i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HỒNG LINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HỒNG LINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học Giảng viên hướng dẫn : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2010 - 2014 : ThS Lương Hùng Tiến : ThS Nguyễn Thị Đoàn Khoa CNSH - CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Trong trình thực đề tài hoàn thiện luận văn giúp đỡ cám ơn trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Linh iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân nhận giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn ThS Lương Hùng Tiến – Khoa CNSH – CNTP, cô giáo hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Đoàn – Khoa CNSH – CNTP, người tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Khoa CNSH – CNTP giúp đỡ thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ bạn nhóm sinh viên thực tập phòng Thí nghiệm vi sinh sinh viên thuộc lớp K42CNSH giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn Khoa CNSH – CNTP cung cấp địa điểm thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Trong trình thực tập xin cảm ơn động viên gia đình bạn bè Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận chia sẻ ý kiến đóng góp quý báu thầy, cô giáo bạn Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Linh v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Hàm lượng chitin vỏ số động vật giáp xác Bảng 2.2: Số nguyên tử bạc đơn vị thể tích 13 Bảng 2.3: Số nguyên tử lượng bề mặt hạt nano bạc 17 Bảng 3.4: Phương pháp phối hợp chitosan - nano bạc 28 Bảng 4.1: Ảnh hưởng nồng độ nano bạc đến hiệu kháng S cerevisiae 31 Bảng 4.2: Ảnh hưởng nồng độ nano bạc đến hiệu kháng Pichia 32 Bảng 4.3: Kết kháng S cerevisiae nồng độ chitosan 34 Bảng 4.4: Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu kháng Pichia 35 Bảng 4.5: Tỷ lệ phức hợp chitosan - bạc với S cerevisiae 36 Bảng 4.6: Kết kháng Pichia phức hợp chitosan - nano bạc 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc hóa học Chitin Hình 2.2: Cấu trúc hóa học Chitosan Hình 2.3: Hiện tượng cộng hưởng plasmon hạt hình cầu 15 Hình 2.4: Ảnh UV-VIS hạt nano bạc 18 Hình 2.5: Nấm men Pichia 21 Hình 2.6 : Nấm men S cerevisiae 22 Hình 3.4: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng VSV nano bạc – chitosan 28 Hình 4.1: Khả kháng S cerevisiae nano bạc 31 Hình 4.2: Khả kháng Pichia nano bạc 32 Hình 4.3: Khả kháng S cerevisiae chitosan 33 Hình 4.4: Khả kháng Pichia chitosan 34 Hình 4.5: Khả kháng S cerevisiae phức chất 36 Hình 4.6: Khả kháng Pichia phức chất 37 Hình 4.7: Khả kháng S cerevisiae chế phẩm kết hợp chitosan – nano bạc 39 Hình 4.8: Khả kháng Pichia chế phẩm kết hợp chitosan – nano bạc 39 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt S cerevisiae E.coli Tên đầy đủ Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli MIC DDA H CFU Ppm SEM Minimal Inhibitory concentrations Degree of deacetylation Giờ Colony Forming Unit Part per million (phần triệu) Scanning Electron Microscopy viii MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Tổng quan chitosan 2.1.1 Nguồn gốc Chitin chitosan 2.1.2 Cấu trúc hóa học chitosan 2.2.3 Tính chất chitosan 2.2.4 Đặc tính kháng vi sinh vật chitosan yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn chitosan 2.1.4 Ứng dụng chitosan 2.2 Giới thiệu chung nano bạc 11 2.2.1 Giới thiệu công nghệ nano 11 2.2.2 Giới thiệu bạc kim loại 12 2.2.3 Giới thiệu hạt nano bạc 14 2.3 Tổng quan nấm men 20 2.3.1 Nấm men Pichia 20 2.3.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 22 2.4 Tình hình nghiên cứu nước nước 23 2.4.1 Tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn chitosan, nano bạc giới 23 2.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 24 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu nghiên cứu 25 3.1.1 Chủng nấm men 25 3.1.2 Môi trường nuôi cấy 25 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 25 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 ix 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26 3.4.2 Phương pháp phân tích 29 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 31 4.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc nấm men 31 4.1.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc S cerevisiae 31 4.1.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc Pichia 32 4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan nấm men 33 4.2.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan S cerevisiae 33 4.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan Pichia 34 4.3 Lựa chọn công thức phối trộn nano bạc với chitosan kháng lại nấm men 35 4.3.1 Xác định khả kháng S cerevisiae phức chất chitosan - nano bạc 35 4.3.2 Xác định khả kháng Pichia phức hợp chitosan - nano bạc 36 4.4 Khả kháng nấm men chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian 38 4.4.1 Khả kháng S cerevisiae chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chitin polysacharid thứ hai sau cellulose tìm thấy tự nhiên Sản phẩm chitin – chitosan có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng thực tế Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo nguyên liệu trung gian cho chất quan trọng chitosan, glucosamin chất có giá trị khác Chitosan có nhiều ứng dụng ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường… Với khả ứng dụng rộng rãi chitin – chitosan mà nhiều nước giới Việt Nam nghiên cứu sản xuất sản phẩm Bạc từ lâu biết tới chất diệt khuẩn hiệu sử dụng để làm dụng cụ sinh hoạt Tuy nhiên, trước đồ dùng bạc không sử dụng rộng rãi giá thành cao Từ công nghệ Nano đời ứng dụng bạc phát triển lên tầm cao Sở dĩ nano bạc nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn bạc kháng sinh tự nhiên không gây tác dụng phụ Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người vật nuôi nhiễm lượng nano bạc nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm) Dạng phân tán với kích thước nanomet khả diệt khuẩn bạc tăng lên gấp bội nhờ diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh Nghiên cứu kích thước nano (từ – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, g bạc Nano sát khuẩn cho hàng trăm m2 chất Điều giúp cho khối lượng bạc sử dụng sản phẩm giảm mạnh nên tỷ trọng bạc giá thành trở nên không đáng kể [3] Với ứng dụng thực tiễn chitosan nano bạc tiến hành nghiên cứu luận văn với tiêu đề: “Nghiên cứu khả kháng nấm men chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc” Kết nghiên cứu đề tài sở liệu cho việc nghiên cứu tạo chế phẩm phối hợp kháng vi sinh vật hoàn thiện chitosan – nano bạc ứng dụng công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm 30 - Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại hai hộp - Mỗi mẫu làm hai độ pha loãng liên tiếp - Đếm tất số khuẩn lạc đĩa Tính kết quả: N= ∑C ( n1 + 0,1 n2 ) f1v (CFU/g/ml ) ∑ C : Tổng số khuẩn lạc đĩa n1 : Số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ n2 : Số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ v: Thể tích nuôi cấy đĩa f1 : Độ pha loãng thứ 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Sử dụng phương pháp bảo quản giống môi trường thạch nghiêng: Vi sinh vật hoạt hóa môi trường Hansen, sau cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24h, 37ºC, giữ tủ lạnh để thực nghiên cứu Cấy chuyền giữ giống thạch nghiêng định kỳ tuần lần 31 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc nấm men 4.1.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc S cerevisiae Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc S cerevisiae, tiến hành thí nghiệm đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml nano bạc nồng độ + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng tạo thành ml ống eppendorf, nuôi 30ºC 24 giờ, sau tiến hành nhỏ dịch đối kháng nồng độ vào đĩa thạch thu kết hình 4.1 bảng 4.1 sau: Không xuất khuẩn lạc Xuất khuẩn lạc Hình 4.1: Khả kháng S cerevisiae nano bạc Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ nano bạc đến hiệu kháng S cerevisiae Nồng độ (ppm) 25 12,5 6,25 - - - 3,125 1,5625 0,781 Đệm MIC + + 6,25 Nấm men S cerevisiae + + Kí hiệu: "+": Xuất khuẩn lạc "-": Không xuất khuẩn lạc Theo kết hình 4.1 cho thấy nồng độ nano bạc 25; 12,5; 6,25 ppm nấm men không phát triển Các nồng độ lại dung dịch đệm nấm 32 men phát triển mạnh ô đĩa thạch Từ bảng 4.1 có MIC nano bạc S cerevisiae 6,25 ppm 4.1.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc Pichia Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc Pichia, tiến hành thí nghiệm đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml nano bạc nồng độ + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng tạo thành ml ống eppendorf, nuôi 30ºC 24 giờ, sau tiến hành nhỏ dịch đối kháng nồng độ vào đĩa thạch thu kết hình 4.2 bảng 4.2 sau: Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.2: Khả kháng Pichia nano bạc Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ nano bạc đến hiệu kháng Pichia Nồng độ MIC (ppm) 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,781 Đệm (ppm) Nấm men Pichia 3,125 + + + Kí hiệu: "+": Xuất khuẩn lạc "-": Không xuất khuẩn lạc Hình 4.2 cho thấy nồng độ 1,2,3,4 tương ứng với 25; 12,5; 6,25; 3,125 ppm không xuất khuẩn lạc Các nồng độ 1,5625; 0,781 ppm tương ứng với ô 5,6 đệm nấm men phát triển mạnh ô đĩa thạch Từ bảng 4.2 có MIC nano bạc Pichia 3,125 ppm 33 4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan nấm men Chitosan hợp chất có khối lượng phân tử lớn, khó tan có độ nhớt cao dẫn đến việc xác định khả kháng khuẩn việc khó khan Vì thực phương pháp xác định khả kháng khuẩn để lựa chọn phương pháp thích hợp kháng S cerevisiae Pichia chế phẩm chitosan Chitosan pha nồng độ khác dung dịch đệm acetat pH = chuẩn đến pH = 6, đối chứng nước cất, đệm acetat pH = Xung quanh chất thử nghiệm hình thành vệt kháng khuẩn chứng tỏ chất có khả kháng chủng vi sinh vật 4.2.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan S cerevisiae Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc S cerevisiae, tiến hành thí nghiệm đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml chitosan nồng độ + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng tạo thành ml ống eppendorf, nuôi 30ºC 24 giờ, sau tiến hành nhỏ dịch đối kháng nồng độ vào đĩa thạch thu kết hình 4.3 bảng 4.3 sau: Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.3: Khả kháng S cerevisiae chitosan 34 Bảng 4.3 Kết kháng S cerevisiae nồng độ chitosan Nồng độ (ppm) 4000 3000 2000 1500 1000 500 250 Đệm MIC Nấm men S cerevisiae + + + 1000 Kí hiệu: "+": Xuất khuẩn lạc "-": Không xuất khuẩn lạc Theo kết hình 4.3 cho thấy nồng độ chitosan 4000; 3000; 2000; 1500; 1000 ppm nấm men không phát triển Các nồng độ lại dung dịch đệm nấm men phát triển mạnh ô đĩa thạch Từ bảng 4.3 có MIC nano bạc S.cerevisiae 1000 ppm Kết cho thấy MIC chitosan với S.cerevisiae 1000 ppm 4.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan Pichia Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc Pichia, tiến hành thí nghiệm đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml chitosan nồng độ + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng tạo thành ml ống eppendorf, nuôi 30ºC 24 giờ, sau tiến hành nhỏ dịch đối kháng nồng độ vào đĩa thạch thu kết hình 4.4 bảng 4.4 sau: Không xuất khuẩn lạc Xuất khuẩn lạc Hình 4.4: Khả kháng Pichia chitosan 35 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu kháng Pichia Nồng độ (ppm) 4000 3000 2000 1500 1000 500 250 Đệm MIC Nấm men Pichia Kí hiệu: - - - - - + + + 1000 "+": Xuất khuẩn lạc "-": Không xuất khuẩn lạc Theo kết hình 4.4 cho thấy nồng độ chitosan 4000; 3000; 2000; 1500; 1000 ppm nấm men không phát triển Các nồng độ lại dung dịch đệm nấm men phát triển mạnh ô đĩa thạch Từ bảng 4.4 có MIC nano bạc S cerevisiae 1000 ppm Kết cho thấy MIC chitosan với S cerevisiae 1000 ppm 4.3 Lựa chọn công thức phối trộn nano bạc với chitosan kháng lại nấm men Sau đánh giá riêng rẽ vật liệu lên nấm men, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phức hợp cách trộn lại với để xác định tỷ lệ phức hợp tốt Phương pháp trộn trình bày phần thí nghiệm mục 3.4 4.3.1 Xác định khả kháng S cerevisiae phức chất chitosan – nano bạc Để dễ hiểu hơn, xin phép nhắc lại MIC hai loại vật liệu S.cerevisiae sau: MIC chitosan: 1000 ppm MIC nano bạc: 6,25 ppm Chúng tiến hành pha dung dịch chitosan nano bạc theo công thức trình bày bảng 3.4, pha đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml dung dịch kết hợp chitosan/nano bạc + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng ml ống eppendorf nồng độ kết hợp thu kết hình 4.5 bảng 4.5 sau: 36 Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.5: Khả kháng S.cerevisiae phức chất Bảng 4.5: Tỷ lệ phức hợp chitosan/nano bạc với S.cerevisiae Tỷ lệ phức hợp chitosan/nano bạc với S.cerevisisae (ppm/ppm) 500/3,125 500/6,25 1000/3,125 1000/6,25 Đệm + + + - Chitosan/nano bạc: 1000/3,125 500/3,125: S.cerevisiae xuất - Chitosan/nano bạc: 1000/6,25 500/6,25: S.cerevisisae không xuất - S.cerevisisae không phát triển nồng độ có MIC nano bạc 6,25ppm Trong S.cerevisisae phát triển nồng độ có MIC chitosan 1000 ppm Qua ta thấy rằng, mức độ kháng S.cerevisisae phụ thuộc nhiều vào thay đổi nồng độ nano bạc thay đổi nồng độ chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng nano bạc mạnh chitosan phức hợp lên S.cerevisisae Vậy tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu nên chọn là: Chitosan: 500 ppm Nano bạc: 3,125 ppm 4.3.2 Xác định khả kháng Pichia phức hợp chitosan/nano bạc Để dễ hiểu hơn, xin phép nhắc lại MIC hai loại vật liệu Pichia sau: 37 MIC chitosan: 1000 ppm MIC nano bạc: 3,125 ppm Chúng tiến hành pha dung dịch chitosan nano bạc theo công thức trình bày bảng 3.4, pha đối kháng gồm 0,5 ml môi trường Hansen + 0,4 ml dung dịch kết hợp chitosan/nano bạc + 0,1 ml vi sinh vật pha loãng ml ống eppendorf nồng độ kết hợp thu kết hình 4.5 bảng 4.5 sau: Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.6: Khả kháng Pichia phức chất Từ hình ảnh (Hình 4.6) mức độ kháng Pichia thống kê theo bảng đây: Bảng 4.6: Kết kháng Pichia phức hợp chitosan/nano bạc Tỷ lệ phức hợp chitosan/nano bạc với Pichia (ppm/ppm) 500/1,5625 500/3,125 1000/1,5625 1000/3,125 Đệm + + Kí hiệu: "+": Xuất khuẩn lạc "-": Không xuất khuẩn lạc - + 38 Theo bảng 3.8 ta có kết sau: - Chitosan/nano bạc: 500/3,125 1000/3,125: Pichia không xuất - Chitosan/nano bạc: 500/1,5625 1000/1,5625: Pichia xuất Pichia không phát triển nồng độ có MIC nano Bạc 3,125ppm Trong Pichia phát triển nồng độ có MIC chitosan 1000 ppm Qua ta thấy rằng, mức độ kháng Pichia phụ thuộc nhiều vào thay đổi nồng độ nano bạc thay đổi nồng độ chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng nano bạc mạnh chitosan phức hợp lên Pichia Điều nguyên nhân sau, chitosan hòa tan hình thành dạng mạch phân tử polyme dung dịch, tạo phức với ion kim loại chuyển tiếp Bạc kim loại chuyển tiếp, hình thành dạng nano hạt ion bạc giải phóng hỗn hợp, phần bị chitosan giữ lấy tạo thành phức chất, nên lượng chitosan dung dịch giảm đáng kể so với nguyên trạng không tác dụng chi phối mức độ kháng khuẩn hỗn hợp Đối với bạc hình thành dạng nano số lượng ion hạt nano lên hàng trăm nghìn, có tham gia liên kết tạo phức chất số lượng lại tác động đến khả sinh trưởng Pichia Vậy tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu nên chọn là: Chitosan: 500 ppm Nano bạc: 1,5625 ppm 4.4 Khả kháng nấm men chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian 4.4.1 Khả kháng S cerevisiae chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian Sau xác định MIC tiến hành thí nghiệm nhằm mục đích khảo sát khả kháng khuẩn theo thời gian chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc Kết sau: 39 Hình 4.7: Khả kháng S cerevisiae chế phẩm kết hợp chitosan/nano bạc Hình 4.7 cho thấy S cerevisiae đối chứng đệm acetat DI số lượng tế bào S cerevisiae phát triển bình thường – 24h đầu, sau chững lại 36h Ở nồng độ chitosan/nano bạc tương ứng 500/6,25 số lượng tế bào S cerevisiae giảm dần theo thời gian bị ức chế sau 10h nuôi cấy 4.4.2 Khả kháng Pichia chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian Sau xác định MIC tiến hành thí nghiệm nhằm mục đích khảo sát khả kháng khuẩn theo thời gian chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc Kết sau: Hình 4.8: Khả kháng Pichia chế phẩm kết hợp chitosan/nano bạc 40 Hình 4.8 cho thấy Pichia đối chứng đệm acetat DI số lượng tế bào Pichia bất ngờ giảm – 8h đầu, sau lại phát triển bình thường đến 36h Ở nồng độ chitosan/nano bạc tương ứng 500/6,25 ppm/ppm số lượng tế bào Pichia giảm dần theo thời gian bị ức chế sau 8h nuôi cấy Hình 4.8 cho thấy Pichia đối chứng đệm acetat DI số lượng tế bào Pichia phát triển tăng lên – 8h đầu, sau chững lại 12h tiếp tục phát triển đến 36h Ở nồng độ chitosan/nano bạc tương ứng 500/3,125 ppm/ppm số lượng tế bào Pichia giảm dần theo thời gian bị ức chế sau 10h nuôi cấy 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Xác định nồng độ ức chế tối thiều nano bạc so với loại nấm men S cerevisiae, Pichia 6,25 ppm 3,125 ppm - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan S cerevisiae Pichia 1000 ppm - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chế phẩm kết hợp chitosan/nano bạc nấm men S cerevisiae 500/6,25 (ppm/ppm) với nấm men Pichia 500/3,125 (ppm/ppm) - Thời gian tiêu diệt hoàn toàn nấm men S cerevisiae phức hợp chitosan nano bạc nồng độ ức chế tối thiểu 500/6,25 (ppm/ppm) sau 10 với nấm men Pichia 500/3,125 (ppm/ppm) sau 10 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu khả kháng khuẩn chế phẩm chitosan, nano bạc không nấm men S cerevisiae, Pichia mà loại vi sinh vật khác 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Kiều Hữu Ảnh, giáo trình VSV học Thực phẩm, NXB giáo dục VN, 2011 Vũ Đình Cự, Nguyễn Xuân Chánh, Công nghệ nano điều khiển đến nguyên tử, phân tử, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, 2004 Nguyễn Hoàng Hải “Các hạt nano kim loại (metallic nanoparticles)” Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Hiền, Lê Thanh Mai cộng sự, 2009, Khoa học - Công nghệ malt Bia, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Trần Thị Luyến, Lê Thanh Long, Nghiên cứu bảo quản trứng gà tươi màng bọc chitosan kết hợp với phụ gia Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản, số 1, Đại học Nha Trang, 2007 Đỗ Thị Thúy Nga, 2011 Qui trình thao tác chuẩn thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh Viện Tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm, M100-S21 Lương Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, NXB khoa học Kỹ thuật Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào, “Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia sản xuất giò lụa, bánh cuốn”, Viện dinh dưỡng, Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam Trần Linh Thước, 2009 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB giáo dục 10 Nguyễn Ngọc Tú (2009), Nghiên cứu gel nước thông minh nhạy pH lai nano bạc, Khóa luận tốt nghiệp đại học quy, Trang 8-9 11 Trang Sĩ Trung, Nghiên cứu tinh chitosan từ phế liệu tôm, Tạp chí Khoa học – Công nghệ thủy sản – số 01/2008 43 Tiếng anh 12 Inui Hiroshi Application Biology Science., 1997; Vol 2, N02, p 55 – 65 13 Mosbay.M., Deral.T Pat N0EP 0356060 A2 900228, 1998, England 14 Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties, The Royal Society & The Royal Academy of Engineering, London (2004) 15 Nikolaj L.Kildeby, Ole z.andersen, Ramus E.roge, Tomlarsen, Rene Petrsen, Jacob F.Riis, Silver Nanopraticle, (2005) 4,14, 15, 16 16 Onishi Hiraku, Machida Yoshiharu et al “Biodegradation and distribution of weter-soluble PDP in mice” C.A, Vol 130, N02, 1999, p.1158(286,935h), Japan 17 R Das, S S Nath, D Chakdar, G Gope, R Bhattacharjee Preparation of Silver Nanoparticles and Their Characterization 18 Schuzczyk Henryk, Pomoell Harri, Wulff Marketta, Saynatjok Elina et al “Chitosan-based pharmaceuticals for reduction of cholesterol and lipid contents” C.A, Vol 132, N023, 2000, p.1170(313724P, Finland) 19 Shigehiro Hirano, Haruyoshi Seino, Yasutoshi Akiyama and Isao Nonaka “Progress in Biomedical Polymers” New York, 1990, p 283-290 20 Singh Dinesh.K., Ray Alok.R., Macromol.J “Biomedical Applications of Chitin, Chitosan and their derivatives”.Science., Res Macromol Chemistry Physical.2000, C40 (1), page 69-83 21 Weast, R.C, J.A Spadaro, R.O.Becker, et al, ”Handbook of Chemistry and Physics”, 69th edu CRC press, Inc, Boca Raton, FL, 1988-1989, pp.1-128 22 Yao Kangde, Yin Yuji, Cheng Guoxian, Zhou Jun “Biomedical developments in Chitosan-based polymers” C.A, Vol 130, N013, 1999, p 1052(172813, China) PHỤ LỤC Bảng 4.4: Khả kháng Pichia chế phẩm kết hợp chitosan/nano bạc Nồng độ (ppm) Thời gian (h) 12 16 20 24 36 500/3,125 Đối chứng 7,09±0,03 2,82±0,03 0 0 0 7,09±0,03 7,19±0,03 7,46±0,03 7,42±0,03 7,54±0,03 7,61±0,03 8,17±0,03 8,25±0,03 Bảng 4.5: Khả kháng S.cerevisiae chế phẩm kết hợp chitosan/nano bạc Nồng độ (ppm) Thời gian (h) 12 16 20 24 36 500/6,25 Đối chứng 7,12±0,03 3,41±0,03 0 0 0 7,12±0,03 7,49±0,03 8,16±0,03 7,42±0,03 8,57±0,03 8,60±0,03 8,71±0,03 8,74±0,03 [...]... Mục đích nghiên cứu - Đưa ra phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc đối với nấm men - Đánh giá được khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan – nano bạc theo thời gian 1.3 Yêu cầu - Xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc 1.4... tính kháng vi sinh vật của chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của chitosan 2.2.4.1 Đặc tính kháng vi sinh vật - Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật [16]: a Khả năng kháng virus, kháng nấm Khả năng kháng virus: - Chitosan ức chế hệ thống sinh sản của virus thực vật đã được nghiên cứu. .. gian nghiên cứu - Địa điểm: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian: Từ 07/12/2013 đến 01/06/2014 3.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc với nấm men - Nội dung 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan với nấm men - Nội dung 3: Nghiên cứu lựa chọn nồng độ kết hợp chitosan với nano bạc kháng nấm men - Nội dung 4: Theo dõi theo thời gian khả năng. .. phân tử của chitosan, có nhiều nghiên cứu kết luận rằng chitosan có khả năng kháng lại virus khoai tây, thuốc lá, dưa chuột,… [16] Khả năng kháng nấm: - Hoạt tính kháng nấm của chitosan được chứng minh qua các nghiên cứu với nhiều loại nấm khác nhau: Saccharomycodes ludwigii, Pseudomonas fragi, Candida, Zygosaccharomyces bailii, Pyricularia grisea,… Sự ức chế và làm ngưng hoạt động của nấm men, nấm mốc... Theo dõi theo thời gian khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan - nano bạc 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với nấm men Nồng độ ức chế tối thiểu (The Minimal Inhibitory Concentration – MIC) là nồng độ thấp nhất chất kháng khuẩn mà sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật có thể quan sát... Nồng độ chitosan sau khi trộn được tính lại là 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 250 ppm Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc a) Phương pháp phối trộn nano bạc và chitosan Nano Bạc: Sử dụng 0,2 ml dung dịch nano bạc, tính toán để nồng độ nano bạc trong hỗn hợp = ... phối hợp chitosan – nano bạc 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Đưa ra cơ chế kháng nấm men của chitosan, nano bạc - Đưa ra nồng độ tối thiểu của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc để ức chế nấm men - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học, sinh viên sẽ có những... (FBC) Khả năng kết hợp với nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin Thông thường, khả năng hấp thụ nước của chitosan khoảng 581 – 1150% (trung bình là 702%) phụ thuộc vào từng sản phẩm Quá trình sản xuất chitosan có nhiều giai đoạn, thay đổi thứ tự sản xuất cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng giữ nước và giữ chất béo [18] Khả năng kết hợp với chất béo của các chế phẩm chitosan. .. Khả năng gây hỏng thực phẩm của S cerevisiae Tồn tại trong những thực phẩm chứa nhiều đường vè gây hư hỏng thực phẩm [7] 2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 2.4.1 Tình hình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan, nano bạc trên thế giới Chitosan đã được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật Bản và Hàn Quốc lần lượt từ năm 1983 và 1995 Chính hoạt động ức chế vi sinh vật cao của. .. động ức chế vi sinh vật cao của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự nhiên Chitosan – nano bạc (CS/Ag-NPs) được nghiên cứu ứng dụng trong việc kháng khuẩn trong dung dịch nhờ đặc tính kháng khuẩn của nano bạc Khả năng kháng khuẩn của vật liệu trên đã được khảo sát với một số vi khuẩn như