1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG Tên đề tài: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học : Chính quy : Công nghệ Sinh học : CNSH - CNTP : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG Tên đề tài: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: TS Dương Văn Cường Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nhận quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy cô bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, kĩ sư Ma Thị Trang cán Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên người tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực để tài trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,ngày 02 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hường DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Danh sách vùng trồng diện tích vanillin chủ yếu giới Bảng 2: Thành phần tính chất dược liệu vanillin 12 Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất sản lượng vanillin .14 Bảng 4: Tiền chất vi sinh vật chủ yếu để tổng hợp vanillin vanillin từ axit ferulic chu trình TCA đường Glyoxylate 25 Bảng 5: Cặp mồi sử dụng nhân gene gltA 31 Bảng 6: Các thành phần vector pTZ57R/T .34 Bảng 7: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 35 Bảng 8: Thành phần phản ứng PCR 40 Bảng 9: Thành phần phản ứng gắn nối .43 Bảng 10: Thành phần phản ứng cắt với NcoI 45 Bảng 11: Thành phần phản ứng cắt với SacI HindIII 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình dạng đặc điểm ba loài hoa Vanilla Hình 2: Loài ong địa phương Melapona loài chim giúp thụ phấn hoa Hình : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia .7 Hình 4: Các đường trao đổi chất sinh tổng hợp vanillin 21 Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs ech 24 Hình 6: Sơ đồ biểu diễn tái chế coenzym A (CoA) từ acetyl-CoA sản xuất Hình 7: Cấu trúc vector tách dòng 33 Hình 8: Quy trình tách dòng xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E coli 37 Hình 9: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 40 Hình 10: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số E coli 47 Hình 11: Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR .48 Hình 12: Sản phẩm PCR trước sau tinh 49 Hình 13: Kết biến nạp vi khuẩn đối chứng 49 Hình 14: Kết biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào E coli DH5α khả biến 50 Hình 15: Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn 50 Hình 16: Sản phẩm PCR plasmid dòng khuẩn lạc .51 Hình 17: Kết điện di sản phẩm cắt enzyme NcoI 52 Hình 18: Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme SacI HindIII .53 Hình 19: Kết so sánh trình tự gene dòng 55 Hình 20: Kết giải trình tự gene hiển thị máy tính dòng 56 Hình 21: Trình tự nucleotide gene gltA tách dòng 57 Hình 22: Kết dịch mã gene gltA 58 Hình 23: Kết so sánh trình tự gene gltA tách dòng với trình tự gene công bố ngân hàng gene .60 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin Bp Base pair – cặp base nitơ BLAST Basic Local Aligenment Search Tool cDNA Complementary DNA - DNA bổ sung CoA Coenzyme Acetoacetyl DNA Deoxyribonucleic axit dNTP Deoxynucleotide Triphotphate E coli Escherichia coli Et al Cộng IPTG Isopropyl Thiogalactoside Kb Kilo base –kilo base nitơ LB Lauria Broth S cerevisiae Saccharamyces cerevisiae SDS Sodium Dodecyl Sulfate V planifolia Vanilla planifolia PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp TAE Tris- acetate- EDTA TE Tris- EDTA X -gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc thực vật vanilla 2.2 Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia 2.3 Đặc điểm cấu trúc, thành phần vanillin 2.4 Hoạt tính sinh học tác dụng vanillin 2.4.1 Hoạt tính sinh học vanillin 2.4.2 Tác dụng vanillin 11 2.5 Các phương pháp sản xuất vanillin 13 2.5.1 Vanillin chiết suất từ tự nhiên 13 2.5.2 Vanillin tổng hợp hóa học .14 2.5.3 Vanillin tổng hợp sinh học 16 2.5.3.1 Phương pháp sử dụng enzyme .16 2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 17 2.5.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học tổng hợp vanillin 18 2.6 Vi khuẩn E coli gene gltA sinh tổng hợp vanillin .23 2.6.1 Vi khuẩn E coli .23 2.6.2 Vai trò gene gltA sinh tổng hợp vanillin 24 2.7 Tình hình nghiên cứu nước 26 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 28 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Vật liệu nghiên cứu 30 3.1.1 Vi khuẩn 30 3.1.2 Hóa chất 30 3.1.3 Vật liệu 31 3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR .31 3.1.3.2 Vector tách dòng 32 3.1.4 Thiết bị 35 3.2 Địa điểm thời gian thực tập 35 3.3 Nội dung nghiên cứu 36 3.4 Phương pháp nghiên cứu 37 3.4.1 Quy trình tách dòng xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E.coli 37 3.4.2 Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 38 3.4.3 Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn .38 3.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 38 3.4.5 Phương pháp PCR 39 3.4.6 Điện di .40 3.4.7 Tinh sản phẩm PCR thu nhận lại DNA từ gel 41 3.4.8 Phản ứng gắn nối trình tự gene khuếch đại vào vetor tách dòng pTZ57R/T 42 3.4.9 Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả biến sốc nhiệt .43 3.4.10 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 44 3.4.11 Phương pháp cắt kiểm tra dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt giới hạn .45 3.4.12 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 46 3.4.13 Phương pháp so sánh trình tự gene gltA tách dòng với trình tự công bố ngân hàng gene giới 46 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E coli 47 4.2 Kết nhân gene gltA từ vi khuẩn E coli DH5α phương pháp PCR 47 4.3 Kết tinh sản phẩm PCR từ gel điện di 48 4.4 Kết biến nạp sản phẩm gắn nối 49 4.5 Kết chọn lọc dòng vi khuẩn .50 4.5.1 Kết sàng lọc dòng điện di so sánh kích thước plasmid 50 4.5.2 Kết chọn lọc dòng PCR 51 4.5.3 Kết chọn lọc dòng plasmid lập đồ giới hạn 52 4.5.3.1 Kết cắt kiểm tra độc lập enzyme NcoI 52 4.5.3.2 Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme SacI HindIII .53 4.6 Kết giải trình tự gene 54 4.6.1 Kết so sánh trình tự gene dòng giải trình tự 54 4.6.2 Kết phân tích thành phần thiết yếu gene theo thiết kế insilico 56 4.6.3 Kết dịch mã gene gltA 58 58 4.6.4 Kết so sánh trình tự gene xác định với trình tự gene công bố ngân hàng gene 58 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) hợp chất thơm quan trọng sử dụng nhiều ngành thực phẩm, mĩ phẩm, dược phẩm (Ranadive 1994)…Sản lượng tiêu thụ ước tính toàn giới hàng năm 12.000 (Lee, Yoon et al 2009) Vanillin tự nhiên, chiết xuất từ loài lan có tên khoa học Vanilla planifolia đáp ứng khoảng 1% nhu cầu thương mại, lại chủ yếu vanillin tổng hợp hóa học nhân tạo (Li and Rosazza 2000) Trên thực tế, giá thành kg vanillin tự nhiên dao động khoảng 1200 – 4000 USD, giá kg vanillin nhân tạo khoảng 15 USD (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Tuy nhiên, theo quy định Mỹ châu Âu vanillin tổng hợp hóa học không coi tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim and Lerch 1999) Do mà vanillin cung cấp cách chiết xuất từ vanilla tự nhiên hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học nghiên cứu trình thay (Krings and Berger 1998) Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp sản phẩm vanillin tự nhiên thay quan tâm ngày tăng năm gần (LesageMeessen, Stentelaire et al 1999) Hơn nữa, trình sản xuất vanillin sinh học cho chi phí rẻ tận dụng phế phụ phẩm sẵn có rẻ tiền, tạo sản phẩm phụ không mong muốn chủ yếu thực điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, nguy hiểm, sử dụng lượng gây ô nhiễm môi trường (Dal Bello 2013) Nghiên cứu sinh tổng hợp vanillin sử dụng vi sinh vật enzyme chuyển hóa tiền chất glucose, ligin, isoeugenol, eugenol, axit ferulic… thực công bố (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Trong biến đổi sinh học để tạo vanillin từ axit ferulic ý quan tâm nghiên cứu Một số vi sinh vật, chẳng hạn chủng Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert et al 2000), Bacillus subtilis (Peng, Misawa et al 2003), Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al 2003), Delftia acidovorans (Plaggenborg, Steinbuchel et al 2001), Sphingomonas (Masai, Harada et al 2002), Streptomyces setonii (Muheim and Lerch 1999)… dùng để sản xuất vanillin từ axit ferulic Tuy nhiên, vanillin sản xuất từ sinh vật cho suất thấp 55 Hình 19: Kết so sánh trình tự gene dòng Kết so sánh cho thấy, trình tự gene dòng tách chiết có chiều dài 1395 pb, trình tự gene dòng Kit1 Kit4 cho kết giống nhau, trình tự gene dòng Kit3 có sai khác nucleotide so với dòng Kit1 dòng Kit4 (sự sai khác hiển thị qua màu xanh hình 19) Dựa vào kết này, dòng Kit1 dòng Kit4 sử dụng thí nghiệm tiếp sau 56 Phân tích kết hiển thị máy tính cho thấy tín hiệu dòng cho kết mạnh hơn, so sánh sử dụng trình tự gene dòng Kit1 để so sánh với trình tự gene công bố ngân hàng gene Trình tự gene giải trình tự với mồi ngược dòng hiển thị hình bên dưới: Hình 20: Kết giải trình tự gene hiển thị máy tính dòng Kit1 Kết hiển thị cho thấy việc giải trình tự cho tín hiệu mạnh xác khoảng 600 -700 nucleotide đầu tiên, sau tín hiệu thấp cho kết không xác, giải trình tự gene có kích thước lớn kb cần sử dụng hai mồi để kết xác 4.6.2 Kết phân tích thành phần thiết yếu gene theo thiết kế in silico Để khẳng định 100% đoạn xen thiết kế gắn vào vector pTZ57R/T tái tổ hợp gene gltA kiểm tra xem trình tự có gặp phải đột biến nghiêm trọng hay không Chúng tiến hành xác định trình tự gene Kết giải trình tự dòng trình bày hình sau: 57 CGATGCATCTAGATTTGAGCTCAGAAGGAGATATACATATGGCTGATACAAA AGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTGCTGAAA GGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTG TGTTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAAT TACTTTTATTGATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATC GATCAGCTGGCGACCGATTCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGA ATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAGTATGACGAATTTAAAACTACGGTGAC CCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGTCTGTTCCATGCTTTCCGT CGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGCGCGCTGGCGG CGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATTGC CGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAG TATTCCATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCG GTAACTTCCTGAATATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAA TCCGATTCTGGAACGTGCTATGGACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCAT GAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGTACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGA ACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTGTGGGGACCTGCGCA CGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGCTCCGTT AAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCC GCCTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCAC CGTAATGCGTGAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGAT GACCTGCTGGAAGTGGCTATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGT ACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCGAACGTCGATTTCTACTCTGGTATCAT CCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATG GCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTA TGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTT TAAAAGCGATATCAAGCGTTAAAAGCTTTAATCGGATCCCGGGCCCGTCGAC TGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATATTTCGTTTC GCTATAGTTCGCAATTTTCGAA Hình 21: Trình tự nucleotide gene gltA tách dòng Kết giải trình tự gene gltA hình cho thấy, ba mở đầu ATG ba kết thúc ATT bảo toàn, vị trí cắt enzyme cắt giới hạn SacI HindIII trình tự Shine Dalgarno thiết kế mồi vị trí sai khác Như vậy, thành phần thiết yếu gene theo thiết kế in silico giữ nguyên, đảm bảo độ xác để tiến hành nghiên cứu gắn nối vào vector biểu theo mục đích thiết kế 58 4.6.3 Kết dịch mã gene gltA Hình 22: Kết dịch mã gene gltA Kết dịch mã đoạn gene giải trình tự không xuất stop codon vô nghĩa nào, dịch mã đầy đủ toàn đoạn gene, đảm bảo biểu gene thể sinh vật 4.6.4 K ết so sánh trình tự gene xác định với trình tự gene công bố ngân hàng gene NCBI (Gene Bank) Để khẳng định trình tự gene gltA tách dòng không gặp phải đột biến nghiêm trọng sai khác nucleotide cần tiến hành so sánh với trình tự gene gltA gốc phân lập từ E coli DH5α Tuy nhiên, gene gltA E coli DH5α chưa giải trình tự gene nên so sánh với trình tự gene phân lập từ vi khuẩn Escherichia coli sp K-12 MC4100 công bố ngân hàng gene với mã số HG7388671 Kết so sánh sử dụng phần mềm Blastn cho kết sau: 59 Strand Score Expect Identities Gaps 2372 bits(1284) 0.0 1284/1284(100%) 0/1284(0%) Plus/Minus Query 39 ATGGCTGATACAAAAGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTG 98 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656451 ATGGCTGATACAAAAGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTG 656392 Query 99 CTGAAAGGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTGTG 158 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656391 CTGAAAGGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTGTG 656332 Query 159 TTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAATTACTTTTATT 218 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656331 TTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAATTACTTTTATT 656272 Query 219 GATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATCGATCAGCTGGCGACCGAT 278 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656271 GATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATCGATCAGCTGGCGACCGAT 656212 Query 279 TCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGAATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAG 338 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656211 TCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGAATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAG 656152 Query 339 TATGACGAATTTAAAACTACGGTGACCCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGT 398 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656151 TATGACGAATTTAAAACTACGGTGACCCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGT 656092 Query 399 CTGTTCCATGCTTTCCGTCGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGC 458 Sbjct 656091 CTGTTCCATGCTTTCCGTCGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGC 656032 Query 459 GCGCTGGCGGCGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATT 518 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 656031 GCGCTGGCGGCGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATT 655972 Query 519 GCCGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAGTATTCC 578 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655971 GCCGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAGTATTCC 655912 Query 579 ATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCGGTAACTTCCTGAAT 638 Sbjct 655911 ATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCGGTAACTTCCTGAAT 655852 Query 639 ATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAATCCGATTCTGGAACGTGCTATG 698 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655851 ATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAATCCGATTCTGGAACGTGCTATG 655792 Query 699 GACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCATGAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGT 758 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655791 GACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCATGAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGT 655732 Query 759 ACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGAACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTG 818 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655731 ACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGAACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTG 655672 60 Query 819 TGGGGACCTGCGCACGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGC 878 Sbjct 655671 TGGGGACCTGCGCACGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGC 655612 Query 879 TCCGTTAAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCCGC 938 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655611 TCCGTTAAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCCGC 655552 Query 939 CTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCACCGTAATGCGT 998 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655551 CTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCACCGTAATGCGT 655492 Query 999 GAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGATGACCTGCTGGAAGTGGCT 1058 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655491 GAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGATGACCTGCTGGAAGTGGCT 655432 Query 1059 ATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGTACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCG 1118 Sbjct 655431 ATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGTACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCG 655372 Query 1119 AACGTCGATTTCTACTCTGGTATCATCCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTC 1178 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655371 AACGTCGATTTCTACTCTGGTATCATCCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTC 655312 Query 1179 ACCGTCATTTTCGCAATGGCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCAC 1238 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 655311 ACCGTCATTTTCGCAATGGCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCAC 655252 Query 1239 AGTGACGGTATGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGAC 1298 Sbjct 655251 AGTGACGGTATGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGAC Query 1299 TTTAAAAGCGATATCAAGCGTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 655192 1322 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 655191 TTTAAAAGCGATATCAAGCGTTAA 65516 Hình 23: Kết so sánh trình tự gene gltA tách dòng với trình tự gene công bố ngân hàng gene Kết so sánh cho thấy, hai gene có kích thước với độ tương đồng 100 %, sai khác nucleotide (Indentities = 1248/ 1248 (100%)) Trình tự gene tách dòng không xảy biến đổi di truyền, đột biển điểm so với trình tự công bố (Graps =0/ 1284 (0%)) Như vậy, tách dòng thành công xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E coli 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập thành công gene gltA có kích thước 1284 bp phương pháp PCR từ vi khuẩn E coli - Đã tách dòng thành công gene gltA thông qua vector tách dòng pTZ57R/T, biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến - Đã xác định trình tự gene gltA tách dòng so sánh trình tự gene với trình gene gltA phân lập từ Escherichia coli str K-12 chủng MC4100 công bố ngân hàng gene NCBI với mã số HG7388671 Với mật độ tương đồng đạt 100% vị trí thiết kế bảo toàn, kết luận tách nhân dòng gene gltA từ hệ gene vi khuẩn E coli thành công 5.2 Kiến nghị Với dòng gene gltA tạo được, với gene khác đường sinh tổng hợp vanillin gene fcs ech Tiến hành nghiên cứu nhằm thiết kế thành công vector biểu hiện, tạo sở thiết kế chủng vi sinh vật có khả sản xuất vanillin có suất cao, mà trước mắt tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả sản xuất vanillin 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abraham, D J., A S Mehanna, F C Wireko, J Whitney, R P Thomas and E P Orringer (1991) "Vanillin, a potential agent for the treatment of sickle cell anemia." Blood 77(6): 1334-1341 Achterholt, S., H Priefert and A Steinbüchel (2000) "Identification of Amycolatopsis sp strain HR167 genes, involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin." Appl Microbiol Biotechnol 54(6): 799-807 Akagi K.,Hirose M., Hoshiya T.,Mizoguchi Y, Ito N., Shirai T (1995) "Modulating effects of ellagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term multi-organ carcinogenesis model." Cancer Lett 94(1): 113-121 Anuradha, K., Shyamala, B N., & Naidu, M M (2013) "Vanilla its science of cultivation, curing, chemistry, and nutraceutical properties." Crit Rev Food Sci Nutr 53(12): 1250-1276 Anuradha, BN Shyamala (2013) "Vanilla-Its Science of Cultivation, Curing, Chemistry, and Nutraceutical Properties." Critical Reviews in Food Science and Nutrition 53(12): 1250-1276 Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2011) "Candida galli strain PGO6: a novel isolated yeast strain capable of transformation of isoeugenol into vanillin and vanillic acid." Curr Microbiol 62(3): 990-998 Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2012) "Conversion of isoeugenol to vanillin by Psychrobacter sp strain CSW4." Applied Biochemistry and Biotechnology 166(1): 1-12 Barghini, P., Di Gioia, D., Fava, F., & Ruzzi, M (2007) "Vanillin production using metabolically engineered Escherichia coli under non-growing conditions." Microb Cell Fact 6: 13 Bloem, A., Bertrand, A., Lonvaud‐Funel, A., & De Revel, G (2007) "Vanillin production from simple phenols by wine-associated lactic acid bacteria." Lett Appl Microbiol 44(1): 62-67 10 Brochado, A R., Matos, C., Møller, B L., Hansen, J., Mortensen, U H., & Patil, K R (2010) "Improved vanillin production in baker's yeast through in silico design." Microb Cell Fact 9: 84 11 Brunati, M., Marinelli, F., Bertolini, C., Gandolfi, R., Daffonchio, D., & Molinari, F (2004) "Biotransformations of cinnamic and ferulic acid with actinomycetes." Enzyme and Microbial Technology 34(1): 3-9 63 12 Burri, J., Graf, M., Lambelet, P., & Löliger, J (1989) "Vanillin: More than a flavouring agent—a potent antioxidant." Journal of the Science of Food and Agriculture 48(1): 49-56 13 Calisti, C., Ficca, A G., Barghini, P., & Ruzzi, M (2008) "Regulation of ferulic catabolic genes in Pseudomonas fluorescens BF13: involvement of a MarR family regulator." Appl Microbiol Biotechnol 80(3): 475-483 14 Cerrutti, P., Alzamora, S.M., and Vidales, S.L (1997) "Vanillin as an Antimicrobial for Producing Shelf-stable Strawberry Puree." Journal of Food Science 62(3): 608-610 15 Converti, A., Aliakbarian, B., Domínguez, J M., Vázquez, G B., & Perego, P (2010) "Microbial production of biovanillin." Brazilian Journal of Microbiology 41(3): 519-530 16 Converti, A.; De Faveri, D.; Perego, P.; Barghini, P.; Ruzzi, M.; Sene L (2003) "Vanillin production by recombinant strains of Escherichia coli." Brazilian Journal of Microbiology 34: 108-110 17 Dal Bello, E (2013) "Vanillin production from ferulic acid with Pseudomonas fluorescens BF13-1p4." 18 Di Gioia, D., Luziatelli, F., Negroni, A., Ficca, A G., Fava, F., & Ruzzi, M (2011) "Metabolic engineering of Pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from ferulic acid." J Biotechnol 156(4): 309-316 19 Dignum M, Kerler J, Verpoorte R (2001) "beta-Glucosidase and peroxidase stability in crude enzyme extracts from green beans of Vanilla planifolia Andrews." Phytochem Anal 12(3): 174-179 20 Dignum, M J., Kerler, J., & Verpoorte, R (2002) "Vanilla curing under laboratory conditions." Food Chemistry 79(2): 165-171 21 Durant, S and P Karran (2003) "Vanillins a novel family of DNA-PK inhibitors." Nucleic Acids Res 31(19): 5501-5512 22 Fitzgerald, D J., Stratford, M., Gasson, M J., Ueckert, J., Bos, A., & Narbad (2004) "The potential application of vanillin in preventing yeast spoilage of soft drinks and fruit juices." J Food Prot 67(2): 391-395.Fitzgerald, D J., et al (2005) "Structure-function analysis of the vanillin molecule and its antifungal properties." J Agric Food Chem 53(5): 1769-1775.Frost, J W (2000) Synthesis of vanillin from a carbon source, Google Patents 23 Furukawa, H., Morita, H., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2003) "Conversion of isoeugenol into vanillic acid byPseudomonas putida I58 cells exhibiting high 64 isoeugenol-degrading activity." Journal of Bioscience and Bioengineering 96(4): 401-403 24 Gustafson DL, Franz HR, Ueno AM, Smith CJ, Doolittle DJ, Waldren CA (2000) "Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by hydrogen peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine and mitomycin C but not (137)Cs gamma-radiation at the CD59 locus in human-hamster hybrid A(L) cells." Mutagenesis 15(3): 207-213 25 Hammel, K E., Jensen, K A., Mozuch, M D., Landucci, L L., Tien, M., & Pease, E A (1993) "Ligninolysis by a purified lignin peroxidase." J Biol Chem 268(17): 12274-12281 26 Hansen, E H., Møller, B L., Kock, G R., Bünner, C M., Kristensen, C., Jensen, O R., & Hansen, J (2009) "De novo biosynthesis of vanillin in fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) and baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae)." Appl Environ Microbiol 75(9): 2765-2774 27 Havkin-Frenkel, D and F Belanger (2007) Application of Metabolic Engineering to Vanillin Biosynthetic Pathways in Vanilla Planifolia Applications of Plant Metabolic Engineering R Verpoorte, A W Alfermann and T S Johnson, Springer Netherlands: 175-196 28 Ho, K., Yazan, L S., Ismail, N., & Ismail, M (2009) "Apoptosis and cell cycle arrest of human colorectal cancer cell line HT-29 induced by vanillin." Cancer Epidemiology 33(2): 155-160 29 Hocking, M B (1997) "Vanillin: Synthetic Flavoring from Spent Sulfite Liquor." Journal of Chemical Education 74(9): 1055 30 Hrazdina, G (2006) "Aroma production by tissue cultures." J Agric Food Chem 54(4): 1116-1123 31 Hua D, Ma C, Lin S, Song L, Deng Z, Maomy Z, Zhang Z, Yu B, Xu P (2007) "Biotransformation of isoeugenol to vanillin by a newly isolated Bacillus pumilus strain: identification of major metabolites." J Biotechnol 130(4): 463-470 32 Hua D, Ma C, Lin S, Song L, Deng Z, Maomy Z, Zhang Z (2007) "Enhanced vanillin production from ferulic acid using adsorbent resin." Appl Microbiol Biotechnol 74(4): 783-790 33 Imanishi, H., Sasaki, Y., Matsumoto, K., Watanabe, M., Ohta, T., Shirasu, Y., & Tutikawa, K (1990) "Suppression of 6-TG-resistant mutations in V79 cells and recessive spot formations in mice by vanillin." Mutat Res 243(2): 151-158 65 34 Kasana, R C., Sharma, U K., Sharma, N., & Sinha, A K (2007) "Isolation and identification of a novel strain of Pseudomonas chlororaphis capable of transforming isoeugenol to vanillin." Curr Microbiol 54(6): 457-461 35 Kaur, B and D Chakraborty (2013) "Biotechnological and Molecular Approaches for Vanillin Production: a Review." Applied Biochemistry and Biotechnology 169(4): 1353-1372 36 Kaur, B and D Chakraborty (2013) "Biotechnological and molecular approaches for vanillin production: a review." Applied Biochemistry and Biotechnology 169(4): 1353-1372 37 Keshava, C., Keshava, N., Ong, T M., & Nath, J (1998) "Protective effect of vanillin on radiation-induced micronuclei and chromosomal aberrations in V79 cells." Mutat Res 397(2): 149-159 38 Knuth, M E., & Sahai, O P (1991) Flavor composition and method, Google Patents 39 Krings, U., & Berger, R G (1998) "Biotechnological production of flavours and fragrances." Appl Microbiol Biotechnol 49(1): 1-8 40 Kumar, S S., Priyadarsini, K I., & Sainis, K B (2003) "Inhibition of PeroxynitriteMediated Reactions by Vanillin." J Agric Food Chem 52(1): 139-145 41 Lee, E G., Yoon, S H., Das, A., Lee, S H., Li, C., Kim, J Y., & Kim, S W (2009) "Directing vanillin production from ferulic acid by increased acetyl-CoA consumption in recombinant Escherichia coli." Biotechnol Bioeng 102(1): 200-208 42 Lesage-Meessen, L., Lomascolo, A., Bonnin, E., Thibault, J F., Buleon, A., Roller, M., & Asther, M (2002) "A biotechnological process involving filamentous fungi to produce natural crystalline vanillin from maize bran." Applied Biochemistry and Biotechnology 102-103(1-6): 141-153 43 Lesage‐Meessen, L., Stentelaire, C., Lomascolo, A., Couteau, D., Asther, M., Moukha, S., & Asther, M (1999) "Fungal transformation of ferulic acid from sugar beet pulp to natural vanillin." Journal of the Science of Food and Agriculture 79(3): 487-490 44 Li, T., & Rosazza, J P (2000) "Biocatalytic synthesis of vanillin." Appl Environ Microbiol 66(2): 684-687 45 Lomascolo, A., Stentelaire, C., Asther, M., & Lesage-Meessen, L (1999) "Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry." Trends Biotechnol 17(7): 282-289 66 46 López-Malo, A., Alzamora, S M., & Argaiz, A (1995) "Effect of natural vanillin on germination time and radial growth of moulds in fruit-based agar systems." Food Microbiology 12(0): 213-219 47 López-Malo, A., Alzamora, S M., & Argaiz, A (1998) "Vanillin and pH Synergistic Effects on Mold Growth." Journal of Food Science 63(1): 143-146 48 Luziatelli, F and P Di Matteo (2008) "Genetic engineering of Escherichia coli to enhance biological production of vanillin from ferulic acid." Bulletin of the University of Agricultural Sciences & Veterinary Medicine Cluj-Napoca Animal Science &Biotechnologies 65 49 Martínez-Cuesta, M D C., Payne, J., Hanniffy, S B., Gasson, M J., & Narbad, A (2005) "Functional analysis of the vanillin pathway in a vdh-negative mutant strain of Pseudomonas fluorescens AN103." Enzyme and Microbial Technology 37(1): 131-138 50 Masai, E., Harada, K., Peng, X., Kitayama, H., Katayama, Y., & Fukuda, M (2002) "Cloning and characterization of the ferulic acid catabolic genes of Sphingomonas paucimobilis SYK-6." Appl Environ Microbiol 68(9): 4416-4424 51 Mathew, S., & Abraham, T E (2004) "Ferulic acid: an antioxidant found naturally in plant cell walls and feruloyl esterases involved in its release and their applications." Crit Rev Biotechnol 24(2-3): 59-83 52 Muheim, A., & Lerch, K (1999) "Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin." Appl Microbiol Biotechnol 51(4): 456-461 53 Ner, S S., Bhayana, V., Bell, A W., Giles, I G., Duckworth, H W., & Bloxham, D P (1983) "Complete sequence of the gltA gene encoding citrate synthase in Escherichia coli." Biochemistry 22(23): 5243-5249 54 Noor Hasyierah, M S., Mohamed Zulkali, M D., & Ku Syahidah Ku, I (2008) "Ferulic acid from Lignocellulosic biomass: review." 55 Ou, S., & Kwok, K C (2004) "Ferulic acid: pharmaceutical functions, preparation and applications in foods." Journal of the Science of Food and Agriculture 84(11): 1261-1269 56 Overhage, J., Priefert, H., Rabenhorst, J., & Steinbüchel, A (1999) "Biotransformation of eugenol to vanillin by a mutant of Pseudomonas sp strain HR199 constructed by disruption of the vanillin dehydrogenase (vdh) gene." Appl Microbiol Biotechnol 52(6): 820-828 57 Overhage, J., Steinbüchel, A., & Priefert, H (2003) "Highly efficient biotransformation of eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in 67 recombinant strains of Escherichia coli." Appl Environ Microbiol 69(11): 65696576 58 Overhage, J., Steinbüchel, A., & Priefert, H (2006) "Harnessing eugenol as a substrate for production of aromatic compounds with recombinant strains of Amycolatopsis sp HR167." J Biotechnol 125(3): 369-376 59 Peng, X., Misawa, N., & Harayama, S (2003) "Isolation and characterization of thermophilic bacilli degrading cinnamic, 4-coumaric, and ferulic acids." Appl Environ Microbiol 69(3): 1417-1427 60 Plaggenborg, R., Overhage, J., Loos, A., Archer, J A., Lessard, P., Sinskey, A J., & Priefert, H (2006) "Potential of Rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from ferulic acid and eugenol." Appl Microbiol Biotechnol 72(4): 745-755 61 Plaggenborg R, Overhage J, Steinbüchel A, Priefert H (2003) "Functional analyses of genes involved in the metabolism of ferulic acid in Pseudomonas putida KT2440." Appl Microbiol Biotechnol 61(5-6): 528-535 62 Plaggenborg R., Steinbuchel R, Priefert H (2001) "The coenzyme A-dependent, nonbeta-oxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for ferulic acid degradation in Delftia acidovorans." FEMS Microbiol Lett 205(1): 9-16 63 Priefert, H., Rabenhorst, J., & Steinbüchel, A (2001) "Biotechnological production of vanillin." Appl Microbiol Biotechnol 56(3-4): 296-314 64 Ranadive, A (1994) "Vanilla cultivation, curing, chemistry, technology and commercial products." Developments in food science 65 Rao, S R., & Ravishankar, G A (2000) "Biotransformation of protocatechuic aldehyde and caffeic acid to vanillin and capsaicin in freely suspended and immobilized cell cultures of Capsicum frutescens." J Biotechnol 76(2-3): 137-146 66 Ruiz, T.F., Perez, A1 and Lopez, M (2001) "Enzymatic extraction and transformation of glucovanillin to vanillin from vanilla green pods." J Agric Food Chem 49(11): 5207-5209 67 Ryu, J., Seo, J., Lee, Y., Lim, Y., Ahn, J H., & Hur, H G (2005) "Identification of syn- and anti-anethole-2,3-epoxides in the metabolism of trans-anethole by the newly isolated bacterium Pseudomonas putida JYR-1." J Agric Food Chem 53(15): 5954-5958 68 Sasaki, Y., Ohta, T., Imanishi, H., Watanabe, M., Matsumoto, K., Kato, T., & Shirasu, Y (1990) "Suppressing effects of vanillin, cinnamaldehyde, and anisaldehyde on chromosome aberrations induced by X-rays in mice." Mutat Res 243(4): 299-302 68 69 Serra, S., Fuganti, C., & Brenna, E "Biocatalytic preparation of natural flavours and fragrances." Trends Biotechnol 23(4): 193-198 70 Shimoni, E., Baasov, T., Ravid, U., & Shoham, Y (2003) "Biotransformations of propenylbenzenes by an Arthrobacter sp and its t-anethole blocked mutants." J Biotechnol 105(1-2): 61-70 71 Shimoni E, Ravid U, Shoham Y (2000) "Isolation of a Bacillus sp capable of transforming isoeugenol to vanillin." J Biotechnol 78(1): 1-9 72 Sinha, A K., Verma, S C., & Sharma, U K (2007) "Development and validation of an RP-HPLC method for quantitative determination of vanillin and related phenolic compounds in Vanilla planifolia." Journal of Separation Science 30(1): 15-20 73 Srivastava, S., Luqman, S., Khan, F., Chanotiya, C S., & Darokar, M P (2010) "Metabolic pathway reconstruction of eugenol to vanillin bioconversion in Aspergillus niger." Bioinformation 4(7): 320-325 74 Sun, R., Sacalis, J N., Chin, C K., & Still, C C (2001) "Bioactive aromatic compounds from leaves and stems of Vanilla fragrans." J Agric Food Chem 49(11): 5161-5164 75 Douglass F Taber, Shweta Patel, Travis M Hambleton, Emma E Winkel (2007) "Vanillin Synthesis from 4-Hydroxybenzaldehyde." Journal of Chemical Education 84(7): 1158 76 Tawatsin, A., Wratten, S D., Scott, R R., Thavara, U., & Techadamrongsin, Y (2001) "Repellency of volatile oils from plants against three mosquito vectors." J Vector Ecol 26(1): 76-82 77 Tilay, A., Bule, M., & Annapure, U (2010) "Production of biovanillin by one-step biotransformation using fungus Pycnoporous cinnabarinus." J Agric Food Chem 58(7): 4401-4405 78 Unno, T., Kim, S J., Kanaly, R A., Ahn, J H., Kang, S I., & Hur, H G (2007) "Metabolic characterization of newly isolated Pseudomonas nitroreducens Jin1 growing on eugenol and isoeugenol." J Agric Food Chem 55(21): 8556-8561 79 Vaghasiya, Y K., Nair, R., Soni, M., Baluja, S., & Shanda, S (2004) "Synthesis, structural determination and antibacterial activity of compounds derived from vanillin and 4-aminoantipyrine." Journal of the Serbian Chemical Society 69(12): 991-998 80 van den Heuvel RH, Fraaije MW, Laane C, van Berkel WJ (2001) "Enzymatic synthesis of vanillin." J Agric Food Chem 49(6): 2954-2958 69 81 Walton, N J., Mayer, M J., & Narbad, A (2003) "Vanillin." Phytochemistry 63(5): 505-515 82 Westcott, R J., Cheetham, P S J., & Barraclough, A J (1993) "Use of organized viable vanilla plant aerial roots for the production of natural vanillin." Phytochemistry 35(1): 135-138 83 Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2007) "Biotransformation of isoeugenol to vanillin by Pseudomonas putida IE27 cells." Appl Microbiol Biotechnol 73(5): 1025-1030 84 Yoon, S H., Lee, E G., Das, A., Lee, S H., Li, C., Ryu, H K., & Kim, S W (2007) "Enhanced vanillin production from recombinant E coli using NTG mutagenesis and adsorbent resin." Biotechnol Prog 23(5): 1143-1148 85 Yoon, S H., Li, C., Kim, J E., Lee, S H., Yoon, J Y., Choi, M S., & Kim, S W (2005) "Production of vanillin by metabolically engineered Escherichia coli." Biotechnol Lett 27(22): 1829-1832 86 Zhang, C., Li, X., Lian, L., Chen, Q., Abdulmalik, O., Vassilev, V., & Asakura, T (2004) "Anti-sickling effect of MX-1520, a prodrug of vanillin: an in vivo study using rodents." Br J Haematol 125(6): 788-795 87 Y Zhang, P Xu, S Han, H Yan, C Ma (2006) "Metabolism of isoeugenol via isoeugenol-diol by a newly isolated strain of Bacillus subtilis HS8." Appl Microbiol Biotechnol 73(4): 771-779 88 Zhao, L Q., Sun, Z H., Zheng, P., & Zhu, L (2005) "Biotransformation of isoeugenol to vanillin by a novel strain of Bacillus fusiformis." Biotechnol Lett 27(19): 1505-1509 [...]... xác định trình tự gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E coli nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin, trước mắt là tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin 1.2 Mục tiêu của đề tài - Tách dòng gene gltA của vi khuẩn E coli DH5α - Xác định trình tự gene gltA đã tách dòng và so sánh với trình tự. .. cứu kĩ Quá trình tổng hợp vanillin từ axit ferulic ở trong vi khuẩn E coli nhờ enzyme feruloyl –CoA synthetase (mã hóa bởi gene fcs) và enoyl –CoA hydratase/ aldolase (mã hóa bởi gene ech) Đồng thời, các acetyl –CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic có thể được chuyển đổi thành CoA bởi gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase Như vậy sự khuếch đại của gltA trong E coli sẽ làm... vanilin từ axit ferulic ngày càng được nâng cao nhờ quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng 2.6.2 Vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin Gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase trong E coli đã được nghiên cứu cấu trúc gene và giải trình tự gene bởi (Ner, Bhayana et al 1983) Trình tự gene này chứa 3265 bp được giới hạn bởi hai enzyme cắt giới hạn HindIII và EcoRI, mã hóa cho một chuỗi... Okada et al 2008) được thiết kế trong vi khuẩn E coli tái tổ hợp đã được nghiên cứu và đạt những thành công nhất định Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs và ech 25 Trong sơ đồ biểu diễn sự tái chế của coenzymeA (CoA) từ aceltyl –CoA trong sản xuất vanillin từ axit ferulic liên quan đến chu trình TCA và glyoxylate ở E coli (Hình 6) các gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase. .. điều hòa iclR Do vậy để sử dụng tối đa acetyl - CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gen aceA và aceB bằng cách xóa bỏ gene iclR, đồng thời xóa bỏ gene icdA bởi vì isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenase (icdA) cao hơn enzyme isocitrate lyase (aceA) Nghiên cứu chủng E coli BW25113 kết hợp ảnh hưởng của khuếch đại gene gltA với vi c xóa bỏ gene icdA làm tăng đáng kể sản xuất vanillin... bản gene fcs và ech từ Amycolatopsis sp với sự cảm ứng của isopropylthiogalactoside (IPTG) và promoter trc Sản xuất vanillin từ axit ferulic trong tế bào E coli DH5α chứa plasmid pTAHEF chèn gene fcs và ech tách từ Amycolatopsis sp HR104 đã được thử nghiệm (Yoon, Lee et al 2007) Nghiên cứu E coli DH5α có chứa plasmid tái tổ hợp pTAHEF - gltA cho thấy sự khuếch đại của gene gltA (mã hóa enzyme citrat synthase) ... (Torre, De Faveri et al 2004) (Martínez-Cuesta, 20 Ferulic acid Recombinant E coli E coli DH5α (pTAHEF) 1,1 1 E coli NTG-VR1 2,9 E coli DH5α (pTAHEF -gltA) E coli BW25113 (pTAHEF) Aspergillus niger CGMCC0774, Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115 1,98 5,14 Lactic acid bacteria Phenolic stilbenes Ligin - Amycolatopsis sp HR167 >10 Streptomyces sp V-1 19,2 E coli JM109 (pBB1) 2,52 Recombinant E coli 5,14 Pseudomonas... con đường Glyoxylate (Lee, Yoon et al 2009) Các acetyl - CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic có thể được chuyển đổi thành CoA bởi enzyme citrate synthase do gene gltA mã hóa Nghiên cứu điều tra vai trò khuếch đại gene gltA trong plasmid tái tổ hợp pTAHEF có chứa gene ech và fcs trong E coli DH5α đã được chứng minh làm tăng quá trình chuyển đổi axit ferulic thành vanilin... Gioia et al 2007) (Di Gioia, Luziatelli et al 2011) Để phát triển một dòng tái tổ hợp ổn định hơn, E coli JM109 được thiết kế bằng cách nhân bản gene ech và gene fcs của P fluorescens BF13 vào một vector pFR12 với một replicon cảm nhiệt, được thiết kế để tích hợp nhiễm sắc thể vào gene lacZ của E coli (Luziatelli and Di Matteo 2008);(Converti, Aliakbarian et al 2010) Một chủng vi khuẩn E coli XL1 –Blue... glycoxylate nơi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-ketoglutarate Con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng, giúp chuyển hóa axit ferulic nhanh hơn Để thực hiện con đường này cần có sự tham gia của hai enzyme isocitrate lyase và malate synthase mã hóa bởi gene aceA, aceB Sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gene điều