ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MAI THỊ NHUNG Tên đề tài: “ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI DẦU NƯỚC (Dipterocarpus Alatus Roxb.ex G Don) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR (SSRs) Ở TỈNH ĐỒNG NAI” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : LTK8 CNSH Khoá học : 2012 – 2014 Giáo viên hướng dẫn : Th.S Vũ Đình Duy Giáo viên hướng dẫn : Th S Lương Thị Thu Hườngáo viên hướng dẫ:1.ThS Vũ Đình Duy Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Được đồng ý ban giám hiệu nhà trường Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, em thực đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb.ex G Don) thị phân tử SSR (SSRs) tỉnh Đồng Nai”, phòng thí nghiệm “ Phân loại thực nghiệm Đa dạng nguồn gen” Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.NCS Vũ Đình Duy ThS Lương Thị Thu Hường tận tình hướng dẫn vào tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận Em xin trân thành cảm ơn TS Nguyễn Minh Tâm toàn thể cán phòng “ Phân loại thực nghiệm Đa dạng nguồn gen” chia sẻ, giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực tập Cuối em xin trân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, chỗ dựa tinh thần cho em suốt trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Thái nguyên, ngày tháng Sinh viên Mai Thị Nhung năm 2014 MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Mục đích nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm loài Dầu nước 2.1.1 Phân loại khoa học .3 2.1.2 Đặc điểm sinh học – sinh thái 2.1.3 Nơi sống .5 2.1.4 Công dụng 2.1.5 Vấn đề bảo tồn nguồn gen Dầu nước 2.2 Đa dạng di truyền quần thể thực vật 2.2.1 Khái niệm đa dạng di truyền quần thể 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến đa dạng di truyền .7 2.3 Một số thị phân tử sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 10 2.3.1 Chỉ thị AFLP 10 2.3.3 Chỉ thị SSR .11 2.3.3 Chỉ thị RFLP 11 2.3.4 Chỉ thị RAPD 12 2.3.5 Chỉ thị ISSR 13 2.3.6 Sử dụng thị lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 14 2.4 Nghiên cứu nước đa dạng di truyền 14 2.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 15 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2 Thiết bị, hóa chất dụng cụ 17 3.2.1 Thiết bị .17 3.2.2 Hóa chất 18 3.2.3 Dụng cụ 18 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 3.4 Nội dung nghiên cứu .18 3.5 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 19 3.5.1 Phương pháp tách chiết tinh DNA tổng số 19 3.5.2 Phương pháp điện di gel agarose 1% 21 3.5.3 Nhân DNA kỹ thuật PCR 21 3.5.4 Phương pháp điện di sản phẩm PCR - SSR gel polyacrylamide 5% 22 3.5.5 Phân tích số liệu .23 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết khuếch đại trình tự SSR quần thể Dầu nước…………………24 4.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 24 4.1.2 Nhân DNA kỹ thuật PCR - SSR điện di sản phẩm PCR 27 4.2 Đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước .28 4.2.1 Phân tích đa hình di truyền DNA mẫu Dầu nước 28 4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước 29 4.2.3.Đề xuất số giải pháp bảo tồn phục hồi loài 34 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN AFLP : Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid) : Đa hình độ dài đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) bp : Cặp bazơ (base pair CR : Loài nguy cấp ISSR : Trình tự lặp đơn giản ngẫu nhiên (interal simple sequence repeat) NJ : Phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining Method) PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) : Đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified RADP Polymorphic DNA) : Đa hình độ dài đoạn DNA hạn chế (Restriction Fragment Length RFLP Polymorphism) SSR : Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats) UPGMA : Phân tích Unweighted Pair Group Method UV : Ánh sáng tử ngoại VU : Loài nguy cấp Quần thể NT : Núi Tượng DT : Đào Tiên MD : Mã Đà TP : Tân Phú DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Địa điểm số mẫu Dầu rái (D alatus) thu thập 16 Bảng 3.2 Danh sách mồi SSR dùng nghiên cứu 17 Bảng 3.3 Thành phần đệm rửa (washing buffer): pha 10ml nước cất vô trùng 20 Bảng 3.4 Thành phần đệm tách chiết (Extraction buffer): pha 10ml nước cất vô trùng 20 Bảng 4.1 Kết đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm nồng độ DNA tổng số 45 mẫu nghiên cứu 26 Bảng 4.2 Giá trị PIC tỉ lệ phân đoạn đa hình 45 cá thể Dầu nước 29 Bảng 4.3 Đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước 30 Bảng 4.4 Hệ số tương đồng (trên) khoảng cách di truyền (dưới) theo Nei (1972) cho cặp quần thể loài Dầu rái 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Vườn quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai Hình 2.2 Dầu rái Dipterocarpus alatus roxb ex Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số đại diện mẫu Dầu nước nghiên cứu 25 Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR - SSR gel Polyacrylamide % (A: Mồi P193, B: P214, C: P258, D: P226; M: marker phân tử 100bp; Giếng 1-14: tên mẫu Dầu rái) 28 Hình 4.3 Biểu đồ hình sở khoảng cách di truyền 45 cá thể loài Dầu nước tính theo hệ số di truyền Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA 32 Hình 4.4 Phân tích NJ sở khoảng cách di truyền quần thể loài Dầu nước 34 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Dầu nước hay gọi Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb ex G Don) loài thuộc chi Dầu (Dipterocarpus), họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố miền trung miền nam Việt Nam mở rộng sang Campuchia, Lào, Myanmar, Philippines, Thái Lan Ấn Độ [10] Dầu nước loài đóng vai trò chủ đạo hệ sinh thái kinh tế khu rừng mưa vùng đất thấp phía Nam Việt Nam Dầu nước sử dụng rộng rãi xây dựng công nghiệp, chúng sử dụng nguồn tinh dầu có giá trị Trong năm gần đây, giá trị thương mại nhu cầu sử dụng ngày nhiều người dân địa phương loài thực vật nên chúng bị khai thác mức Hơn nữa, áp lực tăng trưởng kinh nên diện tích rừng ngày suy giảm để phục vụ cho mục đích khác người.Theo tiêu chí IUCN 2013 [30] loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb ex G Don) xếp bậc đe dọa mức độ nguy cấp có phân bố hẹp, số cá thể trưởng thành lại chất lượng xấu, tái sinh tự nhiên ít, bị khai thác chết dần môi trường sống bị xâm phạm thu hẹp Cũng lý trên, Việt Nam loài nằm sách đỏ Việt Nam năm 2007 mức độ nguy cấp[7] Do có giá trị cao mặt khoa học kinh tế, việc bảo tồn phục hồi loài Dầu nước yêu cầu cấp thiết đặt cho nhà khoa học nhà quản lý Để góp phần đưa giải pháp bảo tồn phục hồi loài, đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước có ý nghĩa quan trọng Mức độ đa dạng di truyền khả tồn loài tương lai, mà tiềm tiến hoá loài Hiện nay, có nhiều thị phân tử (RADP, RFLP, ISSR, SSR, ) sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể loài thực vật Trong đó, kỹ thuật SSR (SSRs) nhanh chóng trở thành kỹ thuật hữu hiệu sử dụng rộng rãi nghiên cứu Với việc ứng dụng thị SSR để nghiên cứu sâu đa dạng di truyền, đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cuả loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb.ex G Don) thị phân tử SSR (SSRs) tỉnh Đồng Nai” thực Mục tiêu nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử SSR để điều tra mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Dầu rái (D alatus) sống tự nhiên tỉnh Đồng Nai kết cung cấp thông tin cần thiết cho việc đưa giải pháp hữu hiệu để bảo tồn loài, phục hồi sử dụng bền vững loài cộng đồng dân cư địa phương 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Hiểu rõ chế làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể loài tác động người 1.3 Mục đích nghiên cứu Xác định mức độ xói mòn tính đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb ex G Don) điều kiện môi trường kích thước quần thể khác 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Là sở ban đầu nghiên cứu di truyền quần thể loài, dự báo sinh thái kinh tế - xã hội để thống lập chiến lược bảo tồn loài bền vững Góp phần quan trọng chiến lược bảo tồn, kết hợp chặt chẽ quản lý quần thể loài hoạt động bảo tồn loài chuyển vị nguyên vị 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nâng cao kiến thức bảo tồn đa dạng sinh học giúp cho nhà quản lý đưa giải pháp bảo vệ giá trị đa dạng sinh học cách hiệu nhất, với người dân địa phương việc phục hồi nơi sống loài bị đe doạ bảo tồn loài Góp phần tăng thu nhập người dân địa phương liên quan đến bảo tồn hiệu giá trị đa dạng sinh học Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm loài Dầu nước 2.1.1 Phân loại khoa học [10] Giới (regnum): Plantae Ngành (phylum): Angiospermae Lớp (class): Eudicots Bộ (order): Malvales Họ (familia): Dipterocarpaceae Chi (genus): Dipterocarpus Loài (species): alatus Hình 2.1 Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Vườn quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai 28 Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR - SSR gel Polyacrylamide % (A: Mồi P193, B: P214, C: P258, D: P226; M: marker phân tử 100bp; Giếng 1-14: tên mẫu Dầu rái) 4.2 Phân tích đa dang di truyền quần thể loài Dầu nước 4.2.1 Phân tích đa hình di truyền DNA mẫu Dầu nước Kết điện di gel polyacrylamide 5% sản phẩm PCR cho thấy locus có nhiều allele với kích thước nhỏ số lượng khác Theo kết thay đổi số lần lặp lại đơn vị cách ngẫu nhiên Kết trình bày bảng 4.2 Phân tích đa hình phân tử mẫu Dầu nước với chín cặp mồi SSR nhận 19 allele đa hình tổng số 22 allele từ phản ứng PCR – SSR chiếm 85,19 % allele đồng hình chiếm 14,81% Kích thước allele khoảng từ 100 bp đến 300 bp Số lượng allele với mồi xê dịch từ đến 3, hầu hết mồi cho số lượng allele thấp, trung bình 2,44 allele Các mồi khác cho tỷ lệ đa hình 29 khác nhau: cặp mồi P258 P193 cho allele có allele đa hình chiếm 50% allele đồng hình chiếm 50% Tương tự cặp mồi P214 cho allele, tỷ lệ đa hình 66,67% cặp mồi lại có tỷ lệ đa hình 100% Với chín cặp mồi SSR cho thấy, 100% cặp mồi tính đa hình với giá trị PIC dao động từ 0,039 (P120) đến 0,446 (P293), trung bình 0,283 Giá trị hàm lượng thông tin đa hình (PIC) = 0,283 mức độ khác di truyền cá thể nghiên cứu thấp (Bảng 4.2) Qua kết phân tích đa hình cho thấy tỷ lệ đa hình cặp mồi khác chúng phù hợp cho việc phân tích đa hình di truyền Dầu nước Bảng 4.2 Giá trị PIC tỉ lệ phân đoạn đa hình 45 cá thể Dầu nước TT Mồi PIC Số allele đa hình P120 0,039 Số allele đồng hình P170 0,422 3 P193 0,276 P214 Số allele Tỷ lệ đa hình (%) 100,00 100,00 1 50,00 0,415 66,67 P226 0,367 3 100,00 P258 0,158 1 50,00 P293 0,446 3 100,00 Shc07 0,124 2 100,00 Shc11 0,299 2 100,00 0,283 19 22 85,19 Tổng 4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước Giá trị alen trung bình cho locus (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) kỳ vọng (He), tương ứng tìm thấy cho quần thể loài trình bày (Bảng 4.3) Số allele tìm thấy mức độ loài trung bình 2,45 cho loài Dầu rái Tuy nhiên, có khác số allele quần thể không 30 đáng kể Các giá trị đa dạng di truyền bao gồm A = 2,45, H0 = 0,265 (0,248 - 0,381) He = 0,288 (0,281- 0,298) (Bảng 4.3) Các allele phổ biến (tần số allele > 0.8 ) tìm thấy locus đa hình cho ba quần thể (Đảo Tiên, Núi Tượng, Tân Phú ) locus cho quần thể Mã Đà Ở cấp độ quần thể, bốn quần thể Đồng Nai có mức đa dạng di truyền cao Trong tất nhóm nghiên cứu, ngoại trừ hai quần thể Mã Đà Tân Phú có hệ số sinh sản cận noãn có ý nghĩa (Fis > 0.1), quần thể lại cho thấy dư thừa gen đồng hợp tử giao phối cận huyết Bảng 4.3 Đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước N Đảo Tiên 23 2.5 0.252 0.298 0.157* Núi Tượng 27 2.6 0.248 0.291 0.149* Mã Đà 32 2.3 0.281 0.283 0.005 Tân Phú 31 2.4 0.279 0.281 0.004 2.45 0.265 0.288 Trung bình A Ho He Fis Quần thể (N: kích thước mẫu, A: số alen lô cút, H0: tần số gen dị hợp tử quan sát; He: tần số gen dị hợp tử kì vọng, Fis-Hệ số cận noãn; p[...]... 2.2 Đa dạng di truyền quần thể thực vật 2.2.1 Khái niệm về đa dạng di truyền quần thể Đa dạng di truyền là tập hợp tất cả các gen khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen... tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trường hợp cực đoan, đó là sự tiệt chủng của loài - Ý nghĩa của nghiên cứu đa dạng di truyền Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp đánh giá sự đa dạng, thành phần các kiểu gen trong tự nhiên, từ đó đề ra kế hoạch khai thác và bảo tồn hợp lý Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp cho việc chọn giống và lai tạo giống g c có kiểu gen khác nhau Từ những hiểu biết... phòng Phân loại thực nghiệm và đa dạng nguồn gen của Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam từ 01/03/2014 – 07/06/2014 3.4 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khuếch đại các trình tự SSR của 4 quần thể Dầu nước - Tách chiết DNA tổng số và điện di kiểm tra sản phẩm - Nhân các đoạn SSR của các mẫu Dầu nước bằng kỹ thuật PCR 19 Nội dung 2: Phân tích đa dạng di truyền các quần thể loài Dầu nước - Phân tích đa hình di truyền. .. hiểu biết về nghiên cứu đa dạng di truyền, là cơ sở cho việc tạo ra đựơc những giống mới bằng công nghệ di truyền Sự đa dạng di truyền nói riêng, đa dạng sinh vật nói chung là điều kiện cho sự phát triển và tồn tại lâu dài của sự sống trên trái đất, vì vậy bảo vệ và phát triển đa dạng sinh học là bảo vệ chính chúng ta Nhờ nghiên cứu đa dạng di truyền, giúp ta biết đựoc tình trạng nguy cơ của các sinh... SSR dùng trong nghiên cứu [ Ký hiệu Trình tự lặp P193 (AG)15 P226 (GA)24 P214 (AG)15 P293 (GA)25 P258 (TA)8 P120 (AC)9 P170 (GA)6 Trình tự mồi F-5’-CTTCCCTAAATTCCCCAATGTT-3’ R-5’-TAATGGTGTGTGTACCAGGCAT-3’ F-5’-ACAATGAAACTTGACCACCCAT-3’ R-5’-CAAAAGGACATACCAGCCTAGC-3’ F-5’-TAGGGCATATTGCTTTCTCATC-3’ R-5’-CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA-3’ F-5’-TCTCAAAATCTGCAAAGACAGC-3’ R-5’-CCATAGTCATCACCTCTAATGGTC-3’ F-5’-TGGCAAACAAGCTACTGTTCAT-3’... đa hình di truyền các chỉ thị SSR của các mẫu Dầu nước - Phân tích đa dạng di truyền các quần thể loài Dầu nước - Đề xuất các giải pháp phục hồi loài Dầu nước trên cơ sở những kết quả nghiên cứu về di truyền quần thể của loài 3.5 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 3.5.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle (1987)[26],... đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể Qua đó, sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã được biểu hiện Vì vậy, đa dạng di truyền chính là biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp 7 bazo cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền Đa dạng di truyền giúp cho các loài sinh vật đảm bảo... loài thực vật Việc ứng dụng các chỉ thị lục lạp vào nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật đã được nhiều tác giả quan tâm và đã được tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau 2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Trong những năm g n đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa. .. thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về di truyền quần thể và loài phục vụ công tác bảo tồn và phục hồi[19,21,24,27,33,38] Các tác giả đã phân tích cấu trúc di truyền của một số loài quý hiếm và chỉ ra mức độ đa dạng di truyền bị suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ và cô lập Sự khác nhau về đa dạng di truyền giữa các quần thể là rất lớn Tác giả... dạng di truyền Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể [32] Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả năng thích nghi ... ứng dụng thị SSR để nghiên cứu sâu đa dạng di truyền, đề tài Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cuả loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb.ex G Don) thị phân tử SSR (SSRs) tỉnh Đồng Nai thực... Phân tích đa hình di truyền thị SSR mẫu Dầu nước - Phân tích đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước - Đề xuất giải pháp phục hồi loài Dầu nước sở kết nghiên cứu di truyền quần thể loài 3.5 Phương... dạng thành phần gen cá thể loài loài khác nhau; đa dạng gen di truyền quần thể quần thể Qua đó, đa dạng biến dị di truyền loài, quần xã loài, quần xã biểu Vì vậy, đa dạng di truyền biến dị tổ hợp