Đang tải... (xem toàn văn)
NGuyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy Thao tác nhuộm tế bào cho máy tế bào dòng chảy ứng dụng máy tế bào dòng chảy vào bệnh bạch cầu cấp Có đường link hướng dẫn dùng phần mềm FC Tài liệu chính thống, chọn lọc, có nguồn rõ ràng đáng tin cậy, thực hành thực tế.
MỤC LỤC THUẬT NGỮ SỬ DỤNG Thuật ngữ chuyên ngành Compensation : Chạy chuẩn máy, thiết lập bù trừ quang phổ tự động CS&T (Cytometer Setup and Tracking) : Thiết lập điều kiện chuẩn máy Blast cell: Tế bào non Erythroblast: Các nguyên hồng cầu nói chung hồng cầu non có nhân tủy xương tạo máu, bình thường không máu ngoại vi Megacaryoblast: Nguyên mẫu tiểu cầu Monoblast: Nguyên bạch cầu mono đơn nhân Lymphoblast: Nguyên bạch cầu lympho CD (Cluster of differentiation: nhóm biệt hóa): kháng thể đặc hiệu AL (Acute Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy ALL (Acute lymphoblastic Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Các chữ viết tắt RPM: Tốc độ ly tâm (vòng/phút) FC: Flow Cytometry ( Phân tích tế bào dòng chảy) BCC: Bạch cầu cấp DAMDTB: Dấu ấn miễn dịch tế bào FC: Máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry) FITC: Fluorescein Isothiocyanante PE: Phycoerythrin PerCP: Peridin chlorophyll PE-Cy7: Phycoerythrin-cyanine APC: Allophycocyanin CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng – bệnh viện ung bướu lớn nước mang dấu ấn ông Nguyễn Bá Thanh 1.1 Giới thiệu chung Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng đánh giá lớn nước không quy mô giường bệnh, công tác khám điều trị mà quang cảnh đẹp, đại Ngày 28/3/2009, Bệnh viện ung thư Đà Nẵng khởi công xây dựng diện tích 15 phường Hoà Minh, quận Liên Chiểu (Đà Nẵng) Gần năm sau, bệnh viện thức tiếp nhận khám chữa cho bệnh nhân ung thư khu vực miền Trung Chính thức từ ngày 1/9/2015 bệnh viện ung thư Đà Nẵng đổi tên thành bệnh viện ung bướu Đà Nẵng trực thuộc sở y tế thành phố Đà Nẵng Với tổng kinh phí 1.500 tỷ đồng từ tổ chức, cá nhân có lòng hảo tâm, với nguồn từ xổ số kiến thiết thành phố hỗ trợ Chính phủ, dự án cho có công lớn Nguyên Bí thư Nguyễn Bá Thanh với lời kêu gọi ủng hộ đầy tâm huyết ông Chức bệnh viện tiếp nhận khám phát sớm bệnh nhân ung thư, chẩn đoán xác điều trị có hiệu bệnh lý ung thư, dự phòng bệnh ung thư cho nhân dân thành phố Đà Nẵng khu vực miền Trung, triển khai chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ tham gia đào tạo nhân lực chuyên ngành Bệnh viện đánh giá lớn nước không quy mô giường bệnh, công tác khám điều trị mà quang cảnh đẹp, đại Tổng diện tích sàn bệnh viện 60.000 m2, đạt 120 m2 giường bệnh, thiết kế theo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan hài hòa, tiện nghi thân thiện, không gian xanh bao phủ khắp nơi Quy mô 500 giường bệnh điều trị nội trú Cụ Lê Thị Bốn 83 tuổi (ngụ huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam) điều trị ung thư gan Khoa chăm sóc điều trị giảm nhẹ bệnh viện tháng Nguyễn Thị Á, cho biết tình trạng bệnh mẹ chồng chị thuyên giảm, sức khoẻ tốt lên nhiều Bệnh nhân có bảo hiểm y tế bệnh nhân khám chữa bệnh theo yêu cầu đón nhận khám chữa điều trị Với thiết bị chẩn đoán hình ảnh đại Việt Nam máy MRI 3,0 Tesla (cả nước có chiếc), CT-scan 128 lát , người bệnh cất công chuyển Hà Nội TP HCM để kiểm tra trước Với 76 bác sĩ chuyên khoa, 82% bác sĩ có trình độ từ thạc sĩ y học/BS chuyên khoa trở lên, có giáo sư phó giáo sư y học, tiến sĩ y học BS chuyên khoa II, BS nội trú, 43 thạc sĩ y học BS chuyên khoa I, bệnh nhân đảm bảo điều trị chăm sóc tốt 1.2 Các phận hoạt động 1.2.1 Các phòng chức năng: 08 phòng Phòng Hành quản trị; Phòng Tổ chức cán bộ; Phòng Kế hoạch tổng hợp; Phòng Tài kế toán; Phòng Công nghệ thông tin; Phòng Điều dưỡng; Phòng Chỉ đạo tuyến quản lý chất lượng bệnh viện; Phòng Vật tư, trang thiết bị y tế 1.2.2 Các khoa: 18 khoa Các khoa lâm sàng: Khoa Khám bệnh cấp cứu; Khoa Chăm sóc giảm nhẹ; Khoa Hóa trị 1; Khoa Hóa trị 2; Khoa Huyết học; Khoa Gây mê hồi sức; Khoa Ngoại (Tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục nam, mô mềm); Khoa Ngoại (Thần kinh, đầu cổ, lồng ngực); Khoa Ngoại (Vú phụ khoa); 10 Khoa Xạ trị; 11 Khoa Dược; 12 Khoa Y học hạt nhân; Các khoa cận lâm sàng: 13 Khoa Chẩn đoán hình ảnh; 14 Khoa Nội soi thăm dò chức năng; 15 Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn; 16 Khoa Xét nghiệm - Truyền máu; 17 Khoa Giải phẫu bệnh; 18 Khoa Kỹ thuật phóng xạ Vì em phân công thực tập khoa Xét nghiệm – Truyền máu nên giới thiệu rõ khoa Giới thiệu khoa Xét nghiệm – Truyền máu 2.1 Tên đơn vị, địa chỉ, điện thoại liên hệ: Khoa Xét nghiệm - Truyền máu thành lập từ ngày 28/08/2015 theo định thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng UBND TP.Đà Nẵng Trên sở sáp nhập nguyên trạng Khoa xét nghiệm, Khu truyền máu Trung tâm nghiên cứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng - Địa chỉ: Tầng – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng – Tổ 14 Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng - Điện thoại: 05113.717361 (Hành chính) 05113.717 362 (BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa) 05113.717 364 (Labo Hóa sinh – Huyết học) 05113.717 366 (Labo Vi sinh) 2.2 Chức nhiệm vụ a Các xét nghiệm Huyết học, Đông máu Tế bào: - Đánh giá chức đông máu Nội sinh Ngoại sinh - Tổng phân tích tế bào máu máy đếm Laser - Các xét nghiệm chuyên sâu Huyết đồ, Tủy đồ, D-Dimer, Tế bào dịch b Các xét nghiệm Hóa sinh- Miễn dịch: - Các xét nghiệm hóa sinh đánh giá chức gan, thận, chuyển hóa, biland lipid, calci, phospho, HbA1c, A.Uric, LDH… - Các xét nghiệm hóa sinh cao cấp định lượng kháng thể IgG, IgM, IgA, IgE, β2- Microglobulin, Pre-albumin, CK-MB… - Các xét nghiệm Hormon T3, FT3, T4, FT4, TSH, Estrogen, Testosteron, Cortisol, ADH… - Đặc biệt xét nghiệm dấu hiệu sinh học bướu nhằm giúp tầm soát chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan, phổi, đường tiêu hóa, thận,vú, buồng trứng, cổ tử cung, tụy như: CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, Cyfra 21-1, AFP, Pepsinogen I & II, Pro-GRP, PSA, SCC, HE 4, NSE … c Các xét nghiệm nuôi cấy, định danh vi khuẩn, nấm thực kháng sinh đồ, xác định nồng độ ức chế tối thiểu … thực thường quy 2.3 Cơ cấu tổ chức: Cơ cấu tổ chức khoa sau: TRƯỞNG KHOA KTV TRƯỞNG TỔ CTM – ĐÔNG MÁU TỔ TẾ BÀO (HUYẾTTUỶ ĐỒ-TB DỊCH) TỔ HÓA SINH – MIỄN DỊCH TỔ VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ TỔ LẤY MẪU-NHẬN VÀ XỬ LÝ MẪU 2.4 Cơ sở vật chất, trang thiết bị: Khoa XNTH trang bị hệ thống phân tích mẫu hoàn toàn tự động hãng lừng danh giới Abbott, Roche, Siemens, Becton, Dickinson - Đối với xét nghiệm Hóa sinh – Miễn dịch khoa trang bị hệ thống kết nối đại hãng Abbott, Hoa Kỳ (Module Ci16200) máy xét nghiệm miễn dịch i1000 hãng Abbott sử dụng kỹ thuật miễn dịch hóa phát quang (CMIA) tiên tiến với độ nhạy độ đặc hiệu cao Hệ thống phân tích khí máu động mạch ion đồ đại gồm máy: máy cobas b121 hãng Roche máy Rapid point 400 hãng Siemens (Germany) Hệ thống phân tích nước tiểu hoàn toàn tự động 18 thông số Combi scan 500 hãng Siemens (Germany) - Đối với xét nghiệm Huyết học khoa trang bị hệ thống đại, hoàn toàn tự động bao gồm máy xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu 33 thông số máy đếm laser Cell Dyn Ruby hãng Abbott (Hoa Kỳ) máy XS 800 hãng Sysmex (Nhật Bản) Các xét nghiệm đông máu thực hoàn toàn tự động máy CA 1500 hãng Sysmex (Nhật Bản) máy STA Compact CT hãng Stago (Pháp) Xét nghiệm máu lắng tự động hoàn toàn thực máy Human Sed 25 mix hãng Human (Germany) - Đối với xét nghiệm vi sinh, bao gồm xét nghiệm định danh vi khuẩn, nấm thực kháng sinh đồ, xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn gây bệnh thực hoàn toàn tự động máy BD Phoenix hãng Becton Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ) Hệ thống nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí kỵ khí đại trang bị, xét nghiệm cấy máu thực máy Bactec 9250 hãng Becton Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ) Hệ thống kính hiển vi – xét nghiệm tế bào: - Kính hiển vi đối pha Nikon Eclipse Ci H550s – Nhật Bản - Hệ thống kính hiển vi quang học Nikon Eclipse E100 – Nhật Bản Đơn vị Di truyền sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm-Truyền máu 3.1 Nhiệm vụ đơn vị: Đơn vị Di truyền sinh học phân tử chuyên xét nghiệm mảng miễn dịch ung thư, di truyền SHPT ung thư STT KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH UNG THƯ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN, SHPT UNG THƯ Xét nghiệm dấu ấn tế bào Bạch cầu cấp (20CD) Xét nghiệm phát gen Đếm tế bào gốc CD34+ Flowcytometry Xét nghiệm gen bệnh máu ác tính Đếm số lượng tế bào Lympho T CD4/CD8-CD3 Xét nghiệm công thức NST (Karyotype) Phân tích CD Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuật DNA với Protein Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (MRD) sau điều trị (24CD) Phát gen JAK2 V617F kỹ thuật Allen-specific PCR Định lượng vvirus viêm gan B (HBV) Phân loại Lymphoma Xét nghiệm định type HLA (bằng kỹ thuật sinh học phân tử) HCV (RT-PCR) Kháng thể kháng nhân HIV (PCR) Xét nghiệm đọ chéo ( Flowcytometry) HIV (RT-PCR) 10 Xét nghiệm Đường – Ham Xác định DNA viêm gan B 11 Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố đêm (PNH)(5CD) Định lượng virus viêm gan B (HBV) cho bệnh viêm gan C mãn tính 12 Xét nghiệm CD64, CD11b Định lượng virus viêm gan C SEPSIS (HCV) cho bệnh viêm gan C mãn tính 13 PCR chuẩn đoán CMV 14 Đo tải lượng CMV 15 PCR chuẩn đoán lao hệ thống Cobas TaqMan48 Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm 3.2 Trang thiết bị đơn vị Di truyền sinh học phân tử H1: Máy Flowcytometry H4: Máy ly tâm ống nghiệm H2: Tủ ấm có trao đổi khí H5: Máy ly tâm Eppemdorf H3: Tủ ATSH cấp H6: Máy Realtime PCR Hình 9: Tủ lạnh -200C Hình 7: Tủ hút khí độc Hình 8: Tủ lạnh 40C Hình 10: Máy Vortex Hình 11: Máy Spindown Hình 12: Máy PCR Hình 13: Máy đo nồng độ Acid nucleid Hình 14: Máy đọc gel Hình 15: Máy điện di Hình 16: Ủ nhiệt có lắc H18: Kính hiển vi huỳnh Hình 17: Tủ lạnh -800C quang camera 10 Vì tạo từ tủy xương tế bào gốc vạn nên tế bào tiền thân dòng tế bào hạt, dòng mono hồng cầu mẫu tiểu cầu có số dấu ấn chung CD34, CD117, CD38, CD13, CD33, HLA.DR Tiền tủy bào (promyelocyte) đặc trưng CD34 HLA-DR, tiếp tục diện CD13, CD33, CD117, bắt đầu xuất CD15 Đầu giai bào Hình 12: Sơ đồ phát triển DAMDTB tế bào dòng hạt bình thường (myelocyte), đoạn tủy CD11b bắt đầu xuất tăng dần CD15, CD16 xuất bề mặt tế bào vào giai đoạn hậu tủy bào (metamyelocyte) chuyển thành bạch cầu hạt chia múi (segment) Cuối chuyển sang chia múi CD64 giảm dần kháng nguyên muộn khác xuất như: CD10, CD24, CD32, CD35, CD65 Tế bào mono trưởng thành đặc điểm chung tế bào dòng tủy nêu trên, có đặc điểm riêng giúp phân biệt với giai đoạn trưởng thành khác dòng hạt Đó đồng diện CD36, CD64, CD4, HLADR tăng dần nồng độ CD15, CD11b, CD14 giai đoạn muộn Tế bào mono non CD14, nên cần khảo sát cặp đôi CD36/CD64 để phát trường hợp BCC dòng mono Khi tế bào trưởng thành, CD14 trở nên dày đặc, đồng thời có giảm nhẹ CD15 Tế bào mono trưởng thành hoạt hóa, 26 chuyển dạng thành đại thực bào, xuất thêm kháng nguyên CD23, CD25, CD68, CD69 Tuy nhiên, DAMDTB phân biệt tế bào tiền thân dòng mono dòng hạt MPO dấu ấn quan trọng dòng hạt mono MPO loại peroxidase - chất bảo vệ thể chống lại xâm lấn vi sinh vật, nằm hạt có nguyên sinh chất tế bào bạch cầu hạt đa nhân (neutraphil,basophil,eosinophil) tế bào mono Tuy nhiên tế bào hạt trưởng thành nồng độ MPO cao, MPO giảm rõ tế bào mono trưởng thành Một quần thể tế bào tương đối gặp tủy bình thường mẫu tiểu cầu (megakaryocyte).Các DAMDTB đặc trưng cho dòng tiểu cầu CD41a, CD42 CD61 Quần thể mẫu tiểu cầu mẫu tủy xương bình thường có CD45 yếu, CD33-, CD11b-, MPO-, CD117+ giảm dần trình trưởng thành Tiểu cầu trưởng thành CD45 Hình 13: Sơ đồ phát triển DAMDTB tế bào dòng mono bình thường 27 Hình 14: Sơ đồ phát triển hồng cầu bình thường Nguyê n tiền hồng cầu (proerythroblast) có CD34, CD38, CD71, CD117, CD45 yếu CD45 dần trình trưởng thành giai đoạn hồng cầu lưới hồng cầu trưởng thành có CD45- Glycophorin A (còn ký hiệu CD235a) xuất giai đoạn nguyên hồng cầu (erythroblast) giữ nguyên suốt trình phát triển dòng hồng cầu Hồng cầu trưởng thành (không nhân) với đặc trưng CD235a+ CD45- CD71- dễ dàng bị phá hủy loại bỏ khỏi mẫu máu mẫu tủy tình xử lý ammonium chloride Do có chung nguồn gốc từ tế bào gốc vạn biệt hóa thành nhiều dòng khác nên bệnh BCC dòng tủy đa dạng phức tạp với nhiều phân nhóm nhỏ bao gồm dòng hạt, dòng mono, hồng cầu mẫu tiểu cầu Trong chẩn đoán bệnh BCC dòng tủy, hình thái học có vai trò quan trọng Ngày kỹ thuật DAMDTB góp phần làm rõ số trường hợp phức tạp, cần phân biệt phân nhóm M0, M7 BCC dòng lympho, BCC khó xác định (AUL), BCC biphenotype 2.2.5 DAMDTB xác định BCC biophenotype Theo tiêu chuẩn FAB, hình thái học trường hợp vừa giống BBC dòng lympho dòng tủy Trên quan điểm DAMDTB, nhóm bệnh BCC biophenoltype phải có diện hai kháng nguyên nội bào đặc trưng cho dòng ( cyCD3, MPO, cyCD79 và/hoặc cyCd22), số kháng nguyên khác màng tế bào Kiểu hình thường gặp đồng diện kháng 28 nguyên dòng B dòng tủy, dòng lympho T dòng tủy Trong trường hợp đồng hiện dòng B T, dòng gặp Thang điểm EGIL xác định BCC biophenotype công cụ hỗ trợ giúp Điểm Mỗi dấu ấn dương tính = điểm Dòng B CD 79a CyIgµ CyCD22 SmCD22 CD19 CD10 CD20 Dòng T CyCD3 SmCD3 Anti – TCRαβ Anti – TCRλσ CD2 CD5 CD8 CD10 TdT CD7 CD1a Dòng tủy Anti – MPO ( anti lysozyme) CD117 CD13 CD33 CD65 TdT CD14 CD24 CD15 CD64 CD11b, CD11c chẩn đoán xác BCC biophenotype Những trường hợp không thỏa mãn với Mỗi dấu ấn dương tính = điểm Mỗi dấu ấn dương tính = 0.5 điểm tiêu chuẩn thang điểm xem đồng diện kháng nguyên khác dòng Đặc điểm thuận lợi cho việc đánh giá TLTBAT sau Để xác định BCC biophenotype đòi hỏi phải có điểm dòng tế bào Và dấu ấn xem dương tính có >20% tế bào mang dấu ấn Quy trình phân loại bệnh BCC Mục đích: Quy trình phục vụ cho việc chuẩn đoán phân loại bệnh bạch cầu cấp (Acute Leukemia) hệ thồng máy xét nghiệm Flowcytometre Fas Canto II 3.1 Các kháng thể đơn dòng 29 Ngày đa phần kháng thể gắn huỳnh quang có sẵn thị trường Việc lựa chọn kháng thể vào danh mục sử dụng thường qui phải dựa vào nhu cầu thực tế phòng thí nghiệm (mục đích chẩn đoán, số lượng mẫu, giá thành) Do thống danh mục kháng thể Tuy nhiên nên thiết kế kháng thể cần dùng theo phương pháp bậc thang: bắt đầu số kháng thể gợi ý đến dòng tế bào đó; từ kết ban đầu, tiếp tục nhuộm thêm kháng thể cần thiết…Bằng cách tiết kiệm chi phí thuốc thử, song kéo dài thời gian Dưới số kháng thể đơn dòng cho nhiều thông tin hữu ích chẩn đoán bệnh BCC lymphoma Dòng tế bào Các dấu ấn non Dòng lympho B Dòng lympho T Tế bào giết tự nhiên (NK cell) Dòng hạt Dòng mono Kháng thể đơn dòng CD34, CD38, CD117( dòng tủy) TdT CD10 ( dòng lympho) HLA.Dr (dòng hạt lympho T) CD19, cyCD22, smCD22, cyCD79a, CD79b, CD20, CD5, HLA.DR, CD38, CD138, CD23, CD24, CD25, Cd103, Igk/, IgM, CD43, FMC-7 CD2, CyCD3, smCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a CD56, CD57, CD16, CD2, CD7, CD8 MPO, CD13, CD16, CD2, CD7, CD8 Tương tự dòng hạt đặc trưng riêng CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR CD71, Cd235a, CD36 Dòng hồng cầu Dòng mẫu tiểu cầu CD61, CD41, CD42 Bảng 2: Bảng tổng hợp kháng thể đơn dòng chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp lymphoma 30 Tóm lại, để đạt kết xác khách quan cần áp dụng dàn kháng thể đơn dòng đủ lớn bao quát để phân biệt dòng tế bào với nhau, đồng thời đánh giá giai đoạn trưởng thành dòng 3.2 Hóa chất thuốc thử TÊN HÓA CHẤT ĐÓNG GÓI STT Bộ kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang FACS lysing solution Lọ/100 Sheath (FACS flow) Thùng/20 FACS clean Thùng/5 CST Bead Lọ/50 BD compbead Lọ/50 Intrasure Kit/50 test 3.3 Nguyên lý xét nghiệm SỐ LƯỢNG/1 XÉT NGHIỆM ĐƠN VỊ TÍNH Test 0.5 0.5 0.1 0.1 0.1 0.2 ML L L Test Test Test Kháng nguyên có bề mặt bên tế bào kết hợp với kháng thể đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang, sau phân tích hệ thống FC với phần mềm FACSDivaTM giúp phân loại chuẩn đoán AL 3.4 Mẫu nghiệm Xử lý mẫu Thu thập mẫu Kiểm tra phân tích Kết Quy trình thực Lưu đồ: Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm máu, dịch hút tủy xương, loại dịch khác theo yêu cầu lâm sàng Chất chống đông EDTA Số lượng mẫu: 2ml Bước 2: Xử lý mẫu • Xử lý mẫu xét nghiệm: loại mẫu tươi giữ dạng huyền phù thuốc chống đông, tốt EDTA; • Xét Panel xét nghiệm Flowcytometry (Ví dụ: Bảng bảng 4); STT FITC PE PER-CP 31 APC PE_Cy7 20 10 45 34 11 19 56 45 13 33 45 36 Unstain Bảng 3: Panel sàng lọc Acute Leukemia STT FITC PE PER-CP APC PE_Cy7 Cy_3 B-ALL Specific Cy_TdT Cy_79a 45 IgM C_kappa Cy_lambda 45 Cy_IgM T-ALL Specific Cy_TdT Cy_79a 45 16 Cy_3 4 1a 45 Mo-M5 Cy_MPO Cy_33 45 11b HLA-DR MPO 117 45 14 117 235a 117 Panel for M6 / M7 (run if indicated) M6 36 71 45 Bảng 4: Panel sàng lọc Acute Leukemia Mẫu nghiệm nhuộm với kháng thể gắn huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng trạng hóa chất thuốc nhuộm mà phận xét nghiệm có Người ta thường nhập kháng thể phổ biến, dùng cho nhiều người • Nhuộm ngoại bào: - Đánh dấu tube chuẩn bị thực - Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 / tube) vào tube - Cho μl kháng thể đơn dòng (theo panel) - Votex tube giây - Ủ tube tối, nhiệt độ phòng 15 phút - Votex tube giây - Cho ml lysing vào tube 32 - Votex tube giây - Ủ tube 10 phút tối, nhiệt độ phòng Chú ý votex tube phút/lần - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nổi, thấm giấy thấm - Cho tiếp ml sheath vào tube Votex - Ly tâm 300g/ phút - Đổ bỏ dịch - Tái huyền dịch tube 0.2 ml sheath Votex • Nhuộm nội bào: - Đánh dấu tube chuẩn bị thực - Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 / tube) vào tube - Cho μl kháng thể đơn dòng nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào (theo panel) - Votex tube giây - Ủ tube tối, nhiệt độ phòng 15 phút - Votex tube giây - Cho 100 μl dung dịch FIX vào tube nhuộm nội bào Votex đều, ủ tối 15 phút - Cho ml sheat vào tube Votex - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nhẹ nhàng, thấm giấy thấm (chú ý tránh để tế bào) - Cho 100 μl dung dịch Perm vào tube nhuộm nội bào, tiếp tục cho μl kháng thể nhuộm nội bào, Votex Ủ tối 20-30 phút (Votex tube phút/ lần) - Cho ml sheat vào tube Votex - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nhẹ nhàng - Cho ml sheat vào tube Votex 33 - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch - Tái huyền dịch tube 0.2 ml sheat Votex Lưu ý: Mẫu nhuộm sớm tốt để tránh tế bào bị chết nhiều làm ảnh hưởng đến kết Phương pháp nhuộm với nhiều màu huỳnh quang đánh giá cao cho phép phát nhiều DAMDTB lúc phản ánh mối quan hệ mật thiết dấu ấn Thông thường để quan sát kháng nguyên bề mặt tế bào, cần ủ mẫu tủy mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 10-15 phút Vì chẩn đoán bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có nhân, nên phải sử dụng ammonium chloride dung dịch có tác dụng tương tự để loại bỏ hồng cầu trưởng thành (HC không nhân) Các tế bào thuộc dòng hồng cầu chưa trưởng thành có nhân không bị phá hủy đề kháng với ammonium chloride Khi cần khảo sát thêm dấu ấn nằm bào tương hay nhân tế bào, người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên qua màng tế bào đến gắn với kháng nguyên đích bên tế bào Các kháng nguyên bên tế bào thông dụng TdT, chuỗi nhẹ chuỗi nặng, cyCD3, cyCD22, cyCD79a, MPO, bel-2, cyclin-D1, ZAP-70 Bước 3: Thu thập mẫu Các mẫu sau nhuộm đưa vào chỗ hút mẫu máy FC chuẩn bị kiểm tra phân tích Bước 4: Kiểm tra phân tích phần mềm BD FACSDiva hệ thống FACSCanto II Hướng dẫn cách dùng từ file pdf theo link này: http://www.vnio.org.vn/LinkClick.aspx?fileticket=JLeGywhHZUw %3D&tabid=287&language=vi-VN Bước 5: Kết Dựa vào tiêu sau để đánh giá đưa kết quả: - Nồng độ kháng nguyên có mức độ (âm tính, yếu, trung bình, mạnh); - Có mức độ tế bào dương tính (0-10%; 10-20%; 20-50%; 50-100%); 34 - Sự diện mức kháng nguyên; - Sự biểu kháng nguyên khác dòng; - Sự vắng mặt kháng nguyên đặc hiệu dòng Kiểm tra phân tích liệu có Dot plots Tạo mẫu trả kết bệnh nhân Nhập liệu cần thiết phân tích Nhận xét sơ kết Lưu kết bệnh nhân Kiểm tra trả kết xét nghiệm Kiểm tra đánh giá lại liệu kết xét nghiệm Đề nghị kết luận cuối Ký xác nhận phiếu kết xét nghiệm 3.5 Các nguyên nhân sai lầm – khắc phục Sai sót – Nguyên nhân Lượng tế bào quá nhiều Cách khắc phục Kiểm tra lại số lượng tế bào mẫu nghiệm/ Xử lý lại mẫu Lẫn nhiều hồng cầu Rút kinh nghiệm lần sau Dùng kháng thể không đúng, xuất Kiểm tra lại kháng thể/ Xử lý lại liệu bất thường mẫu Tín hiệu màu huỳnh quang trùng lấp Thực Compensation Phân bố quần thể tế bào không Xử lý lại mẫu phù hợp với quần thể bình thường Lấy lại mẫu Tế bào bị vón cục Chú ý votex tốt Xử lý lại mẫu 3.6 Tiêu chuẩn đánh giá kiểm tra chất lượng Không xuất bất thường trình xử lý, thu thập, phân tích mẫu Kết phù hợp với chuẩn đoán khác Trả kết thời gian quy định Thực quy trình Compensation chạy CS&T thời gian quy định Lưu kết quả, trình chuẩn máy, calib đầy đủ Huyền dịch tế bào sau xử lý không bị vón, số lượng tế bào đảm bảo cho việc phân tích Hoàn thành kỹ thuật thời gian quy định 3.7 Tác dụng dung dịch quy trình nhuộm Dung dịch Lysing Sheat FIX Tác dụng Ly giải hồng cầu tiểu cầu Tạo thủy lực dồn tế bào chảy thành dòng Cố định tế bào 35 Perm Tác nhân thúc đẩy giúp kháng thể tìm kiếm gắn vào kháng nguyên nhanh dung dịch có thành phần giúp phá vỡ hồng cầu giữ lại bạch cầu Hai phiếu trả kết sau xét nghiệm kỹ thuật FC 36 III KẾT LUẬN Qua nghiên cứu nội dung đề tài em biết rõ cách xét nghiệm chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp nói riêng ung thư máu nói chung 37 DAMDTB có kết luận đáng tin cậy phương pháp phân tích khách quan, phản ánh trung thực dương tính dấu ấn đặc trưng dòng, kết hợp với âm tính dấu ấn thuộc dòng khác.Ngoài kết DAMDTB phụ thuộc vào người đọc khác nhau.Tủy đồ có hạn chế phân biệt dòng B T kỹ thuật DAMDTB Kỹ thuật phân tích tế bòa theo dòng chảy áp dụng số lĩnh vực, bao gồm sinh học phân tử , bệnh học , miễn dịch học , sinh học thực vật sinh vật biển Nó có ứng dụng rộng rãi y học (đặc biệt việc cấy ghép, huyết học, miễn dịch học ung thư hóa trị, chẩn đoán trước sinh, di truyền phân loại tinh trùng cho chọn lọc trước quan hệ tình dục ) Ngoài ra, sử dụng rộng rãi nghiên cứu để phát tổn thương DNA chết theo chu trình Trong sinh học biển, thuộc tính huỳnh quang tự động quang hợp sinh vật phù du khám phá FC để mô tả phong phú cấu trúc quần thể Trong kỹ thuật protein, đo dòng tế bào sử dụng kết hợp sàng lọc nấm men vi khuẩn để xác định biến thể protein hiển thị bề mặt tế bào với đặc tính mong muốn Ngoài kiến thức chuyên ngành lĩnh hội em học hỏi thêm kỹ mềm, khả làm việc nhóm, cách lắng nghe biểu đạt suy nghĩ từ giúp em trưởng thành tự tin cho đường lập nghiệp sau 38 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nước: [1] BS.Vũ Hoàng Phương Thư, Sở y tế Tp Hồ CHí Minh, bệnh viện truyền máu huyết học [2] Nguyễn Phương Liên, Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy để đánh giá tồn lưu tế bào ác tính bệnh bạch cầu cấp, Luận án tiến sĩ sinh học, 2012, pp1 [3] Nguyễn Thị Mai Hương, Bùi Văn Viên, Đánh giá kết điều trị bệnh nhân bạch cầu cấp thể lympho nhóm nguy cao giai đoạn cảm ứng, phác đồ CCG 1961 bệnh viện nhi trung ương, Tạp chí nhi khoa 2013, 6, [4] PGS TS Nguyễn Thanh Long, PGS TS Bùi Đức Dương cộng sự, Xét nghệm đếm tế bào T-CD4 điều trị HIV/AIDS, tài liệu đào tạo dành cho học viên Hà Nội, tháng 12 năm 2012 [5] Tài liệu nội viện Huyết học truyền máu Trung Ương Quốc tế: [6] Dr Mohammed h saiema ldahr kaau, Faculty of applied medical sciences, Medical technology dept [7] Michael Brown and Carl Wittwera, Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications in Hematology, Clinical Chemistry, August 2000 vol 46 no 12211229 [8] Understanding Leukaemias, Lymphomas and Myeloma, The Leukaemia Foundation 39 40 [...]... giúp tập trung tế bào/ vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/ giây Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp) Nhờ...CHƯƠNG II: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRONG XÉT NGHIỆM BỆNH BẠCH CẦU CẤP ( FLOW CYTERMETRY – FC ) I Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảy I.1 Lịch sử Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ảnh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS – Flourescent... dịch bằng kỹ thuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines Xác định tế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ thuật đo cytokine nội bào - Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiên cứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnh hưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào 2 Ứng dụng kỹ thuật FC... kỹ thuật FC để xét nghiệm chẩn đoán bệnh bạch cầu và ung thư hạch bạch huyết Phân tích chu kỳ tế bào và mức bội thể của khối u Phản ứng chéo tương hợp mô (ghép tạng) [6] - Biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lympho T-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầu lưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động, thực vật - Phân. .. theo dòng chảy (flow cytometry FC) là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và một điện trường Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại: - Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vào... thể tế bào rất nhỏ ( bệnh viện TMHH TP.HCM năm 2009 đã có thêm máy 6 màu, Viện Hải dương học Nha Trang ) Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định DAMDTB trong chẩn đoán, phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương pháp và kiểu hình DAMDTB phù hợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có I.3 Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy [5] Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo dòng. .. sát có thể là một Protein, immunoglobulin, cytokine…nằm trên màng tế bào, trong bào tương hoặc thậm chí trong nhân tế bào 11 Từ năm 1992, các chuyên gia Việt Nam đã biết đến kỹ thuật tế bào dòng chảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bằng kính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác định dòng tủy tại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện nhi... Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thu nhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y - ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bất thường trong bộ nhiễm sắc thể, xác định tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích ... xét nghiệm nhạy, tăng số lượng tế bào cần quan tâm trong mẫu phẩm hay khẳng định các phát hiện của flow cytometry Phân loại tế bào rất lý tưởng cho việc kiểm tra hình thể tế bào và thực hiện các kỹ thuật phân tử như FISII hay PCR hay xét nghiệm chức năng Sự liên hệ chéo giữa thông tin từ flow cytometry và kết quả các xét nghiệm hậu phân loại tạo thuận lợi cho phân tích tế bào Ngoài ra còn những ứng dụng... đếm CD4 lan rộng trên cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản rẻ tiền hơn thay thế Những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã đóng một vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống rốn, đặc biệt là tế bào trung mô Cùng với sự phát triển của kỹ thuật, công nghệ này càng được đổi mới tiến bộ hơn với những dòng máy từ 4,6 hoặc 8 màu đã ra đời và được các đơn vị