Đang tải... (xem toàn văn)
Ở sinh vật đa bào, cơ thể được cấu trúc, tổ chức chặt chẽ theo hệ thống: tế bào -mô - cơ quan - cơ thể. Trước đây người ta cho rằng, hầu hết các tế bào chỉ có thể tồn tại và thực hiện chức năng bên trong cơ thể sống hoàn chỉnh. Thế nhưng, công nghệ nuôi cấy tế bào đã mở ra khả năng đặc biệt mà theo đó các tế bào có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài cơ thể nhưng vẫn đảm bảo được nhiều chức năng sinh học của chúng. Nuôi cấy tế bào chính là kỹ thuật để tạo, nuôi và giữ nguồn tế bào trong điều kiện nhân tạo. Trên đối tượng động vật bậc cao, các nhà nghiên cứu đã rất thành công khi nuôi cấy và sử dụng các dòng tế bào sinh dưỡng (tế bào da, cơ, thần kinh, gan, thận...) hay các khôi mô, cơ quan cơ thể và sử dụng chúng trong các mục đích y, sinh học, nông nghiệp, bảo tồn. Thành công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ở người đã mang đến niềm vui và hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng hiếm muộn trên thế giới. Ở vật nuôi, người ta có thể thu nhận nguồn phôi dồi dào phục vụ cho các nghiên cứu khác như nhân bản động vật, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế bào mầm... Hơn thế nữa, khả năng cấy chuyển phôi, chuyển gene, xác định giới tính của phôi trước khi cấy giúp tạo ra vật nuôi theo ý muốn đã không còn là điều mong ước. Các khả năng này giúp cho công tác chọn giống, tạo giống mới nhanh và có hiệu quả hơn. Đối tượng nghiên cứu là heo được giết thịt tại lò mổ. Và tại sao heo được chọn làm đối tượng nghiên cứu?. Heo là loài động vật có sức sinh sản cao trong mỗi lứa đẻ (7-10 con/lứa). Vấn đề nghiên cứu tạo phôi heo trong điều kiện in vitro là việc làm ít có ý nghĩa về mặt kinh tế, tuy nhiên, về mặt khoa học thì nghiên cứu này nhằm thu đượcnhững kết quả bước đầu về khả năng tạo phôi động vật trong điều kiện in vitro. Ngoài ra, một khi đã làm chủ được khả năng tạo phôi in vitro thì vấn đề khai thác nguồn phôi này để ứng dụng vào các nghiên cứu về sau sẽ được chủ động hơn. Đó là lý do em thực hiện đề tài: “ Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF”. Nội dung đề tài: - Thu nhận giao tử đực và cái. - Nuôi và đánh giá trứng trên môi trường KSOM, môi trường M16, môi trường KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng. - Thu nhận tinh trùng từ phương pháp Swim – up và phương pháp Simple wash. - Thử nghiệm IVF.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN MỞ ĐẦU Ở sinh vật đa bào, thể đƣợc cấu trúc, tổ chức chặt chẽ theo hệ thống: tế bào mô - quan - thể Trƣớc ngƣời ta cho rằng, hầu hết tế bào tồn thực chức bên thể sống hoàn chỉnh Thế nhƣng, công nghệ nuôi cấy tế bào mở khả đặc biệt mà theo tế bào có khả tồn độc lập bên thể nhƣng đảm bảo đƣợc nhiều chức sinh học chúng Nuôi cấy tế bào kỹ thuật để tạo, nuôi giữ nguồn tế bào điều kiện nhân tạo Trên đối tƣợng động vật bậc cao, nhà nghiên cứu thành công nuôi cấy sử dụng dòng tế bào sinh dƣỡng (tế bào da, cơ, thần kinh, gan, thận ) hay khôi mô, quan thể sử dụng chúng mục đích y, sinh học, nông nghiệp, bảo tồn Thành công kỹ thuật thụ tinh in vitro ngƣời mang đến niềm vui hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng muộn giới Ở vật nuôi, ngƣời ta thu nhận nguồn phôi dồi phục vụ cho nghiên cứu khác nhƣ nhân động vật, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế bào mầm Hơn nữa, khả cấy chuyển phôi, chuyển gene, xác định giới tính phôi trƣớc cấy giúp tạo vật nuôi theo ý muốn không điều mong ƣớc Các khả giúp cho công tác chọn giống, tạo giống nhanh có hiệu Đối tƣợng nghiên cứu heo đƣợc giết thịt lò mổ Và heo đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu? Heo loài động vật có sức sinh sản cao lứa đẻ (7-10 con/lứa) Vấn đề nghiên cứu tạo phôi heo điều kiện in vitro việc làm có ý nghĩa mặt kinh tế, nhiên, mặt khoa học nghiên cứu nhằm thu đƣợcnhững kết bƣớc đầu khả tạo phôi động vật điều kiện in vitro Ngoài ra, làm chủ đƣợc khả tạo phôi in vitro vấn đề khai thác nguồn phôi để ứng dụng vào nghiên cứu sau đƣợc chủ động Đó lý em thực đề tài: “ Ảnh hƣởng môi trƣờng phƣơng pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF” Nội dung đề tài: - Thu nhận giao tử đực - Nuôi đánh giá trứng môi trƣờng KSOM, môi trƣờng M16, môi trƣờng KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng - Thu nhận tinh trùng từ phƣơng pháp Swim – up phƣơng pháp Simple wash - Thử nghiệm IVF SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.1 Sơ lược đối tượng nghiên cứu Lợn nhà hay lợn nuôi gia súc đƣợc hóa, đƣợc chăn nuôi để cung cấp thịt Hầu hết lợn nhà có lớp lông mỏng bề mặt da Hình 1.1 Lợn (Sus scrofa domesticus) Vị trí phân loại: - Lớp: Mamalia - Bộ: Artiodactyla - Họ: Suidae - Chi: Sus - Loài: S scrofa - Phân loài: S s domesticus 1.2 Lịch sử phát triển thụ tinh ống nghiệm[4], [12] 1.2.1 Những thí nghiệm IVF IVF đƣợc tiến hành lần thỏ Dauzier cộng (cs) (1954).Kỹ thuật đƣợc Brackett ứng dụng phát triển vào chăn nuôi bò sữa từ 1982.Từ đó, IVF đƣợc nghiên cứu áp dụng rộng rãi nƣớc chăn nuôi phát triển Động vật Năm Tác giả Thỏ 1954-1959 Dauzier, Thibault Chang Chuột túi má 1963 Yanagimachi Chang Chuột nhắt 1969 Yvvamatsu Chang Ngƣời 1978 Steptoe Edvvards Dê 1981 Kim Iritani Bò 1982 Brackett cs Cừu 1983 Wright Bondioli Heo 1986 Chan cs Bảng 1.1 Những thí nghiệm thụ tinh IVF động vật 1.2.2 Lịch sử nuôi phôi heo Invitro Heo động vật đƣợc quan tâm đặc biệt buồng trứng chúng có chứa SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP số lƣợng lớn (hơn 200.000) nang trứng sơ cấp (primordialfollicles) Trong năm đầu thập kỷ 1980, ngƣời ta thu đƣợc phôi invivo từ heo dạng “động vật cho” phôi nuôi phát triển từ giai đoạn tế bào đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) Sau đó, hiểu biết đặc điểm phát triển trứng heo giúp hình thành loại môi trƣờng nuôi trứng chín điều kiện in vitro Năm 1986, Chan cs thành công việc tạo phôi heo in vitro.Sau đó, kỹ thuật nuôi phôi thụ tinh invitro giai đoạn tế bào đến giai đoạn blastocyst đạt đƣợc thành công Đến nay, khả tạo đƣợc động vật từ trình thụ tinh ống nghiệm trứng nuôi chín invitro thành công.Tuy nhiên, khả tạo trứng chín in vitro phục vụ qui trình tạo phôi chƣa hoàn chỉnh Do đó, mục tiêu thập kỷ qua tập trung vào nghiên cứu khả tạo đƣợc trứng chín in vitro 1.3 Cơ sở khoa học thụ tinh ống nghiệm Trong sinh sản hữu tính động vật bậc cao, thụ tinh trình kết hợp tinh trùng trứng để tạo tế bào gọi hợp tử, hợp tử phát triển thành thể mới.Quá trình xảy bên thể mẹ Thụ tinh ống nghiệm trình ngƣời tiến hành kết hợp tinh trùng với trứng để tạo hợp tử, đƣợc thực bên thể mẹ Sau đó, hợp tử đƣợc chuyển vào tử cung để phát triển thành thể 1.3.1 Hệ sinh dục động vật hữu nhũ [1], [2] 1.3.1.1 Hệ sinh dục Hệ sinh dục số động vật có khác số chi tiết nhƣng chủ yếu gồm cấu trúc sau: buồng trứng, hệ thống ống dẫn, tử cung, âm đạo phận sinh dục bên Buồng trứng: dạng cặp nằm hai bên tử cung, dự trữ nang trứng Vòi tử cung: nơi dẫn trứng diễn thụ tinh Tử cung: quan để hợp tử làm tổ phát triển Âm đạo: quan giao hợp Âm hộ: quan sinh dục nằm thể nối liền với âm đạo Buồng trứng động vật hữu nhũ quan dự trữ tế bào mầm sinh dục noãn bào đƣợc hình thành giai đoạn phôi thai Chức đặc biệt buồng trứng sử dụng lần lƣợt nang trứng dự trữ đến cạn kiệt điều tiết hormone.Buồng trứng đảm bảo cho noãn lớn lên đặn rụng trứng, đồng thời chuẩn bị cho tử cung tiếp nhận trứng đƣợc thụ tinh Số lƣợng nang trứng dự trữ buồng trứng loài có khác phát triển dần trình lớn lên cá thể, lớn tuổi số nang trứng có hiệu Ở bò, có 100.000 nang trứng lúc sinh, sau năm giảm 2.500 nang SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP trứng; heo, có 200.000 nang trứng sơ cấp buồng trứng; ngƣời, sơ sinh có khoảng 30.000 - 300.000 nang trứng nguyên thủy, trƣởng thành 400-500 nang 1.3.1.2 Hệ sinh dục đực Gồm cấu trúc sau: Tinh hoàn: dạng cặp, nằm bìu có nhiều ngăn, tiết tinh trùng Mào tinh: nối với tinh hoàn, đƣờng dẫn tinh trùng Ống dẫn tinh: nối với mào tinh Túi tinh: nơi chứa tinh tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch Tuyến tiền liệt: tiết dịch có thành phần tinh dịch Niệu đạo: nằm dƣơng vật, tinh trùng phóng qua niệu đạo Ngay trƣớc thời điểm phóng tinh, tinh trùng di chuyển từ mào tinh vào ống dẫn tinh, ống phóng tinh niệu đạo để ngoài.Trên đƣờng đi, tinh trùng đƣợc hòa với dịch tiết từ tuyến phụ để tạo thành tinh dịch 1.4 Quá trình sinh giao tử 1.4.1 Quá trình sinh noãn[1], [3] Một noãn bào trƣởng thành sẵn sàng cho thụ tinh đƣợc phóng thích từ nang noãn trƣởng thành buồng trứng Sự trƣởng thành noãn có liên hệ mật thiết với trƣởng thành nang noãn 1.4.1.1 Sự hình thành phát triển nang noãn Hình thành nang trứng trình diễn biến nối tiếp giai đoạn phát triển khác nang trứng từ khỏi nơi dự trữ, phát triển thành tế bào trứng Quá trình diễn nhƣ sau: từ nang trứng nguyên thủy (primordial iollicle) trở thành nang độ giai đoạn chuyển tiếp cho hình thành nang trứng sơ cấp (preantral follicle) đến nang thứ cấp (antral follicle) Sự tăng trƣởng thành thục nang trứng buồng trứng thể hàng loạt biến đổi mức phân tử thành phần khác nang nhƣ noãn bào, lớp tế bào hạt lớp tế bào vỏ Các tƣợng đƣợc chi phối nhân tố khác bên buồng trứng, bên nang tín hiệu hormone SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 1.2 Cấu trúc nang noãn trưởng thành trước phóng noãn 1.4.1.2 Nội tiết nang tăng trƣởng Sự tăng trƣởng, thành thục, rụng trứng hoàng thể hóa nang trƣởng thành phụ thuộc vào yếu tố: Sự điều tiết thích hợp Hàm lƣợng đủ Tỷ lệ phù hợp Follicle Stimulating Hormone (FSH) Luteinizing Hormone (LH) huyết Trong đó, FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu hình thành xoang nang, kích thích trình phân bào nguyên nhiễm tế bào hạt (có hỗ trợ Estradiol) trình hình thành dịch nang.LH kích thích tế bào vỏ thụ quan LH diện từ lúc bắt đầu hình thành tế bào vỏ 1.4.1.3 Sự hình thành phát triển noãn Sự phát triển noãn gồm giai đọan: Sự di chuyển tế bào mầm vào quan sinh dục Sự gia tăng số lƣợng tế bào mầm nguyên phân Sự giảm chất liệu di truyền giảm phân Sự trƣởng thành cấu trúc chức noãn Trong trình giảm phân noãn có giai đoạn noãn trạng thái ngừng tăng trƣởng (block): Block thứ noãn bƣớc vào giai đoạn tiền kỳ (prophase) giảm phân I, cho noãn sơ cấp giai đoạn túi mầm (germinal vesicle- GV) Các noãn vƣợt qua giai đoạn có xuất đỉnh LH tức cá thể đến tuổi trƣởng thành sinh dục Block thứ hai giai đoạn trung kỳ (metaphase-MI) giảm phân II (MII), cho noãn thứ cấp giai đoạn MII Noãn vƣợt qua đƣợc giai đoạn MII có thụ tinh tinh trùng SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.4.1.4 Mối tƣơng quan kích thƣớc nang phát triển noãn Khả nang noãn sơ cấp tiếp tục phân chia giảm nhiễm để tiến tới giai đoạn trƣởng thành (MII) phóng noãn phụ thuộc mật thiết vào kích thƣớc nang chứa noãn Các thí nghiệm in vitro in vivo cho thấy noãn sơ cấp tiếp tục phân chia giảm phân noãn nang nguyên thủy hay nang sơ cấp Chỉ có noãn GV đƣợc chứa nang trƣớc phóng noãn có kích thƣớc bình thƣờng có khả tiếp tục phân chia giảm phân để trƣởng thành.Những noãn GV chứa nang thứ cấp tiếp tục phân chia giảm phân đến giai đoạn MI, sau dừng lại Đây sở cho việc thu nhận loại nang trứng đạt kích cở trƣởng thành từ buồng trứng, phục vụ cho việc nuôi cấy in vitro 1.4.2 Sự trưởng thành noãn 1.4.2.1 Sự trƣởng thành nhân Ngay sau trình giảm phân, noãn GV qua giai đoạn: tan biến túi mầm (GVBD); metaphasel (MI) metaphase II (Mll), sau phóng noãn Thời gian noãn trƣởng thành qua giai đoạn khác tùy loài, ngƣời, noãn GV trải qua giai đoạn GVBD 15 giờ, metaphase I (MI) 20 metaphase II (MII) 35 sau đỉnh LH.Sự phóng noãn xảy khoảng 38 sau đỉnh LH.Ở bò, từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII khoảng 19 giờ.Ở heo, thời gian khoảng 38 Chính khác thời gian trƣởng thành noãn sở cho việc giải thích để nuôi trƣởng thành tế bào trứng điều kiện in vitro cần khoảng 18-20 bò 38-44 heo [15] 1.4.2.2 Sự trƣởng thành tế bào chất Trong trình này, bào quan tế bào chất đƣợc tổ chức lại chuẩn bị cho trình thụ tinh tổng hợp protein đƣợc xếp để chuẩn bị cho phát triển phôi.Nhƣ vậy, trƣởng thành nhân tế bào chất tiêu chuẩn cho trƣởng thành trứng điều kiện in vivo Đây sở thu nhận trứng trƣởng thành điều kiện in vitro 1.4.2.3 Sự phóng noãn [7] Sự phóng noãn xảy vào cuối kỳ tăng trƣởng, giai đoạn này, nang trứng trội có khả đáp ứng với tăng lên mạnh đột ngột kích dục tố thay đổi hoàn toàn cấu trúc nó, dẫn đến tƣợng rách nang giải phóng noãn bào Đồng thời, noãn bào xảy thay đổi đáng kể tạo noãn bào trƣởng thành hoàn toàn sẵn sàng cho thụ tinh: Noãn tách rời khỏi màng trong, tạo khoảng trống quanh noãn hoàng Trong nhân noãn, nhiễm sắc thể kết thúc giảm phân I, thể cực thứ đƣợc phóng thích vào khoảng trống quanh noãn hoàng Giảm phân II khởi động dừng lại trung kì II Giảm phân II tiếp tục sau thụ tinh với phóng thích thể cực SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP thứ hai Noãn không thụ tinh bị thoái hóa Mỗi trứng rụng đƣợc bao xung quanh màng suốt tế bào quanh noãn Các tế bào quanh noãn tiếp tục biệt hóa thành tế bào tiết steroid để trì mang thai trứng đƣợc thụ tinh 1.5 Quá trình sinh tinh[1], [2], [5], [7] Tinh trùng đƣợc hình thành từ ống sinh tinh tinh hoàn Đây loại tế bào thích ứng với chức vận chuyển mang gen đơn bội 1.5.1 Cấu tạo tinh trùng Mặc dù tinh trùng có hình dạng khác tùy loài Nhƣng tinh trùng có cấu tạo gồm: đầu, cổ, thân đuôi 1.5.1.1 Phần đầu Ngay sau tiền tinh trùng đƣợc hình thành chúng có đặc điểm tế bào biểu mô nhƣng sau nhanh chóng tăng chiều dài để hình thành tinh trùng với cấu trúc gồm bốn phần: phần đầu, phần cổ, phần thân phần đuôi Hình 1.3.Cấu trúc tinh trùng Phần đầu: Có hình bầu dục, lớp bào tƣơng mỏng màng tế bào bao quanh bề mặt, gồm hai phần nhân thể đỉnh (acrosome) Nhân: chứa nhiễm sắc thể dạng kết đặc cao, ARN, chiếm 65% thể tích phần đầu, có kích thƣớc lớn, chứa đầu vật chất di truyền dezoxyribonucleoprotein với nồng độ cao Thể đỉnh (Acrosome): Hai phần hai mặt phía trƣớc đầu tinh trùng đƣợc bao bọc “mũ” dày gọi acrosome hình thành từ máy Golgi Acrosome chứa enzyme thủy phân nhƣ hyaluronidase proteolytic enzyme có khả phân giải protein Những enzyme đóng vai trò quan trọng trình xâm nhập tinh trùng vào trứng 1.5.1.2 Phần cổ Phần cổ tinh trùng chủ yếu có trung tử đầu trung tử đuôi Rất ngắn, co SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP lại, gắn vào chỗ lõm đáy phía sau thân, chứa nhiều ti thể để cung cấp lƣợng cho đuôi hoạt động Khớp cổ lỏng lẻo, nên tinh trùng lọt vào trứng cổ tách đầu khỏi thân đuôi dễ dàng 1.5.1.3 Phần thân Gồm có sợi trực tế bào chất bao quanh, có tiết diện to phần đuôi Trong ti thể chiếm gần hết tế bào chất đƣợc xếp theo dạng xoắn ốc bao quanh sợi trục Ti thể chứa enzyme oxy hóa oxyphosphoryl hóa chất khác tham gia vào trình chuyển hóa dự trữ lƣợng quan trọng cho tinh trùng 1.5.1.4 Phần đuôi Cấu tạo chủ yếu sợi trục gồm đuôi chóp đuôi.Lông roi kéo dài từ đuôi trung thể thân Cấu trúc trung tâm gồm 11 vi ống đƣợc gọi trục cấu trúc đƣợc bao phủ màng mỏng Trung tử hình thành vi ống đuôi tinh trùng Ti thể quấn chặt lông roi, cung cấp ATP cho đuôi.Đuôi đảm bảo chuyển động Lúc di động liên quan đến trƣợt vi ống sợi trục, di chuyển đƣợc thực nhờ chuyển động co duỗi, lƣợn sóng đập đuôi Đuôi tinh trùng có ba cấu phần chính: - Cấu trúc xƣơng trung tâm gồm 11 vi ống gọi axoneme - Màng tế bào mỏng bao bọc axoneme - Hệ thống ti thể xung quanh axoneme gần phần trƣớc đuôi (phần giáp cổ tinh trùng) Vận động đuôi tinh trùng (theo kiểu vận động roi) giúp tinh tùng di chuyển đƣợc Việc vi ống phía trƣớc phía sau axoneme trƣợt theo chiều dọc Năng lƣợng cần thiết cho trình vận động ATP tổng hợp ti thể cung cấp Tinh trùng bình thƣờng vận động tiến tới với tốc độ ÷ mm/phút.Với khả vận động tinh trùng di chuyển đƣờng sinh dục nữ giới để tìm gặp trứng 1.5.2 Sự sinh tinh trùng Sự sinh tinh trùng gồm giai đoạn: Sinh sản: tinh nguyên bào màng đáy tiến hành phân chia nguyên nhiễm nhiều đợt, tạo dạng tinh nguyên bào A B Tinh nguyên bào B tiền thân tinh bào Sinh trƣởng: giai đoạn tinh bào sơ cấp Chúng tăng kích thƣớc nhân tế bào hình thành đôi nhiễm sắc thể Phát triển: có kỳ phân chia liên tiếp, tinh bào sơ cấp phân chia thành tinh bào thứ cấp, từ phân chia lần thành hai tinh tử Nhƣ vậy, tinh nguyên bào phân chia thành tinh tử Thành thục: tinh tử trải qua giai đoạn tạo hình tinh trùng trở thành tinh trùng thể có chức để gặp kết hợp đƣợc với trứng SVTH: NGUYỄN THANH VŨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.5.2.1 Đặc điểm trình sinh tinh Trong đợt phân bào, phân chia tế bào chất không triệt để Do đó, tế bào hợp thành thể hợp bào giữ liên hệ qua cầu nối tế bào chất Qua đó, ion phân tử lƣu thông qua tất tế bào giúp tinh trùng trƣởng thành đồng 1.5.2.2 Sự trƣởng thành tinh trùng trƣớc thụ tinh Tinh trùng có khả thụ tinh phải trải qua trình “kiện toàn lực thụ tinh” hay “ hoạt hóa tinh trùng”, sau phóng tinh, tinh trùng di động nhƣng chƣa có khả thụ tinh Sự kiện toàn lực thụ tinh đƣợc thực tinh trùng di chuyển đƣờng sinh dục cái, thông qua giai đoạn biến đổi: trình khả hóa, tăng động phản ứng cực đầu Phản ứng khả hóa: làm thay đổi chất bên bề mặt tế bào Do đó, làm màng tế bào ổn định thực phản ứng cực đầu (thể đỉnh) Phản ứng tăng động: kết phản ứng khả hóa làm tinh trùng thay đổi kiểu di động Phản ứng cực đầu: phản ứng kích thích gia tăng nồng độ Ca2+ ngoại bào liên quan đên việc tái tổ chức lại lớp màng phần đầu tinh trùng Sau phản ứng này, enzyme thủy giải từ đầu tinh trùng đƣợc giải phóng, đồng thời để lộ vị trí gắn với màng suốt giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng 1.6 Sự thụ tinh phát triển phôi[5], [10] 1.6.1 Sự thụ tinh Gồm bƣớc: Tinh trùng gắn với lớp màng suốt trứng Tinh trùng thực phản ứng cực đầu Tinh trùng xâm nhập vào bên màng suốt Tinh trùng gắn vào lớp màng bào tƣơng trứng Sự hợp màng trứng tinh trùng hình thành tiền nhân 1.6.1.1 Tinh trùng gắn với lớp màng suôt trứng Tinh trùng xuyên qua lớp cumulus Trƣớc tinh trùng xâm nhập đƣợc vào tế bào trứng, có nhiều (hàng trăm) tinh trùng bám quanh trứng Chúng tiết enzyme hyaluronidase phân hủy lớp tế bào quanh noãn (gồm nhiều vòng tế bào curnulus bao bên vòng rộng tế bào vành tia - corona radiate) Tinh trùng gắn với lớp màng suốt Màng suốt lớp vỏ ngoại bào bao quanh trứng có thành phần glycoprotein, gồm ZPi (200kD), ZP2 (120kD) ZP3 (83kD) SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Summary Statistics for TY LE % NUOI TRUNG TOT THOI GIAN NUOI Count Averag Standard Coeff of Minimu Maximu TRUNG e deviation variation m m 87.766 4.22532 4.81427% 83.3 91.7 72.0 14.7553 20.4935% 55.6 84.2 3 65.066 10.7751 16.5601% 53.1 74.0 61.866 7.78224 12.5791% 53.3 68.5 53.666 9.1309 17.0141% 43.2 60.0 Total 15 68.073 14.5561 21.3829% 43.2 91.7 Multiple Range Tests for TY LE % NUOI TRUNG TOT by THOI GIAN NUOI TRUNG Rang e 8.4 28.6 20.9 15.2 16.8 48.5 Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 3 3 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Homogeneous Groups 53.666 X 61.866 XX 65.066 XX 72.0 XX 87.766 X 69 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Contra Sig Differen st ce 1-2 15.7667 1-3 * 22.7 1-4 * 25.9 1-5 * 34.1 2-3 6.93333 2-4 10.1333 2-5 * 18.3333 3-4 3.2 3-5 11.4 4-5 8.2 * denotes a statistically significant difference +/Limits 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 18.1127 3.4 Thu nhận trứng xấu từ môi trƣờng M16 One-Way ANOVA - TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Dependent variable: TY LE % TRUNG XAU Factor: THOI GIAN NUOI TRUNG Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1970.44 492.611 4.94 0.0185 groups Within 996.507 10 99.6507 groups Total (Corr.) 2966.95 14 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 70 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Summary Statistics for TY LE % TRUNG XAU THOI GIAN NUOI Count Averag Standard Coeff of Minimu Maximu Rang TRUNG e deviation variation m m e 12.233 4.22532 34.5394% 8.3 16.7 8.4 3 28.0 14.7553 52.6976% 15.8 44.4 28.6 3 34.666 10.8969 31.4335% 26.0 46.9 20.9 38.133 7.78224 20.408% 31.5 46.7 15.2 46.333 9.1309 19.707% 40.0 56.8 16.8 Total 15 31.873 14.5576 45.6734% 8.3 56.8 48.5 Multiple Range Tests for TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 3 3 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Homogeneous Groups 12.233 X 28.0 XX 34.666 XX 38.133 XX 46.333 X 71 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Contrast 1-2 1-3 1-4 1-5 2-3 2-4 2-5 3-4 3-5 4-5 Sig Difference -15.7667 * -22.4333 * -25.9 * -34.1 -6.66667 -10.1333 * -18.3333 -3.46667 -11.6667 -8.2 +/- Limits 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 18.1609 * denotes a statistically significant difference 3.5 Thu nhận trứng tốt từ môi trƣờng KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng One-Way ANOVA - TY LE % NUOI TRUNG TOT by THOI GIAN NUOI TRUNG Dependent variable: TY LE % NUOI TRUNG TOT Factor: THOI GIAN NUOI TRUNG Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for TY LE % NUOI TRUNG TOT by THOI GIAN NUOI TRUNG Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1269.74 317.435 8.42 0.0030 groups Within 376.82 10 37.682 groups Total (Corr.) 1646.56 14 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 72 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Summary Statistics for TY LE % NUOI TRUNG TOT THOI GIAN NUOI Count Averag Standard Coeff of Minimu Maximu TRUNG e deviation variation m m 86.666 5.9769 6.89642% 81.7 93.3 75.666 6.01692 7.95188% 69.2 81.1 3 69.7 7.05479 10.1216% 62.8 76.9 61.5 6.16523 10.0248% 55.6 67.9 62.966 5.35755 8.50855% 57.1 67.6 Total 15 71.3 10.8449 15.2102% 55.6 93.3 Multiple Range Tests for TY LE % NUOI TRUNG TOT by THOI GIAN NUOI TRUNG Rang e 11.6 11.9 14.1 12.3 10.5 37.7 Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 3 3 3 Contrast 1-2 1-3 1-4 1-5 2-3 2-4 2-5 3-4 3-5 4-5 Homogeneous Groups 61.5 X 62.966 X 69.7 XX 75.666 XX 86.666 X Sig Difference 11.0 * 16.9667 * 25.1667 * 23.7 5.96667 * 14.1667 * 12.7 8.2 6.73333 -1.46667 +/- Limits 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 * denotes a statistically significant difference SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 73 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.6 Thu nhận trứng xấu từ môi trƣờng KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng One-Way ANOVA - TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Dependent variable: TY LE % TRUNG XAU Factor: THOI GIAN NUOI TRUNG Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1269.74 317.435 8.42 0.0030 groups Within 376.82 10 37.682 groups Total (Corr.) 1646.56 14 Summary Statistics for TY LE % TRUNG XAU THOI GIAN NUOI Coun Avera Standard Coeff of Minimu Maximu Rang TRUNG t ge deviation variation m m e 13.333 5.9769 44.8267% 6.7 18.3 11.6 3 24.333 6.01692 24.7271% 18.9 30.8 11.9 3 30.3 7.05479 23.2831% 23.1 37.2 14.1 38.5 6.16523 16.0136% 32.1 44.4 12.3 37.033 5.35755 14.4668% 32.4 42.9 10.5 Total 15 28.7 10.8449 37.787% 6.7 44.4 37.7 Multiple Range Tests for TY LE % TRUNG XAU by THOI GIAN NUOI TRUNG Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 3 3 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Homogeneous Groups 13.333 X 24.333 XX 30.3 XX 74 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 37.033 38.5 X X Contra Sig Differenc st e 1-2 -11.0 1-3 * -16.9667 1-4 * -25.1667 1-5 * -23.7 2-3 -5.96667 2-4 * -14.1667 2-5 * -12.7 3-4 -8.2 3-5 -6.73333 4-5 1.46667 * denotes a statistically significant difference 3.7 So sánh tỷ lệ trứng tốt Multiple-Sample Comparison Sample 1: DNT Sample 2: KSOM Sample 3: M16 Sample 1: values ranging from 81.7 to 93.3 Sample 2: values ranging from 83.3 to 95.0 Sample 3: values ranging from 83.3 to 91.7 ANOVA Table Source Sum of Df Mean Squares Square Between 17.3089 8.65444 groups Within 179.933 29.9889 groups Total (Corr.) 197.242 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ +/Limits 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 11.1677 F-Ratio P-Value 0.29 0.03592 75 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Summary Statistics Coun Averag Standard t e deviation DNT 86.666 5.9769 KSO 90.0 6.03241 M M16 87.766 4.22532 Total 88.144 4.96541 Multiple Range Tests Coeff of variation 6.89642% Minimu Maximu Rang Stnd m m e skewness 81.7 93.3 11.6 0.818305 6.70268% 83.3 95.0 11.7 -0.825502 4.81427% 83.3 91.7 8.4 5.63326% 81.7 95.0 13.3 0.037009 -0.395241 Method: 95.0 percent LSD Count Mean DNT M16 KSO M Contrast Homogeneous Groups 86.666 X 87.766 X 90.0 X Sig Differen +/ce Limits -3.33333 10.9409 DNT KSOM DNT - M16 -1.1 10.9409 KSOM 2.23333 10.9409 M16 * denotes a statistically significant difference 3.8 So sánh tỷ lệ trứng tốt sau 24 Multiple-Sample Comparison Sample 1: DNT Sample 2: KSOM Sample 3: M16 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 76 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sample 1: values ranging from 69.2 to 81.1 Sample 2: values ranging from 71.1 to 86.0 Sample 3: values ranging from 55.6 to 84.2 ANOVA Table Source Sum of Df Mean Squares Square Between 121.936 60.9678 groups Within 653.893 108.982 groups Total (Corr.) 775.829 Summary Statistics Count Averag Standard Coeff of e deviation variation DNT 75.666 6.01692 7.95188% KSO 80.966 8.54537 10.5542% M M16 72.0 14.7553 20.4935% Total 76.211 9.84777 12.9217% Multiple Range Tests F-Ratio P-Value 0.56 0.5987 Minimu Maximu Rang Stnd m m e skewness 69.2 81.1 11.9 -0.530349 71.1 86.0 14.9 -1.22399 55.6 55.6 84.2 86.0 28.6 -0.832344 30.4 -1.39896 Method: 95.0 percent LSD Count Mean M16 DNT 3 KSO M SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Homogeneous Groups 72.0 X 75.666 X 80.966 X 77 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Contrast Sig Differen +/ce Limits -5.3 20.857 DNT KSOM DNT - M16 3.66667 20.857 KSOM 8.96667 20.857 M16 * denotes a statistically significant difference 3.9 So sánh tỷ lệ trứng tốt sau 36 Multiple-Sample Comparison Sample 1: DNT Sample 2: KSOM Sample 3: M16 Sample 1: values ranging from 62.8 to 76.9 Sample 2: values ranging from 71.9 to 75.0 Sample 3: values ranging from 53.1 to 74.0 Summary Statistics Coun Avera Standard Coeff of t ge deviation variation DNT 69.7 7.05479 10.1216% KSO 73.966 1.78979 2.41972% M M16 65.066 10.7751 16.5601% Total 69.577 7.5584 10.8632% Multiple Range Tests Minimu m 62.8 71.9 Maximu m 76.9 75.0 Rang e 14.1 3.1 Stnd skewness 0.135067 -1.22474 53.1 74.0 20.9 -0.824779 53.1 76.9 23.8 -1.8134 Method: 95.0 percent LSD Count Mean M16 DNT KSOM SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Homogeneous Groups 65.0667 X 69.7 X 73.9667 X 78 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Contrast Sig Differen +/ce Limits -4.26667 14.9987 DNT KSOM DNT - M16 4.63333 14.9987 KSOM 8.9 14.9987 M16 * denotes a statistically significant difference 3.10 So sánh tỷ lệ trứng tốt sau 48 Multiple-Sample Comparison Sample 1: DNT Sample 2: KSOM Sample 3: M16 Sample 1: values ranging from 55.6 to 67.9 Sample 2: values ranging from 73.8 to 80.0 Sample 3: values ranging from 53.3 to 68.5 ANOVA Table Source Sum of Df Mean Squares Square Between 413.962 206.981 groups Within 220.533 36.7556 groups Total (Corr.) 634.496 Summary Statistics Coun Avera Standard Coeff of t ge deviation variation DNT 61.5 6.16523 10.0248% KSO 76.066 3.41955 4.49547% M M16 61.866 7.78224 12.5791% Total 66.477 8.90573 13.3965% Multiple Range Tests SVTH: NGUYỄN THANH VŨ F-Ratio P-Value 5.63 0.0420 Minimu m 55.6 73.8 Maximu m 67.9 80.0 Rang e 12.3 6.2 Stnd skewness 0.256361 1.18246 53.3 68.5 15.2 -0.741709 53.3 80.0 26.7 -0.10745 79 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Method: 95.0 percent LSD Count Mean DNT M16 3 KSO M Contrast DNT KSOM DNT - M16 Homogeneous Groups 61.5 X 61.866 X 76.066 X Sig Differenc +/e Limits * -14.5667 12.1125 12.1125 0.366667 14.2 12.1125 KSOM * M16 * denotes a statistically significant difference 3.11 So sánh tỷ lệ trứng tốt sau 60 Multiple-Sample Comparison Sample 1: DNT Sample 2: KSOM Sample 3: M16 Sample 1: values ranging from 57.1 to 67.6 Sample 2: values ranging from 63.2 to 80.7 Sample 3: values ranging from 43.2 to 60.0 ANOVA Table Source Sum of Df Mean Squares Square Between 549.269 274.634 groups Within 381.613 63.6022 groups Total (Corr.) 930.882 SVTH: NGUYỄN THANH VŨ F-Ratio P-Value 4.32 0.0689 80 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Summary Statistics Count Averag Standard e deviation DNT 62.966 5.35755 KSO 72.8 8.87299 M M16 53.666 9.1309 Total 63.144 10.787 Multiple Range Tests Coeff of variation 8.50855% Minimu Maximu Rang Stnd m m e skewness 57.1 67.6 10.5 -0.693688 12.1882% 63.2 80.7 17.5 -0.587265 17.0141% 43.2 60.0 16.8 -1.14524 17.0831% 43.2 80.7 37.5 -0.215405 Method: 95.0 percent LSD Count Mean M16 DNT KSO M Contrast Homogeneous Groups 53.666 X 62.966 XX 72.8 X Sig Differen +/ce Limits -9.83333 15.9335 DNT KSOM DNT - M16 9.3 15.9335 KSOM * 19.1333 15.9335 M16 * denotes a statistically significant difference 3.12 So sánh hai phƣơng pháp thu nhận tinh trùng Multiple-Sample Comparison Sample 1: RUA DON GIAN SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 81 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sample 2: SWIM UP Sample 1: values ranging from 56.67 to 92.0 Sample 2: values ranging from 38.46 to 52.17 ANOVA Table Source Sum of Df Mean Squares Square Between 2124.6 2124.6 groups Within 903.103 112.888 groups Total (Corr.) 3027.7 Summary Statistics Cou nt RUA DON GIAN SWIM UP Avera ge 72.69 43.54 Total 10 58.11 Multiple Range Tests Standard deviation 14.0552 Coeff of variation 19.3348% 5.31279 12.2015% 18.3415 31.5591% F-Ratio P-Value 18.82 0.0025 Minim Maxim Ran um um ge 56.67 92.0 35.3 38.46 52.17 13.7 38.46 92.0 53.5 Stnd skewness 0.257307 1.18352 0.928788 Method: 95.0 percent LSD SWIM UP RUA DON GIAN Count Mean Homogeneous Groups 43.54 X 72.69 X Contrast RUA DON GIAN SWIM UP * denotes a statistically significant difference SVTH: NGUYỄN THANH VŨ Sig Differen +/ce Limits * 29.152 15.4958 82 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 83 [...]... ứng quá trình phân bào giảm nhiễm các tế bào mầm phôi chuột 1.7.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM 1.7.6.1 Thời gian thu nhận mẫu buồng trứng Nhìn chung, buồng trứng của heo trƣớc thành thục về tính dục đƣợc thu nhận từ lò mổ là nguồn tế bào trứng cho các kỹ thu t IVM Nhiệt độ vận chuyển và thời gian từ khi buồng trứng đƣợc thu nhận đến khi hút tế bào trứng có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng... vào noãn 1.9.1 Hệ thống thụ tinh invitro 1.9.1.1 Điều kiện - Nhiệt độ [1] Nhiệt độ ủ trong quá trình thụ tinh là nhân tố quyết định cho tỷ lệ thụ tinh, nếu 37°C thích hợp cho các noãn bào chuột và ngƣời thì nhiệt độ ấy lại không phù hợp cho những loài gia súc có nhiệt độ cơ thể 3 8-3 9°C - Thời gian thụ tinh [10] Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt nếu tiến hành thụ tinh cho trứng khoảng 4 giờ sau... quá nhiều tinh trùng sẽ gây ảnh hƣởng xấu đối với sự phát triển của phôi giai đoạn sớm - Loại tinh trùng chết ra khỏi môi trƣờng sau khi thụ tinh [6] Các nghiên cứu của Grupen và Nottle (2000) cho thấy sự hiện diện của tinh trùng chết trong môi trƣờng sau thời gian thụ tinh sẽ ảnh hƣởng đến sự phát triển phôi Do đó, cần chuyển tế bào trứng cùng với tinh trùng bám vào màng trong suốt khỏi phần tinh trùng... trưởng thành của trứng[6], [10], [12] Nhìn chung, quá trình nuôi chín tế bào trứng có thể chia làm hai giai đoạn, đó là giai đoạn chín nhân và chín tế bào chất: Chín nhân là thu t ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn M II Chín bào tƣơng là thu t ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trƣớc làm tổ, định vị lại... và tế bào hạt luôn đƣợc duy trì Do đó, sự hiện diện các tế bào hạt là tiêu chuẩn để lựa chọn các tế bào trứng cho quy trình IVM Trên cơ sở đó, cách phân loại trứng thu nhận từ buồng trứng đƣợc dựa trên độ dày, mỏng của tế bào hạt bao quanh trứng Trứng đƣợc phân làm 3 loại: Loại A: có từ 3-5 lớp tế bào cumulus bao kín quanh tế bào trứng Loại B: có ít hơn 3 lớp tế bào cumulus bao quanh một phần tế. .. dính 33 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Lần 5 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 - - - - - - - Bảng 2.3.2 Đánh giá chất lượng tinh trùng heo Độ di động (%) Tổng số tinh trùng tiến thẳng PR (%) NP (%) IM (%) (tỷ/ xuất tinh) - 2.4.2 Thu nhận giao tử cái 2.4.2.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ Tại lò mổ, thực hiện việc thu nhận trực tiếp các bộ phận sinh dục của heo cái Dùng kéo cắt 2 buồng trứng ở 2 bên nhánh tử cung.Buồng... hai môi trƣờng IVF khác nhau, môi trƣờng đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trƣờng Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng.So với mTBM, trong mTLAP cho tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng cao hơn (9 2-9 4% so với 6 1-7 7%).Vì thế, lựa chọn môi trƣờng IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhƣng đạt tỷ lệ thụ tinh. .. tiên - Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng Các tinh trùng heo đƣợc hoạt hóa sẽ có khả năng thụ tinh in vitro cho các trứng trong vòng 2,5 giờ sau sự xâm nhập của chúng vào các tế bào trứng (theo Nagai và cs, 1993) Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duy trì khả năng thụ tinh nhƣ tỷ lệ về khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn 50% sau 2 giờ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng có các tế bào. .. hợp tế bào trứng - cumulus (COC).Các COCđƣợc chuyển vào đĩa petri có môi trƣờng mDPBS.Sau đó, rửa trứng lần lƣợt qua các đĩa petri còn lại cho đến khi không còn mảnh tế bào vỡ 2.4.2.4 Bảng thu nhận trứng loại A và loại B Bảng 2.4.Tỷ lệ phần trăm trứng loại A và loại B Loại A Loại B Tỷ lệ % trứng - 2.5 Thực nghiệm 2: Nuôi và đánh giá trứng trên các môi trường khác nhau + Phƣơng pháp chuyển trứng vào môi. .. albumin -HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumine và dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol 1.9 Hệ thống thụ tinh và nuôi phôi invitro SVTH: NGUYỄN THANH VŨ 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 1.6.Quá trình xâm nhập của tinh trùng vào noãn 1.9.1 Hệ thống thụ ... 9: Thu nhận tinh trùng chuẩn bị cho trình thụ tinh Bảng 2.11 Đánh giá kết thu nhận tỷ lệ % mật độ tinh trùng từ phương pháp Swim – up Tỷ lệ % M2 Trƣớc thu nhận Sau thu nhận 2.6.2 Thu nhận tinh. .. rửa Bƣớc 11: Thu nhận tinh trùng chuẩn bị cho trình thụ tinh Bảng 2.12 Đánh giá kết thu nhận tỷ lệ % mật độ tinh trùng từ phương pháp Swim – up Tỷ lệ % M1 Trƣớc thu nhận Sau thu nhận - 2.7 Thực... thành tế bào chất Trong trình này, bào quan tế bào chất đƣợc tổ chức lại chuẩn bị cho trình thụ tinh tổng hợp protein đƣợc xếp để chuẩn bị cho phát triển phôi.Nhƣ vậy, trƣởng thành nhân tế bào