BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM) BIẾN TÍNH CĨ KHẢ NĂNG HƯỚNG ĐÍCH ĐẾN TẾ BÀO UNG THƯ Chuyên ngành: HÓA HỌC HỮU CƠ Mã số chuyên ngành: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016 Cơng trình hồn thành tại: Phịng Vật liệu Hóa dược, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS NGUYỄN CỬU KHOA Người hướng dẫn khoa học 2: GS TS NGUYỄN CÔNG HÀO Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … … ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Nguyễn Thị Bích Trâm, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Cửu Khoa, Ứng dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân phân tích đánh giá polyaminoamin dendrimer dẫn xuất, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 276-279, 2013 Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Biocompatible and cellular uptake enhancement of polyamidoamine dendrimer via fatty alkyl conjugation, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 259-263, 2013 Ngoc Quyen Tran, Ngoc Hoa Nguyen, Thị Bich Tram Nguyen, Nguyen Cuu Khoa, Positive effect of dendrimers nanocarriers on reducing cytotoxicity of anticancer drugs, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 270-275, 2013 Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Cytotoxic behaviors of pamam-based dendrimers loading platinium compounds, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 51(5A), pp 334-341, 2013 Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Thi Bich Tram Nguyen, Kim Ngoc Phan, Dendrimer-based nanocarriers demonstrating a high efficiency for loading and releasing anticancer drugs against cancer cells in vitro and in vivo, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 51(5A), pp 224232, 2013 Thi Bich Tram Nguyen, Phuc Thinh Nguyen, Minh Nhật Hồ, Cuu Khoa Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from alkylated polyamidoamine G3.0, the 7th International Workshop on Advanced Materials Science and nanotechnology, Hạ Long City, VN, 2014 Nguyen Thi Bich Tram, Phuc Thinh Nguyen, Nguyen Đại Hải, Nguyen Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from alkylated polyamidoamine G3.0 dendrimer - folate, Tạp chí Hóa học, 53(4e3), pp 168-173, 2015 Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 1-H NMR Spectroscopy as an Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and Their Derivatives, International Journal of Polymer Analysis and Characterization, International Journal of Polymer Anal Charact., 20: 57–68, 2015 MỞ ĐẦU Ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Sự tiến khoa học mang đến kết ngày tốt bệnh ung thư Với mục đích điều trị hiệu quả, nghiên cứu tập trung vào việc điều trị tế bào ung thư giảm thiểu nguy hại tế bào lành thể, y học gọi phương pháp điều trị hướng đích (Targeted Therapy) Phương pháp điều trị hướng đích mở hướng q trình điều trị ung thư Phương pháp liên quan đến việc sử dụng loại dược phẩm có khả công cách đặc biệt tế bào ung thư Khả phân biệt tế bào ung thư tế bào bình thường giúp cho phương pháp điều trị hướng đích trở thành phương pháp điều trị lựa chọn ngày Các dendrimer quan tâm sử dụng chất mang thuốc hướng đích điều trị ung thư Dendrimer loại nano polymer có nhiều đặc điểm bật phù hợp với vai trò chất mang với cấu trúc phân tử dạng hình cầu, nhánh bên có nhiều khơng gian trống, có nhiều nhóm hoạt động bề mặt Tuy nhiên, nhóm chức hoạt động bề mặt dendrimer lại tương tác hóa - sinh học với tế bào thể chúng gây độc cho tế bào Nhằm khắc phục hạn chế để cải thiện số tính chất hỗ trợ cho việc mang thuốc nơi hiệu bề mặt dendrimer biến tính tác nhân tương hợp sinh học ankyl, PEG (Polyethylene Glycol), … kết hợp tác nhân hướng đích acid folic, peptide RGD (ArgGly-Asp), Anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) kháng thể AntiHER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), biotin, thông qua liên kết hóa học Chính lý tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư” Mục tiêu luận án Tổng hợp hệ dendrimer PAMAM biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 tác nhân alkyl hóa tác nhân hướng đích (acid folic) nhằm mục đích xây dựng hệ chất nano mang thuốc chống ung thư có tính tương hợp sinh học phân phối thuốc đến vị trí tế bào ung thư Để đạt mục tiêu trên, luận án thực nội dung sau Tổng hợp dendrimer PAMAM (từ hệ G-0.5 đến G3.0) Xác định thành phần cấu trúc khối lượng phân tử dendrimer PAMAM tổng hợp Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alkyl (acyl chloride, alcohol, acid carboxylic, alkylamine) Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 hay dendrimer PAMAM G3.0-alkyl với tác nhân hướng đích (acid folic) Xác định thành phần cấu trúc, độ chuyển hóa, khối lượng phân tử, số nhóm alkyl chuyển hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính Khảo sát độc tính tế bào dendrimer PAMAM G3.0 số dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 Khảo sát kích thước nano dendrimer PAMAM G3.0 số dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 Khảo sát khả hướng đích hệ chất mang thuốc chống ung thư Khảo sát khả mang nhả thuốc hệ dendrimer PAMAM G3.0-thuốc Ý nghĩa khoa học thực tiễn Kết nghiên cứu luận án cho thấy số kết luận có ý nghĩa khoa học thực tiễn sau: - Đề tài có giá trị việc nghiên cứu hợp chất mang thuốc chống ung thư hướng đích, hợp chất chuyển thuốc chống ung thư đến vị trí tế bào ung thư Đây vấn đề xã hội quan tâm - Phát phổ 1H-NMR việc đánh giá khối lượng phân tử dendrimer có ý nghĩa quan trọng việc vận dụng, đánh giá q trình tổng hợp chuyển hóa hợp chất, thuốc, Bố cục luận án: Luận án có 119 trang với 23 bảng, 48 hình, đồ thị 21 sơ đồ Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận (2 trang), danh mục cơng trình công bố (2 trang) tài liệu tham khảo (20 trang) luận án chia thành chương sau: Chương 1: Tổng quan (30 trang) Chương 2: Thực nghiệm (30 trang) Chương 3: Kết bàn luận (59 trang) Đóng góp luận án Đã tổng hợp thành công hệ dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (hiệu suất phản ứng từ 71-89%), với mục đích thu dendrimer PAMAM G2.5 dendrimer PAMAM G3.0 sử dụng cho biến tính bề mặt dendrimer PAMAM Xây dựng thành công phương pháp tính tốn sở liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR khối phổ MS dendrimer PAMAM hệ thấp từ G-0.5 đến G2.0 để tính khối lượng phân tử dendrimer PAMAM hệ cao (từ hệ G3.0 trở đi) Hiệu số sai lệch so với lý thuyết phương pháp khoảng từ 0-6%, tương đương với kết sử dụng phương pháp khối phổ MALDI-TOF-MS Tổng hợp thành cơng hợp chất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính với dãy alkyl hóa acyl chloride, acid carboxylic, alcohol dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine Đã xây dựng thành cơng phương pháp tính tốn sở liệu phổ 1H- NMR để xác định độ chuyển hóa (x%), số nhóm chuyển hóa (z nhóm), khối lượng phân tử dẫn xuất dendrimer PAMAM-alkyl Đã khảo sát độc tính tế bào tế bào MCF-7 dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon mạch alkyl tăng từ đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 G3.0-C14) Kết cho thấy sau alkyl hóa, độc tính tế bào dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alkyl giảm đáng kể so với dendrimer PAMAM G3.0 chưa biến tính Mạch alkyl dài sau gắn vào dendrimer PAMAM làm giảm độc tính dendrimer Đã gắn thành công tác nhân hướng đích acid folic lên hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 tạo thành hệ chất mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-FA dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu chứng minh khả hướng đích chủ động hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-C6FA khả hướng đích thụ động hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-C6 Đã khảo sát kích thước dendrimer PAMAM G3.0 dẫn suất dendrimer PAMAM G3.0-C6; PAMAM G3.0-FA; PAMAM G3.0-C6FA hình ảnh TEM Kích thước hệ chất nằm khoảng 4-6nm Đã khảo sát thành công khả mang nhả thuốc chống ung thư 5-FU dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6FA Kết phân tử dendrimer PAMAM G3.0 mang phân tử 5FU, dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang nhiều (9 phân tử 5-FU) Và môi trường PBS, thuốc 5-FU nhả từ hệ mang thuốc PAMAM G3.0-C6-FA/5FU chậm so với đối chứng 5-FU Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian Vị trí H a b c d e j Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) H nhóm G3.0-C10-12h -CH2CH2N(30 nhóm) -CH2CH2CO(60 nhóm) -H2CH2CONH(60+z nhóm) -CH2NH2 (32- z nhóm) -CONHCH2CH2(60+z nhóm) -CH3 (z nhóm) G3.0-C10-24h G3.0-C10-36h G3.0-C10-48h 2, 53-2,54 2,68 2,57 2,62-2,64 2,73 2,75-2,77 2,77 2,84-2,85 2,34 2,35-2,44 2,37-2,45 2,18-2,21 2,83-2,96 2,82-2,89 3,01 3,03 3,21-3,34 3,32-3,46 3,24-3,40 3,30-3,45 0.77 0,91 0,80 0,91 Dựa vào độ dịch chuyển tín hiệu proton (a) (j) phổ 1HNMR thống kê qua bảng 3.5, áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định độ chuyển hóa (x%), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) khối lượng phân tử (WtNMR) dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-12h, G3.0-C10-24h, G3.0-C10-36h G3.0-C10-48h (bảng 3.6) Áp dụng ví dụ với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h Độ chuyển hóa sản phẩm tính sở phổ 1H-MNR (hình 3.10) theo cơng thức trên: S ( j) H(  C H3 ) S x%  (a ) H(  C H  ) H H ( j) (  C H3 ) 3,362 4,327 100%  100%  48,56% 32x3 30x2 (a ) (  C H2  ) Số nhóm chuyển hóa: z = x%.32 = 48,56%.32 = 15,5  16 nhóm 16 Khối lượng phân tử dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h tính toán sau (sử dụng liệu bảng 1.2, bảng 2.3): WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + z WtLT(dodecanoyl chloride) – z WtLT(HCl) = 6909 + 16.218,76 – 16.36,46084 = 9826 (với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909, H = 1,00784; Cl = 35,453) Hình 3.3: Phổ 1H-NMR sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10) Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10-12h, G3.0-C10-24h G3.0-C10-48h tính tốn tương tự lập thành bảng sau (bảng 3.6) Bảng 3.5: Kết khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 S ( j) H(  C H3 ) S (a ) H(  C H  ) H H độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z nhóm) Khối lượng phân tử (WtNMR) ( j) (  C H3 ) (a ) (  C H2  ) G3.0-C10-12h 0,747 2,764 32x3 30x2 16,89 7820 G3.0-C10-24h 0,124 0,321 32x3 30x2 24,14 8367 G3.0-C10-36h (G3.0-C10) 3,362 4,327 32x3 30x2 48,56 16 9826 17 G3.0-C10-48h 3,000 4,161 32x3 30x2 45,06 14 9461 Nhìn vào kết bảng 3.6 ta thấy, với thời gian phản ứng khảo sát 12 giờ, 24 giờ, 36 48 độ chuyển hóa dẫn xuất 36 cao Trong khoảng thời gian từ 12-36 giờ, khả phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 decanoyl chloride tăng dần Tuy nhiên, tiếp tục kéo dài thời gian phản ứng đến 48 độ chuyển hóa dẫn xuất khơng tăng mà bắt đầu giảm (đồ thị 3.1), kéo dài thời gian phản ứng sản phẩm bị thủy phân ảnh hưởng đến hiệu chuyển hóa Đồ thị 3.1: Kết khảo sát thời gian biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride Như vậy, độ chuyển hóa dẫn xuất 36 tốt dãy thời gian khảo sát Dựa vào đây, tiếp tục tiến hành biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride khác điều kiện thời gian 36 3.2.1.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride (acetyl chloride, hexanoyl chloride, myristoyl chloride) với thời gian 36 Các acyl chloride khác nghiên cứu acetyl chloride, hexanoyl chloride, myristoyl chloride để biến tính PAMAM G3.0 thời gian phản ứng 36 Khảo sát tính tốn tương tự sở phổ 1H NMR cơng thức tính độ chuyển hóa (x) số nhóm chuyển hóa (z) KLPT 18 với decanoyl chloride, kết cho thấy mạch alkyl dài từ C2 lên tới C10 số nhóm alkyl (z) gắn vào PAMAM tăng từ 10 lên 16 nhóm Tuy nhiên mạch alkyl tăng tiếp lên C14 yếu tố án ngữ khơng gian, số nhóm alkyl gắn lên PAMAM giảm xuống (Đồ thị 3.2) Đồ thị 2: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride (G3.0C2), hexanoyl chloride (G3.0-C6), decanoyl chloride (G3.0-C10), myristoyl chloride (G3.0-C14) 3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic Sản phẩm phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic (acid acetic, acid hexanoic, acid decanoic acid myristic) có dạng sệt màu vàng nhạt giống sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride, có cơng thức cấu tạo chung G3.0-(NH-COCH2(CH2)nCH3)z (hình 3.19) Khảo sát tính tốn sở phổ 1H NMR cơng thức tính độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z) khối lượng phân tử trên, kết cho thấy mạch alkyl dài từ lên tới 10 carbon số nhóm alkyl (z) gắn vào PAMAM tăng từ 10 lên 15 nhóm Tuy nhiên mạch alkyl tăng tiếp lên 14 carbon yếu tố án ngữ khơng gian, số nhóm alkyl gắn lên dendrimer PAMAM G3.0 giảm xuống 12 (Đồ thị 3.3) 19 Đồ thị 3.3: Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid acetic (G3.0-C2-EDC), acid hexanoic (G3.0-C6-EDC), acid decanoic (G3.0-C10-EDC), acid myristic (G3.0-C14-EDC) Phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic sở cho phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hướng đích acid folic 3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol Sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol tổng hợp dạng dẻo màu vàng nhạt, có cơng thức cấu tạo sau: G3.0-(NH-COOCH2(CH2)nCH3)z (hình 3.12) Hình 3.4: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol 20 Khảo sát tính tốn sở phổ 1H NMR cơng thức tính độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z) khối lượng phân tử trên, kết cho thấy tính dendrimer PAMAM G3.0 alcolhol sử dụng chất hoạt hóa NPC cho hiệu suất chuyển hóa cao (đồ thị 3.4) Đồ thị 3.4 : Kết biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với etanol (G3.0-C2-NPC), hexanol (G3.0C6-NPC), octanol (G3.0-C8-NPC), dodecanol (G3.0-C12-NPC) 3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine Sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine tổng hợp dạng sệt màu vàng nhạt, có cơng thức cấu tạo chung G2.5-(CO-NHCH2(CH2)nCH3)z (hình 3.13) Hình 3.5: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine 21 Khảo sát tính tốn sở phổ 1H NMR cơng thức tính độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z) khối lượng phân tử trên, kết cho thấy: - Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn, số nhóm chuyển hóa (z) dodecylamine nhiều (Đồ thị 3.5a) - Với mạch alkyl tăng từ carbon (butylamine), carbon (hexylamine), 10 carbon (decylamine) 12 carbon (dodecylamine), nhiệt độ phản ứng 800C, số nhóm chuyển hóa (z) tăng từ lên tới 11 (Đồ thị 3.5b) (a) (b) Đồ thị 3.5: Kết khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ (a) alkylamine có mạch alkyl dài khác 3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƯỚNG ĐÍCH - ACID FOLIC Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 PAMAM G3.0-C6 với tác nhân hướng đích - acid folic thu sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA PAMAM G3.0-C6-FA ( hình 3.16) Phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.16) hợp chất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA cho thấy bên cạnh xuất tín hiệu proton đặc trưng dendrimer PAMAM G3.0 cịn có tín hiệu proton nhóm đặc trưng 22 nhóm nguyên tử phân tử acid folic (k, m, r, p q) tín hiệu proton nhóm alkyl (j) có hexanoyl chloride Điều chứng tỏ có gắn kết nhóm folate nhóm hexanoyl vào dendrimer PAMAM G3.0 Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA thu có màu vàng cam Cơng thức cấu tạo dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA (hình 3.16) Hình 3.6: Cấu trúc phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA Dựa vào độ dịch chuyển tín hiệu proton (a) (j) phổ 1HNMR, áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định độ chuyển hóa nhóm hecxanoyl (x%), số nhóm chuyển hóa hecxanoyl (z) Dựa vào độ dịch chuyển tín hiệu proton (a) (k) phổ 1HNMR, áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định độ chuyển hóa nhóm folate (x%), số nhóm chuyển hóa (z) khối lượng phân tử dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA PAMAM G3.0-C6-FA (WtNMR) Bảng 3.4: Độ chuyển hóa (x), nhóm chuyển hóa (z), khối lượng phân tử (WtNMR) sản phẩm PAMAM G3.0-FA PAMAM G3.0-C6-FA xác định theo phổ 1H NMR Sản phẩm PAMAM G3.0-FA x% Z nhóm WtNMR Kết luận sản phẩm 8179 PAMAM G3.0-(FA)3 8768 PAMAMG3.0-(C6)6-(FA)3 folate 8,01 hexanoyl 20 folate 8,01 PAMAM G3.0-C6-FA 23 Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu thuộc viện cơng nghệ nano Michigan trường đại học Michigan họ gắn acid folic lên dendrimer PAMAM G5.0 với tỉ lệ 3:1 mang lại hiệu hướng đích mong đợi [79] Từ kết thí nghiệm, chúng tơi gắn phân tử acid folic lên bề mặt dendrimer PAMAM G 3.0 Đây kết khả quan cho nghiên cứu chất mang thuốc 3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Khả ức chế tăng trưởng tế bào dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 thử nghiệm tế bào MCF-7 (Frederick, MD, USA) EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, trường Đại học Ajou, TP Suwon, Hàn Quốc Trong thử nghiệm này, lựa chọn dendrimer PAMAM 3.0 dẫn xuất alkyl dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon mạch alkyl tăng từ đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 G3.0-C14) để khảo sát khả gây độc tế bào Đồ thị 3.6: Kết thử độc tế bào PAMAM G3.0, PAMAM G3.0-C2, PAMAM G3.0-C6, PAMAM G3.0-C10 PAMAM G3.0-C14 tế bào MCF-7 24 Phương pháp thử nghiệm EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit tế bào MCF7, kết thử nghiệm cho thấy PAMAM 3.0 gây độc tế bào, nhiên dẫn xuất alkyl PAMAM G3.0 làm giảm mạnh gây độc tế bào PAMAM G3.0 khả gây độc PAMAM-alkyl giảm đáng kể chiều dài mạch alkyl kéo dài (Đồ thị 3.5) Kết khảo sát trùng khớp với công bố Rachaneekorn Jevprasesphant [70] 3.4 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO Khả thâm nhập tế bào G3.0-C6-FITC G3.0-C6-FA-FITC thử nghiệm dòng tế bào Hela kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Confocal laser scanning microscopy) trường Đại học Ajou, TP Suwon, Hàn Quốc (a) (b) (c) Hình 3.10: Kết phân tích kính hiển vi laser quét đồng tiêu tế bào đối chứng (a), tế bào xử lý với PAMAM G3.0-C6-FITC (b) tế bào xử lý với PAMAM G3.0-C6-FA-FITC (c) Qua kết khảo sát thâm nhập tế bào, chứng minh khả hướng đích chủ động dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FAFITC có tác nhân hướng đích acid folic khả hướng đích thụ động dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC khơng gắn tác nhân hướng đích acid folic Phù hợp với nghiên cứu Kukowska-Latallo JF [86], Youngseon Choi [109] số báo cáo [44, 47-49, 79-83, 103, 111] Kết nghiên cứu cho thấy tiềm liệu pháp điều trị ung thư sử dụng 25 hệ mang thuốc có gắn tác nhân hướng đích acid folic, góp phần nâng cao hiệu tính an tồn cho liệu pháp điều trị 3.5 XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT Hình 3.7: Kết TEM Dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất PAMAM G3.0-C6 Hình 3.8: Kết TEM dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA G3.0-C6-FA Ảnh TEM dendrimer PAMAM G3.0 (hình 3.19) cho thấy hạt nano dendrimer PAMAM G3.0 thành lập có dạng hình cầu kích thước hạt khác từ đến nm Sau biến tính với hexanoyl chloride acid folic cho sản phẩm biến tính dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6, G3.0FA, G3.0-C6-FA có kích thước hạt từ đến nm (hình 3.19-20) Một số ảnh TEM điển hình dendrimer G3.0 dẫn xuất cho thấy hợp chất tổng hợp có kích thước nano phù hợp với lý thuyết phân tử Với kích thước nano dẫn xuất dendrimer có tiềm lớn lĩnh vực y dược, mang thuốc, vận chuyển gene, … [4, 5, 22, 90, 112-114] 26 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC 3.7.1 Khảo sát khả mang (nang hóa) thuốc chống ung thư 5fluorouracil Kết thử nghiệm cho thấy khả mang thuốc hiệu dendrimer PAMAM: - gam chất mang dendrimer PAMAM G3.0 mang 112,97mg thuốc 5-FU tương ứng với phân tử thuốc 5-FU mang bên cấu trúc phân tử PAMAM G3.0 - gam chất mang dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang 133,52mg thuốc 5-FU tương ứng với phân tử thuốc 5-FU mang cấu trúc phân tử PAMAM G3.0-C6-FA 3.7.2 Khảo sát khả nhả thuốc Kết thử nghiệm in vitro cho thấy khả phát hành chậm thuốc từ hệ thống PAMAM G3-C6-FA/5-FU nhả chậm so với 5-FU tự Đây cải tiến đáng kể việc kéo dài sinh khả dụng thuốc, chống ung thư 5-FU báo cáo có thời gian lưu thơng máu ngắn [34] 27 KẾT LUẬN Nhìn lại mục tiêu ban đầu luận án: “Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư” Một số kết luận án đạt tóm tắt sau: Đã tổng hợp thành công hệ dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (hiệu suất phản ứng từ 71-89%), với mục đích thu dendrimer PAMAM G2.5 dendrimer PAMAM G3.0 sử dụng cho biến tính bề mặt dendrimer PAMAM Xây dựng thành cơng phương pháp tính toán sở liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR khối phổ MS dendrimer PAMAM hệ thấp từ G-0.5 đến G2.0 để tính khối lượng phân tử dendrimer PAMAM hệ cao (từ hệ G3.0 trở đi) Hiệu số sai lệch so với lý thuyết phương pháp khoảng từ 0-6%, tương đương với kết sử dụng phương pháp khối phổ MALDI-TOF-MS Tổng hợp thành cơng hợp chất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính với dãy alkyl hóa acyl chloride, acid carboxylic, alcohol dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine Đã xây dựng thành cơng phương pháp tính tốn sở liệu phổ 1H- NMR để xác định độ chuyển hóa (x%), số nhóm chuyển hóa (z nhóm), khối lượng phân tử dẫn xuất dendrimer PAMAM-alkyl Đã khảo sát độc tính tế bào tế bào MCF-7 dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon mạch alkyl tăng từ đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 G3.0-C14) Kết cho thấy sau alkyl hóa, độc 28 tính tế bào dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alkyl giảm đáng kể so với dendrimer PAMAM G3.0 chưa biến tính Mạch alkyl dài sau gắn vào dendrimer PAMAM làm giảm độc tính dendrimer Đã gắn thành cơng tác nhân hướng đích acid folic lên hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 tạo thành hệ chất mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-FA dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu chứng minh khả hướng đích chủ động hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-C6FA Đã khảo sát kích thước dendrimer PAMAM G3.0 dẫn suất dendrimer PAMAM G3.0-C6; PAMAM G3.0-FA; PAMAM G3.0-C6FA hình ảnh TEM Kích thước hệ chất nằm khoảng 4-6nm Đã khảo sát thành công khả mang nhả thuốc chống ung thư 5-FU dendrimer PAMAM G3.0 dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6FA Kết phân tử dendrimer PAMAM G3.0 mang phân tử 5FU, dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang nhiều (9 phân tử 5-FU) Và môi trường PBS, thuốc 5-FU nhả từ hệ mang thuốc PAMAM G3.0-C6-FA/5FU chậm so với đối chứng 5-FU 29 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục đề tài với hệ dendrimer PAMAM cao hơn, để đạt hiệu mang thuốc tốt - Nghiên cứu biến tính dẫn xuất dendrimer PAMAM với tác nhân hướng đích khác Arg-Gly-Asp (RGD); epidermal growth factor receptor (EGFR); kháng thể HER-2, 30 ... thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư” Mục tiêu luận án Tổng hợp hệ dendrimer PAMAM biến tính bề mặt dendrimer... dendrimer PAMAM G3.0 tác nhân alkyl hóa tác nhân hướng đích (acid folic) nhằm mục đích xây dựng hệ chất nano mang thuốc chống ung thư có tính tương hợp sinh học phân phối thuốc đến vị trí tế bào... hơn, để đạt hiệu mang thuốc tốt - Nghiên cứu biến tính dẫn xuất dendrimer PAMAM với tác nhân hướng đích khác Arg-Gly-Asp (RGD); epidermal growth factor receptor (EGFR); kháng thể HER-2, 30