MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT I HOÁ CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, đònh danh vi sinh vật… - Môi trường cần chứa đầy đủ thành phần nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng vi lượng… có điều kiện lý hoá phù hợp I HOÁ CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT Phân loại: * Theo chất - Tự nhiên - Tổng hợp - Bán tổng hợp * Theo trạng thái vật lý - Lỏng (Brothe) - Rắn - Bán lỏng (bán rắn) * Theo mục đích - Môi trường tiền tăng sinh - Môi trường tăng sinh: - Môi trường chọn lọc - Môi trường phân biệt - Môi trường thử nghiệm sinh hóa II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Những điểm cần lưu ý: - Mẫu lấy phải mang tính đại diện - Tránh tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai -Mẫu chưa sử dụng phải bảo quản nhiệt độ -20oC phân tích Mẫu bảo quản đông bảo quản nhiệt độ 0-4.4oC - Mẫu phải xét nghiệm vòng 36h, mẫu đông lạnh cần xét nghiệm vòng h - VSV bò tổn thương, nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng sinh - Cần ghi mẫu II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Kế hoạc lấy mẫu: Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có yếu tố sau: n, c, m, M - Giới hạn vsv, m & M + Chấp nhận (< m) + Ngưỡng lân cận giới hạn (> m < M) + Không chấp nhận (> M); - Số mẫu rơi vào khoảng giới hạn vsv (c) (có nghóa chấp nhận/lân cận/không chấp nhận) II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Kế hoạc lấy mẫu: * Kế hoạch hai thuộc tính - Chỉ nêu m - Nếu tất mẫu m c mẫu số n mẫu thử >m chấp nhận lô hàng, >c mẫu số n mẫu thử >m từ chối lô hàng * Kế hoạch ba thuộc tính - Đặt m M - Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng GMP - Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn ô nhiễm nguy hiểm không chấp nhận - Nếu tất mẫu m c mẫu số n mẫu thử nằm khoảng >m M chấp nhận lô sản phẩm Nếu >c mẫu số n mẫu thử nằm khoảng > m M có mẫu >M từ chối lô sản phẩm II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Kế hoạc lấy mẫu: * Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu - Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không phép có thực phẩm - Nếu cho phép số lượng đònh vsv đơn vò thể tích thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Thu vận chuyển mẫu - Thu nhiều thời điểm vò trí Đối với loại thực phẩm biết nhiễm bề mặt cần dùng que vô trùng quét diện tích bề mặt đònh cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu - Dụng cụ chứa bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ vỡ) - Chú ý nhiệt độ thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm thực phẩm) II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU - Các sản phẩm lạnh đông: Mẫu lau cồn phía bao PE, đặt vào khay tráng men vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên nhiệt độ phòng, giải đông 2-5oC 18 h; 45oC 15 phút cần - Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên xem hộp có bò phồng, biến dạng, bò hở mối ghép hay khôn Lau chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm - Đối với sản phẩm bao bì thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm II KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU Chuẩn bò mẫu phân tích - Đối với sản phẩm đặc hoàn toàn: Cân 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, bỏ vào erlen 150 ml có sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất tiệt trùng Lắc đều, để lắng cặn Hút phần dòch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1 - Đối với sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: cân 10-100 g mẫu (cả lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền Cân 10 g nghiền nát cho vào erlen 250 ml có 90 ml dung dòch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để lắng cặn Hút phần dòch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1 - Đối với sản phẩm lỏng hoàn toàn: Có thể hút trực tiếp mẫu pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn Lắc kỹ Hút 10 ml mẫu cho vào erlen 250 ml có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt khuẩn Ta có độ pha loãng 10-1 - Dung dòch pha loãng: tốt nên dùng nước peptone 0.1%, nước muối sinh lý (0.85%), buffer cần III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.14 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) - Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite sản phẩm khác -Nitrite tạo thành nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide N-napthylethylenediamide hydrochloride pH acid cho phức chất màu hồng - Môi trường: Nitrate Broth, sodium nitrate - Sau phản ứng: thêm thuốc thử vào acid hoá môi trường + xuất màu hồng: + + Không xuất phức màu: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.14 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.15 Thử nghiệm oxidase - Thử nghiệm nhằm xác đònh diện hệ enzym oxydase vi sinh vật -Hoạt tính oxydase phát nhờ thuốc thử pphenylenediamin, có enzym, thuốc thử bò oxy hoá mộït hợp chất indolphenol có màu xanh dương - Môi trường nuôi cấy VSV Nutrien Agar, lấy sinh khối đặt lên giấy lọc có tẩm thuốc thử - Sau thử nghiệm: + Xuất màu xanh dương:+ + Không đổi màu: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.15 Thử nghiệm oxidase III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.16 Thử nghiệm ONPG - Thử nghiệm dùng để xác đònh hoạt tính enzym galactosidase tham gia vào trình lên men lactose vi sinh vật Môi trường thử nghiệm ONPG broth chứa onitrophenyl-D-galactopyranoside Sản phẩm tạo thành onitrophenol có màu vàng - Vi sinh vật: Serratia marcescens (+), Proteus rettgeri (-) - Sau thử nghiệm: + Xuất màu vàng: + + Không xuất màu: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.16 Thử nghiệm ONPG + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.17 Thử nghiệm MR (Methyl Red) - Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào khác biệt trình tạo trì sản phẩm có tính acid từ lên men glucose Vi sinh vật lên men glucose tạo trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử - Chất màu pH môi trường methyl đỏ - Môi trường thử nghiệm: môi trường MR-VP - Sau thử nghiệm: + Môi trường chuyển sang đỏ: + + Môi trường không đổi màu: - Chủng vi sinh vật: Proteus rettgeri (+), Serratia marcescens (-) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.17 Thử nghiệm MR (Methyl Red) _ + + + III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.18 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) - Phản ứng dùng phân biệt loài họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào oxi hoá acetoin tạo từ 2,3-butanediol thành diacetyl Diacetyl xác đònh dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine pepton tạo phức đỏ - Môi trường thử nghiệm: Môi trường MR-VP - Thuốc thử: Barritt, Koblentz… chứa  napthol KOH - Sau thử nghiệm: + Xuất màu đỏ mặt môi trường: + + Bề mặt môi trường không đổi màu: - Vi sinh vật: E coli (-), Enterobacter cloacea (+) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.18 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) 3.1.18 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.19 Thử nghiệm CAMP - Phản ứng nhằm phân biệt nhóm Streptococcus Phản ứng CAMP thực nhân tố CAMP Streptococcus nhóm B tiết -hemolysin tiết Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính -hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết) - Thử nghiệm thực đồi thời chủng Staph aureus chúng thử nghiệm Hai đường cấy vuông góc cách 1-2mm - Môi trường thử nghiệm: Tryptose Blood agar base - Sau thử nghiệm: + Xuất hiệ - n vùng tan huyết: + + Không xuất vùng tan huyết: - Vi sinh vật: Strep agalactiar (-), Strep nhóm B (+) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.19 Thử nghiệm CAMP - + III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.20 Thử nghiệm tính di động [...]... malonate + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1 .6 Thử nghiệm catalase - Dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí - Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2 - Hoá chất: H2O2 30% được giữ lạnh -Nhỏ một giọt sinh khối vi sinh vật lên một giọt H2O2 + Nếu có sự sủi bọt (O2 sinh ra) vi sinh vật hiếu khí Vi dụ: Bacillus, Micrococcus,...III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, vi c đònh danh vi sinh vật được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình và các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật Các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bò tự động Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thò quy... theo vi sinh vật - Dùng để đònh danh các vi sinh vật thuộc hộ Enterobacteriacea (vi sinh vật đường ruột) + E.coli, Klebsiella, Staphylococcus: + + Corynebacterium: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.1 Thử nghiệm khả năng lên men + + - - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.2 Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men (Thử nghiệm Hugh-Leifson) - Thử nghiệm nhằm xác đònh vi sinh vật biến dưỡng carbon hydrat theo con đường... THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.1 Thử nghiệm khả năng lên men - Xác đònh khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất đònh bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men - Sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường làm thay đổi màu môi trường - CO2 tạo ra, được bẫy bằng ống Durham, làm nổi ống - Môi trường sử dụng: + Phenol Red Broth Base: đỏ (pH 7,4)vàng (pH 6, 8): có nguồn Carbon tuỳ theo vi sinh vật - Dùng... nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường có gelatine sau đó bổ sung 510ml trichloacetic acid TCA để là kết tủa gelatine - Sau phản ứng: + Ống nghiệm thạch nghiêng bò tan chảy: + + Không thay đổi trạng thái: - Chủng vi sinh vật: Aeromonas hydrophyla (+), E coli (-) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.10 Thử nghiệm gelatinase + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.11 Thử nghiệm khả năng sinh H2S -Thử nghiệm dùng để xác đònh... Micrococcus, Staphylococcus + Không suất hiện bọt khí, vi sinh vật kỵ khí Ví dụ: Clostridium, Streptococcus III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1 .6 Thử nghiệm catalase - + + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.7 Thử nghiệm decarboxylase - Thử nghiệm dùng để phân loại và đònh danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH môi trường... của vi sinh vật Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amonium - Sản phẩm tạo thành là NH3 làm kiềm hoá môi trườngthay đổi màu của môi trường - Môi trường Simmons citrat agar chứa chỉ thò bromothymol blue, xanh lục (pH trung tính), xanh dương (pH>7 ,6) - Sau phản ứng: + xanh lục: + Xanh dương: + III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate + - III THỬ NGHIỆM SINH. .. methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase -H2S sinh ra sẽ tạo tủa màu đen với chỉ thò sulfide (Fe II, III, amonium sulfat sắt…) chứa trong môi trường -Môi trường thử nghiệm: KIA, TSI, SIM, PIA, BSA -Sau nuôi cấy: + Xuất hiện màu đen trong môi trường: + + Không xuất hiệ màu: - Vi sinh vật: E.coli (+), Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-) III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.11 Thử nghiệm khả năng sinh H2S... được thực hiện với huyết tương thỏ hay người dạng đông khô - Thử nghiệm được tiến hành trên phiến kính hay trong ống nghiệm - Sau phản ứng (khoảng 4 phút): + Xuất hiện đám ngưng kết trong vòng 20 giây: + + Không có phản ứng ngưng kết: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.8 Thử nghiệm coagulase + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.9 Thử nghiệm urease - Thử nghiệm dùng để xác đònh khả năng tạo enzym urease của một số. .. biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thuỷ phân liên kết glucoside trong esculin thành esculentin và glucose - Esculentin phản ứng với muối sắt tạo phức hợp màu nâu hay đen - Môi trường: Aesculin Medium hay Edwards - Sau phản ứng: + hoá nâu hay đen: + + Không đổi màu: - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.3 Thử nghiệm Bile Esculin + - III THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate - Xác đònh