ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN CƯỜNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY THÌA CANH (Gymnema sylvestre) THÔNG QUA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO”” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học: : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm em tiến hành thực đề tài ‘‘ Nghiên cứu nhân giống Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào” Qua thời gian làm việc phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm đến em hoàn thành đề tài Để đạt kết ngày hôm em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Thị Tình, tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Văn Cường DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Thìa Canh (sau 10 ngày nuôi cấy) 30 Bảng 4.2 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới trình nhân nhanh chồi thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt Hình 2.2 Sơ đồ trình phân hoá phản phân hoá tế bào thực vật Hình 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh 31 Hình 4.2 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới trình nhân nhanh chồi Cây thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Hình 4.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Hình 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Hình 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 Hình 4.6 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 41 MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây Thìa Canh 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật học Cây Thìa Canh 2.1.3 Công dụng Cây Thìa Canh 2.1.4.Tình hình nghiên cứu giới 2.1.5 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Tính toàn tế bào thực vật 2.2.3 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 2.2.4 Cơ chế di truyền thông qua hệ tế bào 2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 2.3.2 Khử trùng mẫu cấy khởi động 10 2.3.3 Tạo chồi nhân nhanh 10 2.3.4 Tạo mô hoàn chỉnh 10 2.3.5 Chuyển in vitro vườn ươm 11 2.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.4.1 Nguồn Cacbon 11 2.4.2 Chất khoáng 12 2.4.3 Vitamin 14 2.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 15 2.4.5 Agar 20 2.4.6 pH môi trường 20 2.4.7 Điều kiện vô trùng 20 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.1 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22 3.3 Hóa chất thiết bị 22 3.3.1 Hóa chất 22 3.3.2 Thiết bị 22 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Nội dung nghiên cứu 23 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh 30 4.2 Kết Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới trình nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh 32 4.3 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh 34 4.3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh 34 4.3.2 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 4.4 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) đến khả rễ Cây Thìa Canh 38 4.4.1 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 4.4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy ) 40 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú y học cổ truyền lâu đời Các thuốc thuốc dân gian sử dụng phổ biến nhân dân để phòng, trị bệnh Công dụng loại thảo dược hợp chất chiết xuất từ thảo dược ngày quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, khai thác mức, nạn phá rừng nên nguồn tài nguyên thuốc bị suy giảm nghiêm trọng, nhiều loài loài đứng trước nguy tuyệt chủng Việc gây trồng dược liệu phục vụ cho bảo tồn, khai thác lâu dài nguồn dược liệu việc làm cấp thiết Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) loài thân thảo (Gymnema) họ Apocynaceae, địa rừng nhiệt đới miền nam miền trung Ấn Độ Cây Thìa Canh biết đến sử dụng rộng rãi nhiều nước Ấn độ, Mỹ, Singapore, Nhật Bản, Trung Quốc, Úc,Việt Nam, v.v… [15],[16],[17],[18] gymnemic acid Thìa Canh có tác dụng làm hạ đường huyết, với chế tác dụng xác định tăng tiết insulin tuyến tuỵ, tăng cường hoạt lực insulin, ức chế hấp thu glucose ruột, làm tăng hoạt tính men hấp thu sử dụng đường, giảm cholesterol lipid máu Trong tự nhiên, Cây thìa Canh tái sinh thông qua hạt, đoạn thân tươi Việc gây trồng Thìa Canh tiến hành số nơi thông qua đoạn thân, hạt, nhiên phương pháp nhân giống cho hiệu không cao Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống trồng cho hiệu cao Nhiều loại dược liệu nhân giống thành công thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định ảnh hưởng chất khử trùng tới khả Tạo mẫu sinh chồi Cây Thìa Canh - Xác định ảnh hưởng (BA, kinetin, nước dừa) tới khả nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh - Xác định ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (NAA BA, Kinetin), nước dừa tới khả nhân nhanh Thìa Canh 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Kết nghiên cứu xây dựng quay trình nhân giống Thìa Canh kỹ thuật in vitro - Kết nghiên cứu đạt bổ sung vào quy trình nhân giống danh mục trồng - Giúp sinh viên củng cố hệ thống hoá lại kiến thức học vào nghiên cứu khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống Thìa Canh kỹ thuật in vitro, từ đảm bảo chủ động sản xuất giống với số lượng lớn, bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu giống cho sản xuất, nâng cao hiệu sản xuất phục vụ nhu cầu cung cấp dược liệu sản xuất 38 Từ kết bảng 4.4 hình 4.4 cho thấy: - Với giá trị LSD.05 đạt 0,18 CT3, CT4 có sai khác có ý nghĩa độ tin cậy 95%, hệ số nhân chồi cao CT3 với nồng độ 0,3mg/l đạt 3,5 chồi, CT4 nồng độ 0,5mg/l hệ số nhân chồi tăng lên không đáng kể 2,9 chồi Các CT2 CT5 có sai khác công thức ý nghĩa CT1 (ĐC) cho hệ số nhân chồi đạt 3,0 chồi/mẫu - Kết giải thích sau: BA Kinetine cytokine có tác dụng phân bào, kích thích khả tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động mô phân sinh, hạn chế hóa già tế bào [2],[13] 4.4 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) 4.4.1 K ết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy) - Để cảm ứng tạo rễ, chồi Cây Thìa Canh cao từ 2-3cm chuyển sang môi trường có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin Rễ 100% môi trường có bổ sung than hoạt tính 0,5g/l, có rễ sinh trưởng phát triển tốt.[12] Bảng 4.4.1 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Tổng Số Chiều Nồng độ mẫu Tổng số dài rễ Công thức NAA nuôi cấy (cm) Số rễ/cây Đặc điểm rễ mg/l (rễ) rễ (mẫu) (rễ) CT1 30 84 0,9 2,8 Rễ CT2 0,5 30 90 1,2 3,0 Rễ tốt CT3 1,0 30 105 1,6 3,5 Rễ trung bình CT4 1,5 30 97 1,7 3,2 Rễ trung bình CT5 2,0 30 82 1,9 2,7 Rễ LSD.05 CV% 0,18 4,5 39 Ghi chú: MT = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8 Hình 4.4.1 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy) Từ bảng 4.5 Hình 4.5 cho thấy: Với giá trị LSD.05 đạt 0,18 công thức khác có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Số rễ/cây cao CT3 với nồng độ 1,0mg/l đạt 3,5 rễ cao gấp 1,4 lần so với ĐC Tăng dần nồng độ NAA lên 1,5mg/l (CT4) số rễ/cây giảm dần 3,2 rễ CT5 có sai khác ý nghĩa, với nồng độ cao 2,0mg/l số rễ/cây đạt 2,7 rễ thấp số công thức Như với nồng độ NAA 1,0mg/l số rễ/cây đạt cao 3,5 rễ sử dụng cho nghiên cứu 40 4.4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy ) Bảng 4.4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Thìa Canh (Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy) Công thức Nồng độ Nồng độ NAA (mg/l) IAA (mg/l) Chỉ tiêu theo dõi Tổng Số mẫu Tổng số Chiều Số nuôi cấy rễ dài rễ rễ/cây (mẫu/CT) (rễ) (cm) (rễ) 1,5 3,5 Đặc điểm rễ CT1/ĐC 1,0 30 105 CT2 1,0 0,5 30 127 CT3 1,0 1,0 30 110 CT4 1,0 1,5 30 90 1,9 3,0 Rễ CT5 1,0 2,0 30 82 2,0 2,7 Rễ 1,9 1,8 4,2 3,7 LSD.05 0,18 CV% 4,3 Rễ tốt Rễ trung bình Rễ trung bình Ghi chú: MT = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8 41 Hình 4.4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Thìa Canh(Gymnema sylvestre) (sau 30 ngày nuôi cấy) Từ kết bảng 4.6 hình 4.6 cho thấy: - Với giá trị LSD.05 đạt 0,18, CT2 có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Còn CT4, CT5 có sai khác ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Trong CT2 nồng độ IAA 0,5mg/l cho số rễ/cây cao đạt 4,2 rễ cao 1,1 lần so với ĐC Nồng độ IAA vượt 0,5mg/l, khả rễ giảm xuống rõ rệt Cụ thể CT5 với nồng độ IAA 2,0mg/l, số rễ/cây thấp đạt 2,7 rễ, chất lượng rễ - NAA IAA auxin có tác dụng ảnh hưởng mạnh đến khả trao đổi chất, tăng hô hấp tế bào nuôi cấy mô, tăng hoạt tính enzyme, tăng khả hấp thụ sử dụng đường môi trường, kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào điều khiển hình rễ [2],[13] Khi nồng độ ngưỡng ức chế sinh trưởng tế bào Nguyên nhân ức chế liên quan đến tăng cường mạnh việc tổng hợp xenlulôzơ, pectin làm thành tế bào cứng lại, tăng tổng hợp etylen làm hoocmon có tác động ngược lại với auxin làm giảm phân chia tế bào hình thành rễ - Như số rễ/cây tốt đạt 4,2 rễ kết hợp NAA 1,0 mg/l với IAA 0,5mg/l, chất lượng rễ tốt 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Khử trùng Thìa Canh HgCl2 0,1% phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu sống 78,35% - Môi trường nhân nhanh: - Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung BA với nồng độ 0,5mg/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi cao 3,0 lần, chất lượng chồi trung bình - Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l + NAA 1,0mg/l bổ sung IAA với nồng độ 0,5mg/l, pH: 5,6-5,8 khả rễ tốt với số rễ/cây 4,2, chất lượng rễ tốt 5.2 Kiến nghị - Để hoàn thiện quy trình nhân nhanh Thìa Canh em xin có số kiến nghị sau - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khác chất khử trùng đến hiệu tạo vật liệu Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu (khoai tây, cà rốt, MS, B5, WPM) đến khả tái sinh chồi Thìa Canh 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lương Thúy An (2009), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Asclepiaceae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ – Trung tâm Thông tin thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình Cao học Nông nghiệp xuất Nông nghiệp Hà nội, Hà Nội Trần Hùng (2006), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM, tr 48-50.chế biến bảo quản Trần Công Khánh (2009), “Trồng thuốc thu hái dược liệu hoang dã theo tiêu chuẩn GACP”, tạp chí Dược liệu, tập 14, tr 57-62 Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb Đại học Huế Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương, Đỗ Anh Vũ Cs (2008), Tác dụng hạ đường huyết Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult) Việt Nam, Tạp chí dược học, Số 391, Tr 31-34 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân giống in vitro Sa Nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4A), 689-698 10 Trương Thị Tâm (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học bước đầu thử hoạt tính phân đoạn dịch chiết Dây thìa canh (Gymnema 44 sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ – Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 11 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng (2006), Giáo trình sinh lý thực vật, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội 12 Đỗ Anh Vũ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật tác dụng hạ đường huyết Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ – Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 13 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục 14 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 15 Baskaran et al (1990), “Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin dependent diabetes mellitus patients”, Journal of Ethnopharmacology 30(3), pp 295-300 16 K Grover et al (2002), “Medicinal plants of India with anti-diabetic potential”, Journal of Ethnopharmacology 81, pp 81-100 17 Kapoor LD (1990), “Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants”, Boca Raton, F.L, CRC Press, pp 200-201 18 N Shigematsu et al (2001), “Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R.Br leaves on lipid metabolism in rats”, Biol Pharm Bull 24(6), 713-717 45 Phụ lục 3: Môi trường Table 1: Preparation of modified Murashige ADN Skoog’s MS medium Stock Bottle Component Solution (g/l) I II III preparation (ml) Final concentratic (mg/ l) 82,5 KNO3 95 MgSO4 7H2O 37,0 MgSO4 4H2O 2,23 ZnSO4 7H2O 1,058 CuSO4 5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44,0 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 H3BO3 Na2MoO4.2H2O V take NH4NO3 KH2PO4 IV Amount to 20 0,025 FeSO4 7H2O 2,784 Na2EDTA 2H2O 3,724 1.900,0 370,0 10 10 22,3 10,6 0,83 0,025 17,0 0,62 1.650,0 170,0 10 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 ThiamineHCl 100 0,1 0,1 PyridoxineHCl 100 0,5 0,5 Inositol 100,0 Sucrose 30.000,0 Agar 8.000,0 PH 5,8 46 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ NHÂN GIỐNG CÂY THÌA CANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Chuẩn bị vào mẫu Vào mẫu Tái sinh Ra rễ 47 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Dây Thìa Canh (sau 10 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE MN FILE MSKN 29/ 4/14 18:38 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich HgCl2,NaOCl den hieu qua tao mau sach VARIATE V003 MN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 11740.2 3913.42 ****** 0.000 * RESIDUAL 30.6669 3.83336 * TOTAL (CORRECTED) 11 11770.9 1070.08 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MSKN FILE MSKN 29/ 4/14 18:38 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich HgCl2,NaOCl den hieu qua tao mau sach VARIATE V004 MSKN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5956.25 1985.42 953.01 0.000 * RESIDUAL 16.6665 2.08331 * TOTAL (CORRECTED) 11 5972.92 542.992 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MSKN 29/ 5/14 18:38 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich HgCl2,NaOCl den hieu qua tao mau sach MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 MN 100.000 80.0000 38.3333 22.0000 MSKN 0.000000 20.0000 61.6667 30.0000 SE(N= 3) 1.13039 0.833328 5%LSD 8DF 3.68609 2.71740 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MSKN 29/ 4/14 18:38 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich HgCl2,NaOCl den hieu qua tao mau sach F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 12) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | OBS TOTAL SS RESID SS | MN 12 60.083 32.712 1.9579 3.3 0.0000 MSKN 12 27.917 23.302 1.4434 5.2 0.0000 | | | | 48 4.2 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới trình nhân nhanh chồi thìa Canh BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HHH2 30/ 5/14 16:39 :PAGE Anh huong cua nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi Cay Thia Canh VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 4.83067 1.20767 452.88 0.000 * RESIDUAL 10 266662E-01 266662E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 4.85733 346952 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HHH2 30/ 5/14 16:39 :PAGE Anh huong cua nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi Cay Thia Canh MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS HSN 1.03333 1.23333 1.53333 2.03333 2.60000 SE(N= 3) 0.298140E-01 5%LSD 10DF 0.939449E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HHH2 30/ 5/14 16:39 :PAGE Anh huong cua nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi Cay Thia Canh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 1.6867 0.58903 0.51639E-01 3.1 0.0000 | 49 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA đến hệ số nhân nhanh chồi Dây Thìa Canh BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE CUONG 20/ 4/14 20:31 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh VARIATE V003 HSN LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ========================================================================= ==== CT$ 3.03909 759773 153.18 0.000 * RESIDUAL 10 496002E-01 496002E-02 -* TOTAL (CORRECTED) 14 3.08869 220621 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CUONG 20/ 4/14 20:31 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS HSN 1.55333 1.96667 3 2.15333 2.72000 2.72000 SE(N= 3) 0.406613E-01 5%LSD 10DF 0.128125 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CUONG 20/ 4/14 20:31 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSN GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.2227 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.46970 0.70427E-01 3.2 0.0000 | | | | 50 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin BA đến hệ số nhân nhanh chồi Dây Thìa Canh BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN4 25/ 4/14 23:39 :PAGE Anh huong cua nong Kinetin va BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1.63564 408910 38.46 0.000 * RESIDUAL 10 106333 106333E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 1.74197 124427 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN4 25/ 4/14 23:39 :PAGE Anh huong cua nong Kinetin va BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS HSN 1.94333 2.16333 3 2.56667 2.53333 2.88667 SE(N= 3) 0.595352E-01 5%LSD 10DF 0.187598 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN4 25/ 4/14 23:39 :PAGE Anh huong cua nong Kinetin va BA den he so nhan nhanh choi Day thia Canh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 2.4187 0.35274 0.10312 4.3 0.0000 | 51 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ Dây Thìa Canh BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN5 25/ 4/14 23:51 :PAGE Anh huong cua NAA den kha nang re cua Day thia Canh VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 610667 152667 14.31 0.000 * RESIDUAL 10 106667 106667E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 717333 512381E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN5 25/ 4/14 23:51 :PAGE Anh huong cua NAA den kha nang re cua Day thia Canh MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS HSN 2.06667 2.20000 3 2.60000 2.50000 2.20000 SE(N= 3) 0.596285E-01 5%LSD 10DF 0.187891 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN5 25/ 4/14 23:51 :PAGE Anh huong cua NAA den kha nang re cua Day thia Canh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 2.3133 0.22636 0.10328 4.5 0.0005 | 52 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả rễ Dây Thìa Canh BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN6 25/ 4/14 23:58 :PAGE Anh huong cua nong NAA ket hop voi IAA den kha nang re cua DTC VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1.07624 269060 25.89 0.000 * RESIDUAL 10 103933 103933E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 1.18017 842981E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN6 25/ 4/14 23:58 :PAGE Anh huong cua nong NAA ket hop voi IAA den kha nang re cua DTC MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS HSN 2.60000 2.70000 3 2.40000 2.16667 1.97667 SE(N= 3) 0.588596E-01 5%LSD 10DF 0.185469 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN6 25/ 4/14 23:58 :PAGE Anh huong cua nong NAA ket hop voi IAA den kha nang re cua DTC F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 2.3687 0.29034 0.10195 4.3 0.0000 | [...]... Nguyên và Hà Nội 3.1.1 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu phương pháp tạo vật liệu vô trùng, khả năng tái sinh nhân nhanh và ra rễ Dây Thìa Canh bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật - Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của cây Dây Thìa Canh giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm 3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu - Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa CNSH & CNTP Trường Đại học... khả năng nhân nhanh chồi cây Thìa Canh Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) đến khả năng ra rễ của cây Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với nồng độ IAA đến khả năng ra rễ của cây Thìa Canh 24 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng... hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy (chồi cây Thìa Canh) Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kenetin, nước dừa) tới quá trình nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi cây Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Thìa Canh - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA... thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ: phân hóa tế bào tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa phản phân hóa tế bào Hình 2.2 Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật -... triển của mô, tế bào Để điều chỉnh pH của môi trường người ta thường dùng NaOH 1M, HCl 1M 2.4.7 Điều kiện vô trùng 21 - Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng... thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [14] 2.2.4 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào 9 - Trong... nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể [6] 2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra quan... nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá) 8 - Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác... tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể - Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình... chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ nhiễm sắc thể giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu Như vậy, qua nguyên phân bộ nhiễm sắc thể của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào con Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở kỳ trung gian của quá trình nguyên phân, mỗi phân tử DNA đã thực hiện quá trình sao mã để hình thành hai phân tử DNA giống nhau và giống DNA