhược điểm: - Mất nhiều thời gian, hóa chất và công sức - Đòi hỏi kĩ thuật phân tích khắc khe 2.1.2 Định lượng E. coli bằng phương pháp MPN  Nguyên... phục được nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp - Cho biết được số lượng vi sinh vật có trong mẫu Nhược điểm - Dễ nhằm lẫn - Độ chính xác không cao - Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp 2.2 Phương pháp hiện đại 2.2.1 Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)  Nguyên tắc Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA... Thước, Các phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục 4 Vi khuẩn y học, Bộ y tế, NXB Giáo dục Việt nam, chủ biên PGS TS Lê Văn Phủng 5 Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm (Lưu hành nội bộ) , Đinh Thị Hải Thuận (chủ biên), tháng 7 năm 2013 6 Leo Heijnen and Gertjan Medema , Journal of water and health 04.04.2006, Quantitative detection of E coli, E coli O157