ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ QUYÊN Tên đề tài: “ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ KIỂU GEN KHÁNG BỆNH XOĂN VÀNG LÁ (TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS - TYLCV) CỦA CÁC DÒNG CÀ CHUA CHỌN TẠO BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG VỤ XUÂN HÈ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ QUYÊN Tên đề tài: “ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ KIỂU GEN KHÁNG BỆNH XOĂN VÀNG LÁ (TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS - TYLCV) CỦA CÁC DÒNG CÀ CHUA CHỌN TẠO BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG VỤ XUÂN HÈ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2010 – 2014 Người hướng dẫn : TS Trần Ngọc Hùng Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Rau TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH - CNTP - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Ngọc Hùng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Rau Việt Nam TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em q trình thực hồn thành khóa luận Qua em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị công tác Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Rau tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể thầy khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Thầy cô tận tình giảng dạy, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi tới người thân bạn bè, người quan tâm ủng hộ chỗ dựa cho em suốt thời gian em làm khóa luận này, sống Xin trân trọng cám ơn! Thái Nguyên, ngày 06 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Quyên DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Cs DNA dNTP EDTA FAO KG MT NST PCR TB TYLCV : Cộng : Deoxyribonucleic Acid : Deoxynucleotide Triphosphate : Ethylene Diamine Tetraacetace Acid : Food and Agriculture Organization of the United : Kiểu gen : Môi trường : Nhiễm sắc thể : Polymerase chain reaction : Trung bình : Tomato Yellow Leaf Curl Virus MỤC LỤC trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 2.1 Giới thiệu chung cà chua 10 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 10 2.1.2 Đặc điểm thực vật học 11 2.1.3 Phân bố sinh thái 12 2.1.4 Tình hình sản xuất cà chua Thế giới Việt Nam 16 2.2 Bệnh xoăn vàng cà chua 23 2.2.1 Triệu chứng bệnh 23 2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 23 2.3 Chỉ thị phân tử 24 2.3.1 Giới thiệu chung thị phân tử 24 2.3.2 Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh xoăn vàng thị phân tử 27 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 28 3.1.1 Đối tượng, hóa chất, thiết bị mơi trường ni cấy 28 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 31 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 3.3 Nội dung nghiên cứu 31 3.3.1 Nội dung 1: Chọn lọc dòng cà chua kháng TYLCV thị phân tử 31 3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá đặc tính nơng sinh học dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng 31 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Chọn tạo dòng cà chua kháng TYLCV thị phân tử 31 3.4.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học 33 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Xác định gen kháng bệnh xoăn vàng 35 4.2 Đánh giá đặc điểm nơng sinh học dịng cà chua kháng TYLCV 40 4.2.1 Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học 40 4.3.3 Kết đánh giá tính chịu nhiệt 42 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 1: Diện tích, suất sản lượng cà chua châu lục giới năm 2011 17 Bảng 2.2: Những nước có sản lượng cà chua cao năm 2011 17 Bảng 2.3: Những nước có giá trị nhập cà chua lớn giới năm 2008 18 Bảng 3.1: Mã hiệu dòng cà chua 28 Bảng 3.2: Các thị phân tử 29 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng sinh học phân tử 30 Bảng 3.4: Môi trường LB 30 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 32 Bảng 3.6: Quy trình thực phản ứng PCR 33 Bảng 4.1: Các gen kháng TYLCV 38 Bảng 4.2: Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học 41 Bảng 4.3 Đánh giá tính chịu nhiệt 43 DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 2.1: Bệnh xoăn vàng cà chua 23 Hình 4.1: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty1 35 Hình 4.2: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty2 36 Hình 4.3: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty3 37 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Virus gây bệnh xoăn vàng cà chua (Tomato Yellow Leaf Curl Virus - TYLCV) thuộc chi Begomovirus họ Geminiviridae, lan truyền nhờ bọ phấn (Bamisia tabaci) phát lần Israel vào năm 1939 [33] Bệnh gây hại hủy diệt nhiều giống cà chua [19] Theo Pico cs (1996)[33], thiệt hại lớn sản xuất cà chua TYLCV ghi nhận vùng Nhiệt đới, Á Nhiệt đới, chí kể Châu Âu nửa Tây bán cầu Năng suất thiệt hại trung bình từ 55 - 90% chí 100% bị nhiễm bệnh Một biện pháp hiệu để phòng trừ hữu hiệu dịch hại dùng giống kháng bệnh, hàng thập kỷ qua cơng tác tạo giống theo hướng liên tục thực Tuy nhiên số dòng, giống cà chua kháng tốt bệnh hạn chế [27] Mặc dù chưa có thống kê đầy đủ thiệt hại TYLCV gây Việt Nam, bệnh tàn phá nhiều ruộng cà chua, đặc biệt vụ xuân hè Để hạn chế bệnh, phần lớn nông dân trơng cậy vào thuốc hóa học để diệt trừ vật chủ trung gian truyền bệnh luân canh trồng Ngoài ra, nước ta sử dụng giống kháng bệnh hướng nghiên cứu Savior coi giống cà chua lai đưa vào Việt Nam có khả chống chịu với bệnh xoăn vàng Trong vụ sớm, giống chủ lực nhiều vùng cà chua phía Bắc [13] Nhiệt độ thích hợp để cà chua sinh trưởng 22 - 240C (Lorenz, 1988) [30] nên tỉnh phía Bắc nước ta cà chua trồng mùa vụ: vụ sớm (gieo hạt cuối tháng 7, đầu tháng trồng cuối tháng 8, đầu tháng 9); vụ (gieo hạt đầu tháng đến đầu tháng 10, trồng đầu tháng 10 đến đầu tháng 11); vụ muộn (gieo hạt tháng 11 đến tháng 12, trồng tháng 12 đến tháng 1); vụ xuân hè (gieo hạt đầu tháng 2, trồng cuối tháng đến đầu tháng 3) [1] Trong vụ xuân hè nhiệt độ ẩm độ liên tục tăng, điều kiện thuận lợi cho bọ phấn - vật chủ trung gian truyền bệnh xoăn vàng phát triển Hiện nay, locus liên quan đến tính kháng bệnh TYLCV tìm thấy số mẫu cà chua hoang dại: S Chilense, S habrochatis, S pimpinellifolium, S peruvianum, S Cheesmaniae Các gen kháng định vị nhiễm sắc thể (NST) thông qua đồ liên kết gen Hai gen trội khơng hồn tồn Ty1 (Zamir cs, 1994) [34] Ty3 (Ji cs, 2007) [27] tìm thấy mẫu giống ‘LA1969’ (S chilense) ‘LA2779’ (S chilense), gen nằm NST số nguồn gen kháng hiệu với bệnh xoăn vàng cà chua nửa Tây bán cầu Locus Ty2 nằm NST số 11, tìm thấy mẫu giống ‘B6013’ (S habrochatis) thể khả kháng tốt với chủng virus xoăn vàng Nam Ấn Độ, Nhật Bản Bắc Việt Nam [19] Những năm gần đây, thị phân tử (PCR - based molecular markers) liên kết chặt với gen kháng bệnh xoăn vàng phát triển ứng dụng hiệu chọn tạo giống [13] Từ năm 2010, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Nghiên cứu Rau bước đầu sử dụng thị phân tử để tạo giống cà chua chống chịu bệnh TYLCV gây Nhiều dòng cà chua (F3-F4) tạo Tiếp tục q trình tạo giống, dịng cần xác định kiểu gen liên quan đến tính kháng bệnh xoăn vàng đặc điểm nông sinh học (dạng quả, chất lượng quả) phù hợp với vụ xuân hè Đó lý cần thiết để thực đề tài “Đánh giá đặc điểm nông sinh học kiểu gen kháng bệnh xoăn vàng (Tomato Yellow Leaf Curl Virus - TYLCV) dòng cà chua chọn tạo thị phân tử vụ xuân hè” 1.2 Mục đích nghiên cứu Chọn lọc dòng cà chua kháng TYLCV đưa sản xuất 1.3 Yêu cầu đề tài Chọn lọc dòng cà chua kháng TYLCV thị phân tử Đánh giá đặc tính nơng sinh học dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng 33 Điều kiện chu trình nhiệt phản ứng PCR thực bảng 3.7 Bảng 3.6: Quy trình thực phản ứng PCR Giai đoạn Biến tính khởi đầu Các chu kỳ tổng hợp Kết thúc Nhiệt độ( oC) Thời gian Số chu kỳ 94 phút 94 30 giây 58 20 giây 72 30 giây 72 phút 30 Sau kết thúc quy trình, sản phẩm bảo quản 4oC thực phản ứng - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Bước 1: Chuẩn bị gel 1,5% agarose TAE 0,5X Hịa tan hồn tồn agarose TAE đun sơi lị vi sóng Để nguội đến khoảng 60oC, tiến hành đổ gel để gel agarose đơng hồn tồn Bước 2: Chạy điện di: Tra mẫu: trộn lẫn DNA loading dye 6X theo tỷ lệ : 1, sau tra hỗn hợp vào giếng Chạy điện di hiệu điện 110V khoảng 30 phút Nhuộm gel với dung dịch edthidium bromide 30 phút Hiển thị kết điện di tia UV, ghi lại hình ảnh điện di Phân tích kết điện di 3.4.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học Sau xác định kiểu gen thị phân tử giai đoạn vườn ươm, mẫu giống mang gen kháng bệnh trồng ruộng để đánh giá đặc điểm nơng sinh học Thí nghiệm đánh giá đặc điểm nơng sinh học (năng suất, dạng quả, chất lượng quả), bố trí theo phương pháp tuần tự, khơng lặp lại Khoảng cách trồng : x hàng = 40cm x 70 cm Số liệu thu thập sử lý thống kê theo chương trình SAS - Một số tiêu nơng sinh học đánh sau (mỗi dòng, giống thực ngẫu nhiên) 34 + Độ đường (%) đo cách dùng chiết quang kế + Chiều cao (cm) đo thước kẹp trung bình dịng + Đường kính (cm) đo thước kẹp vị trí to trung bình + Dạng xác định sau: Dạng quả: I = H/ D (trong H =Chiều cao (cm); D= Đường kính (cm) I>1 : Dạng dài I = 0,8-1 : Dạng tròn I < 0,8 : Dạng dẹt 35 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định gen kháng bệnh xoăn vàng Tách chiết DNA tổng số bước khởi đầu để tiến hành thí nghiệm sinh học phân tử PCR, sử dụng thị phân tử DNA tổng số dòng cà chua sử dụng nghiên cứu tách chiết theo phương pháp Evenyl Klocke cs (1997)[22] Sản phẩm tách chiết DNA tổng số kiểm tra điện di gel agarose 1,5% Kết điện di số dòng cà chua thể hình - Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty1 500bp 398bp 400bp 300bp 303bp Hình 4.1 : Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty1 Đường chạy M: thang chuẩn DNA có kích thước 1000bp, đường chạy số đến 29 sản phẩm PCR sử dụng mẫu DNA dòng cà chua: 14-TYS-01; 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-07; 14-TYS-09; 14-TYS-11; 14-TYS-13; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-18; 14-TYS-19; 14-TYS-21; 14-TYS-22; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31; 14-TYS-32; 14-TYS-34; 14-TYS-37; 14-TYS-38; 14-TYS-39; 14-TYS-40; 14-TYS-41 Dựa vào hình 4.1 ta thấy: Các đường chạy số 1, 4, 13, 18, 19, 20, 21, 22 27 tương ứng với dòng: 14-TYS-01; 14-TYS-04; 14-TYS-18; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31; 14-TYS-39, xuất băng DNA có kích thước 398bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen trội Ty1, chứng tỏ dịng có kiểu gen 36 (KG) đồng hợp trội Ty1/Ty1 Các đường chạy số 2, 3, 5, 8, 10, 15, 16, 17, 24 29 tương ứng với dòng: 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-05; 14-TYS-09; 14-TYS-13; 14-TYS-21; 14-TYS-22; 14-TYS-23; 14-TYS-34; 14-TYS-41, xuất băng DNA có kích thước 303bp, tương ứng với kích thước sản phẩm khuyếch đại từ gen lặn ty1 Theo lý thuyết, chứng tỏ dịng có KG đồng hợp lặn ty1/ty1 Các đường chạy số 6, 7, 9, 11, 12, 14, 23, 25, 26 28, tương ứng với dòng: 14-TYS-06; 14-TYS-07; 14-TYS-11; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-19; 14-TYS-32; 14-TYS-37; 14-TYS-38; 14-TYS-40, xuất băng DNA, băng có kích thước 398bp, băng có kích thước 303bp Chứng tỏ dòng cà chua mang gen trội Ty1 gen lặn ty1 Vậy chúng mang gen dị hợp tử Ty1/ty1 - Kết điện di sản phẩm PCR thị Ty2 Qua kết điện di cho thấy có 18 dịng cà chua: 14-TYS-01; 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-19; 14-TYS-21; 14-TYS-22; 14-TYS-32; 14-TYS-34; 14-TYS-37; 14-TYS-38; 14-TYS-39; 14-TYS-40; 14-TYS-41, không mang gen Ty2 Các dòng lại: 14-TYS-07; 14-TYS-09; 14-TYS-11; 14-TYS-13; 14-TYS-18; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31 mang gen Ty2, nên điện di lại theo hình 4.2 950bp 1000bp 500bp 850bp Hình 4.2: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty2 Đường chạy M: thang chuẩn DNA có kích thước 1200bp, đường chạy số: 7, 8, 9, 10, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 22 sản phẩm PCR sử dụng mẫu DNA dòng cà chua: 14-TYS-07;14-TYS-09; 14-TYS-11; 37 14-TYS-13; 14-TYS-18; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31 Từ hình 4.2 ta có, đường chạy số: 7, 8, 9, 17, 18, 19, 20, 21 tương ứng với dòng: 14-TYS-07; 14-TYS-09; 14-TYS-11; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29, xuất băng DNA có kích thước 950bp, tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen trội Ty2, chứng tỏ dòng mang KG đồng hợp trội Ty2/Ty2 Các đường chạy: 10, 13, 22 dòng: 14-TYS-13; 14-TYS-18; 14-TYS-31, có băng DNA có kích thước 850bp, tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen lặn ty2 Chứng tỏ dòng mang KG đồng hợp lặn ty2/ty2 Khi điện di kiểm tra sản phẩm thị Ty2 khơng có dòng cà chua mang KG dị hợp (Ty2/ty2) - Kết điện di sản phẩm PCR thị Ty3 Qua kết điện di cho thấy có dòng cà chua: 14-TYS-32; 14-TYS-34; 14-TYS-37; 14-TYS-38; 14-TYS-39; 14-TYS-40; 14-TYS-41, khơng mang gen Ty3, 22 dịng cà chua lại mang gen Ty3 điện di lại thể hình 4.3 700bp 400bp 641bp 475bp Hình 4.3 : Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty3 Đường chạy M: thang chuẩn DNA có kích thước 1200bp, đường chạy số đến số 22 sản phẩm PCR sử dụng mẫu DNA dòng cà chua: 14-TYS-01; 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-07; 14-TYS-09; 14-TYS-11; 14-TYS-13;14-TYS-16;14-TYS-17; 14-TYS-18; 14-TYS-19; 14-TYS-21; 14-TYS-22; 14-TYS-2; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31 38 Kết điện di sản phẩm PCR thị Ty3 thể hình 4.3 cho thấy đường chạy 1, 8, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 tương ứng với dòng: 14-TYS-01; 14-TYS-09; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-22; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31, xuất băng DNA có kích thước 641bp, tương đương với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen trội Ty3 Chứng tỏ dòng mang KG đồng hợp trội Ty3/Ty3 Các đường chạy: 4, 5, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 15 tương đương với dòng: 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-07; 14-TYS-11; 14-TYS-13; 14-TYS-18; 14-TYS-19; 14-TYS-21, đường chạy có băng DNA, băng có kích thước 641bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen trội Ty3, băng có kích thước 475bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuyếch đại từ gen lặn ty3 Chứng tỏ dòng cà chua mang gen trội Ty3 gen lặn ty3, chúng mang gen dị hợp tử Ty3/ty3 Hai đường chạy lại 2, dòng: 14-TYS-02; 14TYS-03, có băng DNA có kích thước 475bp, tương ứng với kích thước sản phẩm khuyếch đại từ gen lặn ty3, theo lý thuyết hai dịng cà chua mang gen đồng hợp lặn ty3/ty3 Từ kết thể hình 4.1; 4.2 4.3 cho thấy kiểu gen kháng TYLCV 29 dòng cà chua sử dụng đề tài Kết hợp hình ta có bảng sau Bảng 4.1: Các gen kháng TYLCV STT Tên dòng Gen kháng TYLCV Ty1 Ty2 Ty3 14-TYS-01 Ty1/Ty1 - Ty3/Ty3 14-TYS-02 ty1/ty1 - ty3/ty3 14-TYS-03 ty1/ty1 - ty3/ty3 14-TYS-04 Ty1/Ty1 - Ty3/ty3 14-TYS-05 ty1/ty1 - Ty3/ty3 14-TYS-06 Ty1/ty1 - Ty3/ty3 14-TYS-07 Ty1/ty1 Ty2/Ty2 Ty3/ty3 14-TYS-09 ty1/ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 39 14-TYS-11 Ty1/ty1 Ty2/Ty2 Ty3/ty3 10 14-TYS-13 ty1/ty1 ty2/ty2 Ty3/ty3 11 14-TYS-16 Ty1/ty1 - Ty3/Ty3 12 14-TYS-17 Ty1/ty1 - Ty3/Ty3 13 14-TYS-18 Ty1/Ty1 ty2/ty2 Ty3/ty3 14 14-TYS-19 Ty1/ty1 - Ty3/ty3 15 14-TYS-21 ty1/ty1 - Ty3/ty3 16 14-TYS-22 ty1/ty1 - Ty3/Ty3 17 14-TYS-23 ty1/ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 18 14-TYS-24 Ty1/Ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 19 14-TYS-27 Ty1/Ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 20 14-TYS-28 Ty1/Ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 21 14-TYS-29 Ty1/Ty1 Ty2/Ty2 Ty3/Ty3 22 14-TYS-31 Ty1/Ty1 ty2/ty2 Ty3/Ty3 23 14-TYS-32 Ty1/ty1 - - 24 14-TYS-34 ty1/ty1 - - 25 14-TYS-37 Ty1/ty1 - - 26 14-TYS-38 Ty1/ty1 - - 27 14-TYS-39 Ty1/Ty1 - - 28 14-TYS-40 Ty1/ty1 - - 29 14-TYS-41 Ty1/Ty1 - - Alen cho gen Ty1: Ty1 alen kháng bệnh, ty1 alen nhiễm bệnh Alen cho gen Ty2: Ty2 alen kháng bệnh, ty2 alen nhiễm bệnh Alen cho gen Ty3: Ty3 alen kháng bệnh, ty3 alen nhiễm bệnh “-”: Khơng có gen Theo nghiên cứu Zamir cs (1994)[34] Ji cs (2007)[27], locus Ty1, Ty3 định vị NST số có nguồn gốc từ Tây bán cầu Locus Ty2 nằm NST số 11, tìm thấy Nam Ấn Độ, Nhật Bản, Bắc Việt Nam Từ kết nghiên cứu bảng 4.1, dòng 14-TYS-07; 14-TYS-11; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29 chứa locus Ty1, Ty2, Ty3, sản phẩm lai dịng có nguồn 40 gốc Tây bán cầu với dịng có nguồn gốc Nam Ấn Độ, Nhật Bản, Bắc Việt Nam Các dòng 14-TYS-01; 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-19; 14-TYS-21; 14-TYS-22 mang locus Ty1, Ty3, điều chứng tỏ dòng có nguồn gốc từ Tây bán cầu khơng qua lai tạo dịng lai (chứa locus), bị đột biến đoạn NST mang locus Ty2 q trình tiến hóa Theo Trần Ngọc Hùng (2013)[8], tính kháng bệnh xoăn vàng cà chua quy định gen trội Ty1, Ty2, Ty3 Các dịng khơng mang gen trội khơng có tính kháng Số lượng gen trội nhiều khả kháng bệnh xoăn vàng dòng cà chua cao Kết nghiên cứu cho phép khẳng định có dịng cà chua: 14-TYS-02; 14-TYS-03; 14-TYS-34 khơng chứa gen kháng xoăn vàng Có 26 dòng: 14-TYS-01; 14-TYS-04; 14-TYS-05; 14-TYS-06; 14-TYS-07; 14-TYS-09; 14-TYS-11; 14-TYS-13; 14-TYS-16; 14-TYS-17; 14-TYS-18; 14-TYS-19; 14-TYS-21; 14-TYS-22; 14-TYS-23; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29; 14-TYS-31; 14-TYS-32; 14-TYS-37; 14-TYS-38; 14-TYS-39; 14-TYS-40; 14-TYS-41có khả kháng TYLCV mức độ khác Trong đó, dòng chứa gen kháng TYLCV 14-TYS-07; 14-TYS-11; 14-TYS-24; 14-TYS-27; 14-TYS-28; 14-TYS-29, dịng có khả kháng bệnh tốt cần nghiên cứu, đánh giá vụ 4.2 Đánh giá đặc điểm nơng sinh học dịng cà chua kháng TYLCV 4.2.1 Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học Trước nhu cầu ngày cao thị trường rau đòi hỏi giống cà chua phải mang đặc tính tốt như: suất, chất lượng, chống chịu sâu bệnh, màu sắc hình dạng đẹp Tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá đặc điểm nơng sinh học 29 dịng cà chua kết thể bảng 41 Bảng 4.2: Kết đánh giá đặc điểm nơng sinh học STT Tên dịng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 14-TYS-01 14-TYS-02 14-TYS-03 14-TYS-04 14-TYS-05 14-TYS-06 14-TYS-07 14-TYS-09 14-TYS-11 14-TYS-13 14-TYS-16 14-TYS-17 14-TYS-18 14-TYS-19 14-TYS-21 14-TYS-22 14-TYS-23 14-TYS-24 14-TYS-27 14-TYS-28 14-TYS-29 14-TYS-31 14-TYS-32 14-TYS-34 14-TYS-37 14-TYS-38 14-TYS-39 14-TYS-40 14-TYS-41 Trọng lượng Đường kính Cao (g) (cm) quả(cm) 37,0 i-l 4,0 i-l 4,0 jk 32,6 i-l 3,7 j-m 3,6 k 80,3 d-f 5,1 d-g 5,2 d-f 66,3 f-h 5,1 d-f 4,2 h-k 44,6 h-k 4,8 e-h 3,7 k 39,5 i-l 4,1 h-k 3,8 k 20,3 lm 3,0 m 3,7 k 25,0 km 3,1 m 4,2 h-k 25,3 km 3,3 lm 3,7 k 36,3 i-l 3,5 k-m 4,5 g-j 31,3 j-l 3,6 j-m 3,9 kj 6,2 m 2,1 n 2,2 l 275,0 a 8,8 a 6,8 a 41,4 i-l 4,0 i-l 4,3 h-k 35,6 i-l 3,6 j-m 4,5 g-j 28,1 k-m 3,3l m 4,0 i-k 141,6 b 6,5 b 6,0 bc 52,6 g-j 4,4 g-j 5,0 d-g 91,6 de 5,1 d-g 5,7 cd 54,3 g-j 4,2 h-j 5,0 d-g 56,3 g-i 4,6 f-i 4.7 f-i 20,3 lm 3,1 m 3,6 k 81,0 d-f 5,2 d-f 5,9 bc 69,0 fg 5,3 de 4,5 h-j 101,0 cd 5,7 cd 5,7 cd 65,0 f-h 4,6 f-j 4,8 f-h 70,0 e-g 4,7 e-h 5,0 e-g 115,0 c 5,5 cd 6,5 ab 115,0 c 6,0 bc 5,6 c-e Dạng Tròn Tròn Dài Tròn Dẹt Tròn Dài Dài Dài Dài Dài Dài Dẹt Dài Dài Dài Tròn Dài Dài Dài Dài Dài Dài Tròn Tròn Dài Dài Dài Tròn Độ đường 5,5 e-g 6,3 b-e 5,6 c-g 5,7 c-g 4,3 i-k 6,0 c-g 6,5 b-d 7,0 b 6,0 b-f 4,0 jk 6,3 b-e 8,0 a 5,0 g-j 5,2 g-i 6,6 bc 6,0 b-f 4,1 jk 8,0 a 6,0 c-g 5,4 e-h 5,0 g-j 4,5 h-k 4,0 jk 5,0 g-j 6,0 c-g 5,0 g-j 5,0 g-j 4,0 jk 6,0 c-g 42 Các số a, b, , n: các số sử dụng sử lý thống kê Các số liệu theo cột dọc có số giống chứng tỏ sai khác khơng có ý nghĩa độ tin cậy 95% Những giá trị có số khác nhau, chứng tỏ sai khác cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa Kết bảng cho thấy, 29 dòng cà chua có dạng quả: trịn, dẹt, dài Trong đó: có 19 dịng cho dài, dịng trịn dòng dẹt So sánh với bảng 4.1 hình dạng khơng phụ thuộc vào gen Ty1, Ty2, Ty3 Độ đường 29 dòng cà chua dao động từ - 8%, cà chua trồng vụ xuân hè có độ đường từ cao Các dịng cà chua có kích thước nhỏ thường có độ đường cao cao dịng có kích thước lớn Dịng 14-TYS-17 14-TYS-24 có độ đường cao 8,0: 8,0 độ, sau dòng: 14-TYS-09; 14-TYS-21; 14-TYS-07; 14-TYS-02; 14-TYS-16; 14-TYS-11; 14-TYS-22 Trọng lượng dòng cà chua dao động khoảng rộng từ 6,2 - 275(g) Trong dịng 14-TYS-18 có trọng lượng cao nhất: 275(g) Từ bảng 4.2 ta thấy dòng cà chua như: 14-TYS-41; 14-TYS-37; 14-TYS-27; 14-TYS-18; 14-TYS-24 có nhiều tính trạng tốt như: khối lượng lớn, độ đường cao, cần lai tạo để tạo dịng có nhiều ưu điểm 4.3.3 Kết đánh giá tính chịu nhiệt Để đánh giá tính chịu nhiệt dịng cà chua, tiến hành xác định số lượng thân 43 Bảng 4.3 Đánh giá tính chịu nhiệt STT Tên dịng 10 11 12 13 14 15 14-TYS-01 14-TYS-02 14-TYS-03 14-TYS-04 14-TYS-05 14-TYS-06 14-TYS-07 14-TYS-09 14-TYS-11 14-TYS-13 14-TYS-16 14-TYS-17 14-TYS-18 14-TYS-19 14-TYS-21 Số quả/thân 7,3 b-g 1,7 h 7,6 b-g 3,0 gh 6,0 d-h 4,7 f-h 9,7 a-f 11,3 a-c 11,7 ab 13,7 a 11,7 ab 10,3 a-d 7,3 b-g 7,0 b-g 7,0 b-g STT Tên dòng 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 14-TYS-22 14-TYS-23 14-TYS-24 14-TYS-27 14-TYS-28 14-TYS-29 14-TYS-31 14-TYS-32 14-TYS-34 14-TYS-37 14-TYS-38 14-TYS-39 14-TYS-40 14-TYS-41 Số quả/thân 6,3 c-h 5,0 e-h 5,7 d-h 8,0 b-g 11,3 a-c 6,0 d-h 8,0 b-g 9,3 a-f 10,0 a-e 10,3 a-d 6,7 b-h 7,6 b-g 5,0 e-h 7,3 b-g Các số a, b, , h: số sử dụng phần mềm sử lý thống kê Các số liệu theo cột dọc có số giống chứng tỏ sai khác khơng có ý nghĩa độ tin cậy 95% Những giá trị có số khác nhau, chứng tỏ sai khác cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa Kết thể bảng 4.3 cho thấy: số lượng (TB)/thân dao động khoảng tương đối rộng từ 1,7 - 13,7 Trong dịng có số thân lớn là: 14-TYS-13; 14-TYS-11; 14-TYS-16; 14-TYS-09; 14-TYS-28; 14-TYS-17; 14-TYS-37; 14-TYS-34; 14-TYS-07; 14-TYS-32 Số quả/ thân liên quan đến khả chịu nhiệt cây, số lượng quả/thân cao khả chịu nhiệt cao [8] Do kết luận dịng: 14-TYS-13; 14-TYS-11; 14-TYS-16; 14-TYS-09; 14-TYS-28 có khả chịu nhiệt cao, cần tiếp tục nghiên cứu, đánh giá để chọn giống cà chua có khả chịu nhiệt phát triển vụ xuân hè 44 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết 29 mẫu DNA từ 29 dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng sử dụng nghiên cứu Sau điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị Ty-Seminis, T0302 P6-25 xác định gen kháng TYLCV thị Ở thị Ty-Seminis nhận biết gen Ty1 có 19 dịng cà chua ( có kiểu gen đồng hợp trội dị hợp), 10 dịng mang KG đồng hợp lặn khơng có khả kháng bệnh Gen Ty2 nhận biết sử dụng thị T0302, có 18 dịng khơng mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá, dòng mang gen trội Ty2 thể tính kháng bệnh dịng mang lặn khơng kháng bệnh Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thị P6-25 cho thấy: có dịng khơng mang gen kháng Ty3, 11 dịng mang gen trội Ty3, dòng mang KG dị hợp dịng mang gen lặn khơng thể tính kháng bệnh Đánh giá đặc tính nơng sinh học (tính chịu nhiệt, độ đường, kích thước hình dạng quả) dòng cà chua kháng TYLCV phục vụ cho chọn giống 5.2 Kiến nghị Do thời gian thực tập có hạn, số thí nghiệm chưa thực đề tài Vì vậy, chúng tơi đề nghị: Tùy theo tính chất mùa vụ mà màu sắc, chất lượng cà chua thay đổi Vì cần nghiên cứu nhiều vụ để xác định dòng cà chua chất lượng dùng để sản xuất đại trà 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Mai Thị Phương Anh(2003), Kỹ thuật trồng cà chua an toàn quanh năm, Nxb Nghệ An [2] Mai Thị PhươngAnh cs (1996), Rau trồng rau, Giáo trình cao học Nơng nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 164-176 [3] Bộ môn côn trùng (2004), Giáo trình Cơn trùng chun khoa NXB Nơng nghiệp [4] Tạ Thu Cúc (2007), Kỹ thuật trồng cà chua, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr103 [5] Tạ Thu Cúc cộng (1983), Khảo sát số giống cà chua nhập nội trồng vụ xuân hè đất Gia Lâm - Hà Nội, Luận văn phó tiến sĩ KHKT Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội [6] Vũ Văn Hải, Hà Việt Cường (2007), Điều tra nghiên cứu bệnh xoăn vàng cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) hại cà chua vụ đông sớm 2006 Hà Nội phụ cận, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành BVTV, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội [7] Nguyễn Văn Hiển cs(2000), Chọn giống trồng, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 34-35 [8] Trần Ngọc Hùng (2013) , Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua lai (F1) chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora infestans de Bary) bệnh xoăn vàng (TYLCV) thị phân tử Hội thảo quốc gia khoa học trồng lần thứ 9/2013 [9] Lê Thị Liễu (2004), Nghiên cứu đặc điểm sinh học biện pháp hóa học phịng trừ bọ phấn Bemisia tabaci Genm hại cà chua vùng Gia Lâm, Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội [10] Vũ Triệu Mân (2003), Chuẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật NXB Nơng nghiệp, Hà Nội [11] Đặng Văn Niên (2008), “Đánh giá đặc điểm nơng sinh học khả thích ứng số tổ hợp lai cà chua nhập nội đồng sông 46 Hồng”, luận văn thạc sĩ KHKT Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội [12] Phạm Đồng Quảng (2006), “Kết điều tra giống 13 trồng chủ lực nước- giai đoạn 2003-2004”, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội [13] Trần Khắc Thi, Nguyễn Thu Hiền, Ngô Thị Hạnh, Phạm Mỹ Linh, Dương Kim Thoa (2008), Rau ăn ( trồng rau an toàn suất chất lượng cao), Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội, tr 129-164 [14] Trần Khắc Thi, Phạm Mỹ Linh (2007), Rau an toàn- sở khoa học kỹ thuật canh tác, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 69-76 [15] Phan Hữu Tôn cs ( 2013), “Khảo sát ngồn gene cà chua chín chậm kháng virus xoăn vàng thị phân tử”, Tạp chí khoa học phát triển 2013, tập 11, (số 6), 790-796 [16] Nguyễn Văn Viên (1999), Nghiên cứu tình hình phát sinh phát triển biện pháp phòng trừ số bệnh nấm, bệnh xoăn hại cà chua vùng Hà Nội phu cận, Luận án TS nông nghiệp [17] Ngô Thị Hải Xuyên, Nguyễn Văn Đĩnh (2003), “Nghiên cứu tình hình bệnh hại cà chua nhà lưới đồng ruộng”, Tạp chí BVTV Tài liệu Tiếng Anh [18] Ana Perez de Castro, J.M Blanca, M.J.Diez, F.N Vinals 2007 Identification of a CAPS marker tightly linked to the tomato yellow leaf curl disease resistance gene Ty1 in tomato Eur.J.Plant Pathol (2007) 117:347-356 [19] Cohen S, Antignus Y (1994), “Tomato yellow leaf curl virus, a whiteflyborne geminivirus of tomatoes”, Advances in Disease Vector Research [20] Czosnek H, laterrot H (1997), “A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruse”, Arch Virol 147(7) [21] Chunwongse, J., Chunwongse, C., Black, L L., and Hanson, P 2002 Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato J Hortic Sci Biotechnol 77:281-286 [22] Dorokhov BD and Klocke E (1997), “A rapid and economic technique for RAPD analysis of plant genomic”, Russ.J of Genetics, 33(4), p 358-365 [23] FAO Database Static 2009 47 [24] FAO Database Static 2011 [25] Friedmann, M., M Lapidot, S Cohen, and M Pilowsky.1998 A novel source of resistance to tomato yellow leaf curl virus exhibiting a symptomless reaction to viral infection J Amer Soc Hort Sci 123(6): 1004-1007 [26] Heiser C.T (1969), “ Night shades, the paradoxical plant San Fransico California, USA”, Freemen press, p 53-105 [27] Ji, Y., D.J Schuster, and J.W Scott 2007 Ty-3, a begomovirus resistance locus near the Tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty-1 on chromosome of tomato Mol Breed 20:271-284 [28] Kalloo, G.1991 Genetics Improvement of tomato Springer, Berlin, Germany [29] Kuo O.G, Opena R.T and Chen J.T (1998),”Guides for tomato production in the tropic and subtropics”, Asian Vegetable Research and development Center, Unpublished technicalBullention No p, 1-73 [30] Lorenz O.A and Maynard D.N (1988), Handbook for vegetable growers, A Wiley Intersciences Publication- New York/Chichester/Brisbance/Toronto Singapore.p, 70-71 [31] Luckwill L.C (1943),” The genus lycopersicon and historical, biological and taxonomic survey of the wild and cultivated tomatoes”, Aberdeen Univesity studies, Aberdeen, The University press, Aberdeen [32] Maier I (1943),Culturalegumelor, EdituraAgrosilvica, Bucurest, editura a II-a, p 238-269 [33] Pisco B, Diez MJ, Nuez F (1996), “Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop, the tomato yeallow leaf curl virus-a review”, Sci Hortic 67 [34] Zamir, D., Ekstein-Michelson, I., Zakay, Y., Navot, N.,Zeidan, M., Sarfatti, M., Eshed, Y., Harel, E., Pleben,T., Van-Oss, H., Jedar, N., Rabinowitch, H D., &Czosnek, H 1994 Mapping and introgression of aTomato yellow leaf curl virus tolerance gene, Ty-1.Theoretical and Applied Genetics, 88, 141-146