Đang tải... (xem toàn văn)
Các phương pháp tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án...
Cỏc phng phỏp tỏch chit, nh lng v nh tớnh axớt nucleicNguyên tắc: Chiết tách ADN là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với ADN (hay ARN)ADN chiết tách cần đ m b o về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc với độ dài từ 50-100 kb để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật. Tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp chiết tách ADN cho phù hợp 1.1. Các phương pháp tách chiết axít nucleic• Mục tiêu: Thu nhận được các phân tử axít nucleic còn nguyên vẹn tối đa không bị đứt gãy bởi các tác nhân cơ học và hoá học.- Tác nhân cơ học (bị đứt, gãy do nghiền, lắc mạnh).- Tác nhân hoá học ( bị cắt đứt do enzyme nội bào như desoxyribonuclease – DNase và ribonuclease- RNase). 1.1.1. Phương pháp tách chiết DNA- DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách nhân gây đứt gãy.- DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb).• Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước chính sau: Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein, polysaccharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa.- Protein sẽ bị biến tính và kết tủa- DNA, RNA được hoà tan trong nước. Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA.+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine Bước 3. Tủa axít nucleic+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20oC trong 30 phút hoặc ở 0oC qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa.+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa.>>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol còn lại. Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA. 1.1.2. PP tách chiết RNA tổng số và mRNA- Chú ý: + Phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase.+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không khí…).+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt.Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần. • Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA. Chỉ khác là ở bước cuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA.• Tách chiết mRNA- Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A- Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T).- mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T.- Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ lại.- Sau Cỏc phng phỏp tỏch chit, nh lng v nh tớnh axớt nucleic Nguyên tắc: Chiết tách ADN cần thiết thực nghiệm công nghệ gen tiến hành với ADN (hay ARN) ADN chiết tách cần đm bo độ tinh khiết độ nguyên vẹn cấu trúc với độ dài từ 50100 kb để thực khâu nghiên cứu công nghệ gen thực vật Tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp chiết tách ADN cho phù hợp 1.1 Cỏc phng phỏp tỏch chit axớt nucleic Mc tiờu: Thu nhn c cỏc phõn t axớt nucleic cũn nguyờn ti a khụng b t góy bi cỏc tỏc nhõn c hc v hoỏ hc - Tỏc nhõn c hc (b t, góy nghin, lc mnh) - Tỏc nhõn hoỏ hc ( b ct t enzyme ni bo nh desoxyribonuclease DNase v ribonuclease- RNase) 1.1.1 Phng phỏp tỏch chit DNA - DNA cú kớch thc ln ú cn trỏnh cỏc tỏch nhõn gõy t góy - DNA genome (V, TV) sau tỏch chit phi cú kớch thc ln (15kb-300kb) Phng phỏp tỏch chit c bn gm bc chớnh sau: Bc Phỏ v mng t bo v mng nhõn t bo V hoc TV, bng cỏch nghin t bo hoc mụ nit lng 1960C hoc dựng hn hp cht ty (SDS, Sarcosyl) v proteinase K Bc Loi b thnh phn khụng mong mun mu, nh cỏc protein, polysaccharide Mu c b sung hn hp dung dch (phenol: chloroform: isoamine t l 25:24:1), lc mnh cho n dung dch cú dng trng sa - Protein s b bin tớnh v kt ta - DNA, RNA c ho tan nc Sau ly tõm cao tc hn hp dung dch chia lm pha: + Pha trờn cựng l pha nc cha DNA, RNA + Pha gia l pha cha protein v cỏc cht th cp b kt ta + Phỏ di l dung dch phenol: chloroform: isoamine Bc Ta axớt nucleic + Ta bng ethanol tuyt i (t l 2:1), ta tt nht - 20oC 30 phỳt hoc 0oC qua ờm Hu nh ton b cỏc phõn t axớt nucleic u kt ta + Ta bng isopropanol (t l 1:1) 0oC, cỏc phõn t DNA cú trng lng phõn t thp khụng b kt ta >>> Sau ú ly tõm ta s thu c cn (DNA, RNA), cn c bng cn 70% loi b mui v isopropanol cũn li Bc Ho tan cn (DNA, RNA) v x lý loi b RNA bng enzyme Rnase Sau ú kt ta li c DNA 1.1.2 PP tỏch chit RNA tng s v mRNA - Chỳ ý: + Phõn t RNA khụng bn, d b phõn hu bi enzyme Rnase + Rnase li cú mt khp ni ( u ngún tay, nc bt, khụng khớ) + Rnase l mt enzyme cú hot tớnh cao, bn nhit Do ú: Thao tỏc tỏch chit RNA tt nht l iu kin vụ trựng, trỏnh tip xỳc bng tay trn Phng phỏp tỏch chit RNA ton phn cng tng t DNA Ch khỏc l bc cui cựng dựng enzyme Dnase loi b DNA Tỏch chit mRNA - Da vo phõn t mRNA cú uụi poly A - Do ú sau tỏch chit c RNA ton phn, cho qua ct sc ký ỏi lc (oligod T-cellulose hoc cỏc viờn bi t gn on oligod T) - mRNA cú uụi poly A s liờn kt b sung vi on oligod T - Dựng dung dch ct, cỏc rRNA, tRNA s b trụi ch cũn mRNA c gi li - Sau ú dựng dd cú nng mui thp ct hoc li tõm s thu c cỏc phõn t mRNA 1.2 Cỏc phng phỏp phõn tớch nh tớnh v nh lng axớt nucleic 7.2.1 Phng phỏp nh lng bng quang ph k - Nguyờn tỏc ca phng phỏp da vo s hp th ỏnh sỏng t ngoi bc súng 260nm ca base purin v pyrimidine Protein hp th bc súng ch yu 280nm - Giỏ tr mt quang ph bc súng 260nm (OD260nm Optical Density 260nm) ca cỏc mu o c xỏc nh da vo tng quan sau: - n v OD260nm tng ng vi nng l: + 50àg/ml cho dung dich DNA si ụi + 40àg/ml cho dung dich DNA hay RNA si n - T l OD260nm/OD280n = 1,8 2,0 thỡ DNA hay RNA c xem l sch protein 1.2.2 Phõn tớch nh tớnh bng Phng phỏp in di Nguyờn tc ca in di: - Da vo c tớnh phõn t (DNA, RNA) mang in tớch õm - Protein cng mang in tớch õm * Do ú t chỳng mt in trng, chỳng s di chuyn v cc dng ca in trng - Tc di chuyn ph thuc vo: + in tớch, kớch thc v cu trỳc khụng gian ca phõn t + Nng ca cht cu thnh gel - Cú loi gel: + Gel agarose dựng in di axớt nucleic + Gel polyacrylamide dựng in di axit nucleic v protein - Vic chn loi gel v nng gel tu thuc vo kớch thc on axớt nucleic cn phõn tỏch Gel agarose: - õy l loi gel thụng dng nht, s dng n gin - Dựng tỏch cỏc on (DNA, RNA) cú kớch thc t 0,2-20Kb - Gel trờn mt giỏ th nm ngang v in di theo phng nm ngang - Gel sau in di c nhum vi cht ethidium bromide (cc c), EtBr xen vo gia cỏc base v soi di tia UV ( 300nm) axit nucleic s cú mu da cam Gel polyacrylamide - Dựng tỏch cỏc on (DNA, RNA cú khớch thc nh di 1000 cp base - Thao tỏc phc hn gel agarose - Mc ớch s dng: + Tớnh sch cỏc on oligonucleotide tng hp + Xỏc nh trỡnh t DNA + Tỏch on DNA nh ( k thut SSR, AFLP, RFLP) + in di protein - Gel c gia hai tm thu tinh v in di theo chiu thng ng - Thng nhum bc,cú nhy cao [...]...1.2 Các phương pháp phân tích định tính và định lượng axít nucleic 7.2.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế - Nguyên tác của phương pháp dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của base purin và pyrimidine Protein hấp thụ ở bước sóng chủ yếu ở 280nm - Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu đo được xác định dựa vào tương quan... + Gel agarose dùng điện di axít nucleic + Gel polyacrylamide dùng để điện di axit nucleic và protein - Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích thước đoạn axít nucleic cần phân tách Gel agarose: - Đây là loại gel thông dụng nhất, sử dụng đơn giản - Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA) có kích thước từ 0,2-20Kb - Gel đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phương nằm ngang - Gel sau... nhuộm với chất ethidium bromide (cực độc), EtBr xen vào giữa các base và soi dưới tia UV (λ ≈ 300nm) axit nucleic sẽ có màu đỏ da cam Gel polyacrylamide - Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000 cặp base - Thao tác phức tạp hơn gel agarose - Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ ( trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…)... hay RNA được xem là sạch protein 1.2.2 Phân tích định tính bằng Phương pháp điện di Nguyên tắc của điện di: - Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm - Protein cũng mang điện tích âm * Do đó khi đặt chúng trong một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường - Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào: + Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của phân tử + Nồng độ của chất... - Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ ( trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…) + Điện di protein - Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo chiều thẳng đứng - Thường nhuộm bạc,có độ nhạy cao ... cột li tâm thu phân tử mRNA 1.2 Các phương pháp phân tích định tính định lượng axít nucleic 7.2.1 Phương pháp định lượng quang phổ kế - Nguyên tác phương pháp dựa vào hấp thụ ánh sáng tử ngoại... RNase) 1.1.1 Phương pháp tách chiết DNA - DNA có kích thước lớn cần tránh tách nhân gây đứt gãy - DNA genome (ĐV, TV) sau tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb) • Phương pháp tách chiết...1.1 Các phương pháp tách chiết axít nucleic • Mục tiêu: Thu nhận phân tử axít nucleic nguyên vẹn tối đa không bị đứt gãy tác nhân học hoá