TRNG I HC NễNG NGHIP KHOA CễNG NGH THC PHM ******* Bi ging mụn hc VI SINH VT I CNG Ngi thc hin: Nguyn Th Thanh Thu H ni, 2010 BI M U Mc ớch: Gii thiu i tng v nhim v ca mụn hc, nhng úng gúp ca cỏc nh khoa hc lch s phỏt trin VSVH Lm rừ chớnh ó y cỏc nghiờn cu ti giai on hong kim ca vi sinh vt hc Mụ t cỏc c im chung ca vi sinh vt v cỏch phõn loi chỳng i tng v nhim v ca vi sinh vt hc Vi sinh vt (microorganisms) l tờn chung ch tt c cỏc sinh vt nh m mun thy rừ chỳng ngi ta phi s dng kớnh hin vi Vi sinh vt hc (Microbiology) l khoa hc nghiờn cu v hỡnh thỏi, cu to, c tớnh sinh lý, sinh hoỏ, di truyn v phõn loi ca cỏc vi sinh vt Gia cỏc nhúm vi sinh vt khỏc hu nh ch thy cú s ging v tớnh cht nh v s thng nht phng phỏp nghiờn cu Tuy nhiờn chỳng thuc v cỏc nhúm phõn loi khỏc v hu nh cú rt ớt quan h i vi Cỏc nhúm vi sinh vt ch yu bao gm: - Vi khun (Bacteria): theo ngha rng, nú l tờn chung ch nhiu loi vi sinh vt thuc cỏc b khỏc ngnh Bacteria nh x khun (Actinomycetes), niờm vi khun (Myxobacteriales), xon th (Spirochaetales), Rickettsias v Mycoplasmas Vi khun (theo ngha hp) khụng bao gm cỏc nhúm trờn - Nm men (Yeast, Levure) - Nm mc (Molds) - Mt s to (Algae) - Mt s ng vt nguyờn sinh (Protozoa) - Virus Lc s nghiờn cu vi sinh vt hc (bi c thờm) Cú th chia lch s ca vi sinh vt hc lm giai on chớnh: Giai on phỏt trin sm (trc 1857), giai on hong kim (1857-1907) v giai on ng thi ca VSVH (1907-nay) 2.1 Giai on phỏt trin sm ca VSVH Giai on ny c tớnh t 1857 tr v trc, ú l nhng úng gúp ca Leeuwenhoek (vi khun hc, nguyờn sinh ng vt hc, nm hc, ký sinh trựng hc v to hc) (bi c thờm); Linnaeus (h thng phõn loi) (bi c thờm); Semmelweis (kim soỏt bnh nhim trựng); Snow (dch t hc) 2.2 Thi k hong kim ca vi sinh vt hc Trong nhng nm 1857-1907, cỏc nh khoa hc ó gii quyt c chớnh v a giai on ny tr thnh giai on hong kim ca VSVH Bao gm: - u tranh v ph nhn thuyt t sinh (thớ nghim ca Redy, Needham, Spallanzani, Pasteur) (bi c thờm) - Gii thớch v hin tng lờn men (thớ nghim ca Pasteur, Buchner) (bi c thờm) - Nguyờn nhõn bnh tt (thớ nghim ca Koch) (bi c thờm) - Phng phỏp ngn nga s nhim trựng v bnh tt (bt u t nhng nghiờn cu cu cỏc tin bi nh Semmelweis vi bin phỏp tay, Lister vi k thut sỏt trựng, Nightingale vi vic chm súc sc kho, Jenner vi vaccin, Gram vi vic nhum vi khun, cui cựng Ehrlich (1854-1915) lm ni bt giai on ny bi nhng viờn thn dc, cú th phỏ hu cỏc tỏc nhõn gõy bnh m khụng gõy c vi ngi 2.3 Giai on ng thi ca vi sinh vt hc (bi c thờm v SV t tham kho) - C s khoa hc ca cỏc phn ng hoỏ sinh - Hot ng ca gen - Sinh hc phõn t - K thut AND tỏi t hp - Liu phỏp gen c im chung ca vi sinh vt Vi sinh vt cú cỏc c im chung sau õy: Kớch thc nh Vi sinh vt thng c o kớch thc bng n v micromet (1àm= 1/1000mm hay 1/1000 000m) Virus c o kớch thc n v bng nanomet (1nn=1/1000 000mm hay 1/1000 000 000m) Kớch thc cng thỡ din tớch b mt ca vi sinh vt n v th tớch cng ln Chng hn ng kớnh ca cu khun (coccus) ch cú 1àm, nhng nu xp y chỳng thnh cú th lớch l 1cm3 thỡ chỳng cú din tớch b mt rng ti m2 ! Hp thu nhiu, chuyn hoỏ nhanh Tuy vi sinh vt cú kớch thc rt nh nhng chỳng li cú nng lc hp thu v chuyn hoỏ vt xa cỏc sinh vt khỏc Chng hn vi khun lactic (Lactobacillus) gi cú th phõn gii c mt lng ng lactose ln hn 100-10 000 ln so vi lng ca chỳng Sinh trng nhanh, phỏt trin mnh Chng hn, trc khun i trng (Escherichia coli) cỏc iu kin thớch hp ch sau 12-20 phỳt li phõn ct mt ln Nu ly thi gian th h l 20 phỳt thỡ mi gi phõn ct ln, sau 24 gi phõn ct 72 ln v to 722 366,5 x1018 t bo, tng ng vi lng 4722 tn Tt nhiờn t nhiờn khụng cú c cỏc iu kin ti u nh vy (vỡ thiu thc n, thiu oxy, d tha cỏc sn phm trao i cht cú hi ) Cú nng lc thớch ng mnh v d dng phỏt sinh bin d Trong quỏ trỡnh tin hoỏ lõu di vi sinh vt ó to cho mỡnh nhng c ch iu ho trao i cht thớch ng c vi nhng iu kin sng rt khỏc nhau, k c nhng iu kin ht sc bt li m cỏc sinh vt khỏc khụng th tn ti c Cú vi sinh vt sng c mụi trng núng n 1300C, lnh n 0-50C, mn n nng 32% mui n, ngt n nng mt ong, pH thp n 0,5 hoc cao n 10,7, ỏp sut cao n trờn 1103 at hay cú phúng x cao n 750 000 rad Nhiu vi sinh vt cú th phỏt trin tt iu kin tuyt i k khớ, cú loi nm si cú th phỏt trin dy c b ngõm t thi vi nng formol rt cao Vi sinh vt a s l n bo, sinh sn nhanh, s lng nhiu, tip xỳc trc tip vi mụi trng sng ú rt d dng phỏt sinh bin d Ch sau mt thi gian ngn ó cú th to mt s lng rt ln cỏc cỏ th bin d cỏc h h sau Nhng bin d cú ớch s a li hiu qu rt ln sn xut Nu nh mi phỏt hin penicillin hot tớnh ch t 20 n v/ml dch lờn men (1943) thỡ ó cú th t trờn 100 000 n v/ml Khi mi phỏt hin acid glutamic ch t 1-2g/l thỡ ó t n 150g/ml dch lờn men (VEDAN-Vit Nam) Phõn b rng, chng loi nhiu Vi sinh vt cú mt khp mi ni trờn Trỏi t, khụng khớ, t, trờn nỳi cao, di bin sõu, trờn c th, ngi, ng vt, thc vt, thc phm, trờn mi vt Vi sinh vt tham gia tớch cc vo vic thc hin cỏc vũng tun hon sinh-a-hoỏ hc (biogeochemical cycles) nh vũng tun hon C, vũng tun hon N, vũng tun hon P, vũng tun hon S, vũng tun hon Fe Trong nc vi sinh vt cú nhiu vựng duyờn hi (littoral zone), vựng nc nụng (limnetic zone) v c vựng nc sõu (profundal zone), vựng ỏy ao h (benthic zone) Trong khụng khớ thỡ cng lờn cao s lng vi sinh vt cng ớt S lng vi sinh vt khụng khớ cỏc khu dõn c ụng ỳc cao hn rt nhiu so vi cỏc vựng khỏc (khụng khớ trờn mt bin, khụng khớ Bc cc, Nam cc ) Hu nh khụng cú hp cht carbon no (tr kim cng, ỏ graphớt ) m khụng l thc n ca nhng nhúm vi sinh vt no ú (k c du m, khớ thiờn nhiờn, formol dioxin ) Vi sinh vt cú cỏc kiu dinh dng khỏc nhau: t dng quang nng (photoautotrophy), d dng quang nng (photoheterotrophy), t dng hoỏ nng (chemoautotrophy), d dng hoỏ nng (chemoheterotrophy), t dng cht sinh trng (auxoautotroph), d dng cht sinh trng (auxoheterotroph) Phõn loi vi sinh vt T trc n cú rt nhiu h thng phõn loi sinh vt Cỏc n v phõn loi sinh vt núi chung v vi sinh vt núi riờng i t thp lờn cao n v c bn phõn loi l Loi (Species) Trờn LOI cú Chi (Genus), H (Family), B (Order), Lp (Class), Ngnh (Phylum), v Gii (Kingdom) Hin trờn gii cũn cú mt mc phõn loi na gi l lnh gii (Domain) y l cha k n cỏc mc phõn loi trung gian nh Loi ph (Subspecies), Chi ph (Subgenus), H ph (Subfamily), B ph (Suborder), Lp ph (Subclass), Ngnh ph (Subphylum) Di LOI gm cú Th (Variety), Dng (Type), Nũi hay Chng (Strain) (bi c thờm) Mi loi vi khun cng nh cỏc sinh vt khỏc u c mang mt tờn khoa hc riờng Tờn ny c t theo danh phỏp kộp ca Lineaus Trong tờn ny t th nht ch Ging, t th hai ch tờn loi Vớ d: Staphylococcus aureus tin theo dừi, ụi sau tờn loi ngi ta cũn ghi thờm tờn tỏc gi v nm xỏc nh, vớ d Staphylococcus aureus Bergey, 1939 Th (n v sỏt sau loi), dựng ch mt nhúm nht nh mt loi no ú, vớ d Mycobacterium tuberculosis var bovis (vi khun lao bũ) Dng: ch mt nhúm nh hn di th, vớ d cn c vo phn ng huyt m ngi ta chia ph cu khun Diplococcus pneumoniae thnh 80 dng khỏc nhau, ú cỏc dng I, II, III l cỏc dng cú c tớnh mnh nht Chng: l thut ng riờng ch mt loi vi sinh vt mi phõn lp thun khit t mt c cht no ú Lu ý cỏc cỏ th cựng mt loi phõn lp nhng ni khỏc cng khụng bao gi hon ton ging nhau, chỳng cú th c coi l nhng nũi khỏc Cỏc nũi thng c ký hiu bng nhng s, nhng ch vit tt theo quy c riờng ca ngi nghiờn cu, vớ d Bacillus subtilis B.F 7687 Ngi ta c tớnh s 1,5 triu loi sinh vt cú khong 200 000 loi vi sinh vt (100 000 loi ng vt nguyờn sinh v to, 90 000 loi nm, 2500 loi vi khun lam v 1500 loi vi khun) Tuy nhiờn hng nm, cú thờm hng nghỡn loi sinh vt mi c phỏt hin, ú cú khụng ớt loi vi sinh vt Virus l mt dng c bit cha cú cu trỳc c th cho nờn cha c k n s 200 000 loi vi sinh vt núi trờn S virus ó c t tờn l khong 4000 loi BI C THấM CA CHNG M U LCH S PHT TRIN CA VSVH T c xa, mc dự cha nhn thc c s tn ti ca vi sinh vt, nhng loi ngi ó bit khỏ nhiu v cỏc tỏc dng ca vi sinh vt gõy nờn Trong sn xut v i sng, ngi ó tớch ly c nhiu kinh nghim v cỏc bin phỏp li dng cỏc vi sinh vt cú ớch v phũng trỏnh cỏc vi sinh vt cú hi Trờn nhng vt gi li t thi c Hy Lp ngi ta ó thy minh c quỏ trỡnh nu ru Nhng ti liu kho c cho bit cỏch õy trờn 6000 nm ngi dõn Ai Cp dc sụng Nile ó cú quỏn nỏu ru Cỏc hỡnh v trờn Kim T Thỏp cng cho thy ngh nu ru v lm bia Ai Cp cng rt ph bin Trong Kinh thỏnh cng cú on miờu t cnh say ru ca Noộ sau sng sút qua cn i hng thy (cỏch õy trờn 5000 nm) Trung Quc ru ó c sn xut t thi i húa Long Sn (cỏch õy trờn 4000 nm) Trong cỏc ch khc trờn xng, trờn mai rựa (ct giỏp t) t thi n Thng (th k 17-11 TCN) ngi ta ó thy ch tu Vic lờn men lactic (mui da) c thc hin vo khong nm 3500 TCN Mui da, lm gim, lm tng, lm mm, lm mt, lm sa chua, p tht, p cỏ u l nhng bin phỏp hu hiu hoc s dng, hoc khng ch vi sinh vt phc v cho vic ch bin v bo qun thc phm Theo sỏch Lnh nam chớch quỏi thỡ nhõn dõn ta t thi Hựng Vng dng nc ó bit lm mm bng cm thỳ, lm ru bng ct go Vic sỏng to cỏc hỡnh thc phõn, ngõm phõn, ngõm ay, ngõm gai, xp i, trng luõn canh cỏc cõy h u u l nhng bin phỏp ti tỡnh m t tiờn ta t lõu ó bit phỏt huy tỏc dng ca vi sinh vt nụng nghip V phng din phũng tr bnh tt loi ngi cng sm tớch ly c nhiu kinh nghim phong phỳ Ngay t trc Cụng nguyờn nhng ti liu ca Hippocrate (460 373 TCN), ca Veron (116 27 TCN) ca Lucrốce (98 55 TCN) ó cp n bn cht sng ca cỏc tỏc nhõn gõy bnh truyn nhim Ngi cú cụng phỏt hin th gii vi sinh vt v cng l ngi u tiờn miờu t hỡnh thỏi nhiu loi vi sinh vt l mt ngi H Lan l ngi hc ngh mt hiu buụn vi ú l Antonie van Leeuwenhoek (1632 1723) ễng ó t ch to trờn 400 kớnh hin vi, ú cú cỏi phúng i c n 270 ln Vi nhng chic kớnh hin vi cm tay, cú gng hi t ỏnh sang, cú c iu chnh cho vt nh quan sỏt ri ỳng vo tiờu im v bng cỏch ghộ mt vo khe nh cú gn thu kớnh mi ly nh xớu, Leerwenhoek ó ln lt quan sỏt mi th cú xung quanh mỡnh Nm 1674 ụng nhỡn thy cỏc vi khun v ng vt nguyờn sinh, ụng gi l cỏc ng vt vụ cựng nh ễng thy cỏc ng vt ny cú rt nhiu trogn ba rng v ụng vit rng ming ca ụng s lng ca chỳng cũn ụng hn c dõn s ca nc H Lan Nh s gii thiu ca regnier de Graaf ụng ó gi n Hc hi Hong gia Anh 200 bc th, qua ú ụng ó miờu t hỡnh thỏi v dng chuyn ng ca nhiu loi vi sinh vt Nhiu bi bỏo ca ụng ó c dng trờn Trit hc ca Hc hi Hoỏng gia Anh v nm 1680 ụng ó c bu lm thnh viờn ca Hc hi ny Tt c cỏc quan sỏt v miờu t ca ụng ó c in thnh mt b sỏch gm cú nhan Nhng mt ca gii t nhiờn nhỡn qua kớnh hin vi Ch ti u th k 19 nhng chic hin vi quang hc hon chnh mi i vi cỏc cng hin to ln ca G Battista Amici (1784 1860) Ernes Abbe ( 1840 1905), Karl Zeiss (1816 1888) nm 1934 chic kớnh hin vi in t u tiờn i ú l loi kớnh hin vi khụng dựng ỏnh sang khuch i nh cỏc thu kớnh m dựng chựm in t khuch i lờn nh cỏc in t trng T thp k 60 ca th k 19 bt u thi kỡ nghiờn cu v sinh lớ hc ca cỏc loi vi sinh vt Ngi cú cụng to ln vic ny, ngi v sau c coi l ụng t ca vi sinh vt hc l nh khoa hc ngi Phỏp Louis Pasteur (1822 1895) Khú m túm tt c lng cỏc phỏt hin s m L Pasteur ó cng hin cho nhõn loi Vit v L Pasteur, nh khao hc ngi Nga K.A.Timiriazev ó phõn tớch nh sau: Cụng trỡnh ca ụng ó em li nhng bin i quan trng c b mụn khoa hc ng dng kinh in ca nhõn loi V cụng nghip, ụng ó cỏc c s hp lớ, vng chc cho ht thy cỏc quỏ trỡnh lờn men V nụng nghip, lớ lun ca ụng cựng vi s phỏt trin ca T.Schloesing, H Hellriegel, S.N Vinogradskii ó vch cho cỏc nh nụng hc nhng ỏnh sỏng mi v cỏc nhim v v phng phỏp c bn V y hc t sau loi ngi nuyờn thy thoỏt c s uy hip ca cỏc dó thỳ rng sõu thỡ lch s cha tng thy cú s tin b no cú ý ngha quyt nh nh cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ca L Pasteur. ""Nh bỏc hc c Robert Koch (1843- 1910) l ngi ó cng s mt thit vi Pasteur Ngoi cụng lao to ln phỏt hin vi khun lao, vi khun t, ụng cũn tỡm phng phỏp phõn lp thun khit vi sinh vt trờn cỏc mụi trng c Hc trũ ca ụng l J.R Petri (1852 1921) ó phỏt kin loi hp lng lm bng thy tinh R Koch ó phỏt hin phng phỏp nhum mu t bo vi sinh vt V sau cỏc k thut nhum tiờu bn ó c ci tin bi Ehrlich (1881), Ziehl v Neelsen (1883) Loeffler (1884), Gram (1884) R.Koch c nhn gii Nobel nm 1905 Ngi cú cụng u tiờn vic chng minh cú s tn ti ca loi vi khun nh hn vi khun nhiu ln l nh sinh lớ hc ngi Nga D.I Ivanovskii (1864 1920) ễng chng minh cú s tn ti ca loi vi sinh vt siờu hin vi gõy bnh khm (mosaic) lỏ thuc lỏ nm 1892 n nm 1897 nh khoa hc H Lan M.W Beijerinck (1851 - 1931) gi loi vi sinh vt ny l virut (virus) theo ting La tinh cú ngha l nc c n nm 1917 thỡ F.H d Hộrelle (1873 1949) phỏt hin cỏc virut ca vi khun v t tờn l th thc khun (Bacteriophage) Mc du L.Pasteur l ngi u tiờn chng minh c s khoa hc ca vic ch to vacxin (Vaccin, t gc La Tinh Vaccinae cú ngha l bnh u bũ) li bỏc s nụng thụn ngi Anh Edward Jenner (1749-1823) t ễng l ngi u tiờn ngh phng phỏp chng m u bũ cho ngi lnh phũng bnh u ht sc nguy him cho tớnh mng ngi Ngi t nn múng cho khoa Min dch hc (Immunology) l nh khoa hc Nga Ilya Ilitch Metchnikov (18451916) ễng ó n Paris nm 1887 gp L.Pasteur t nhng ngy u xõy dng Vin Pastuer Paris Vi lý thuyt thc bo ni ting ụng ó nhn c gii thng Nobel nm 1908 (cựng vi P.Ehrlich) Cn phi núi lờn cụng lao ca nh khoa hc ngi Anh J.Lister (1827-1912), ngi ó xut vic s dng cỏc húa cht dit khun v vic s dng phng phỏp vụ trựng phu thut Nh khoa hc Phỏp gc Nga S.N.Vinogradskii (1856-1953) l ngi u tiờn phỏt hin vi khun st (1880), vi khun lu hunh (1887), vi khun nitrat húa (1890) Nh khoa hc H Lan M.W.Beijerinck (1851-1931) l ngi u tiờn phõn lp c vi khun nt sn Rhizobium (18880, vi khun c nh m hiu khớ Azotobacter (1901), vi khun lờn men butilic, vi khun phõn gii pectin v nhiu nhúm vi khun khỏc Ngi u tiờn phỏt hin cht khỏng sinh l bỏc s ngi Anh Alexander Fleming (1881-1955) Nm 1928 ụng l ngi u tiờn tỏch c chng nm sinh cht khỏng sinh penixilin, m mt k nguyờn mi cho kh nng y lựi nhanh chúng cỏc bnh nhim khun ễng c nhn gii thng Nobel nm 1945 (cựng vi B.E.chain v H.W.Florey) Nm 1944 nh khoa hc M gc Nga S.A.Waksman phỏt hin Streptomixin v c nhn gii thu7ng3 Nobel vo nm 1952 Hng lot cỏc cht khỏng sinh quan trng khỏc ó c lien tip phỏt hin v ng dng vo cỏc nm tip sau: baxitraxin (1945), cloramphenicol (1947), polimixin (1947), clotetraxiclin (1948), xephalosporin (1948), neomixin (1949), eritromixin (1952), grizeofulvin (1959), gentamixin (1963), kasugamixin (1964), bleomixin (1965), valiaxin (1970) Nm 1897 Eduard Buchner (1860 1917) ln u tiờn chng minh c vai trũ ca enzyme quỏ trỡnh lờn men ru ễng ó nghin nỏt t bo nm men bng cỏt thch anh v ly cht dch vụ bo chit rỳt t men a vo mt dung dch cha 37% ng, sau na gi ó th sn sinh CO2 v ru etylic Khoa hc v enzyme hỡnh thnh v phỏt trin nh hang lot thnh cụng tip theo: Nm 1897 B Bertrand phỏt hin v t tờn cho nhúm coenzyme; A Haeden v Young cụ c c mt nhúm coenzyme gi l cozimaza ( sau ny c xỏc nh l NAD nicotinamid adenin dinucleotid) vo nm 1905; Sorensen chng minh nh hng ca pH n hot ng ca enzyme (1909); Neuberg xut ng húa hc ca quỏ trỡnh lờn men (1912); Betalli v Stern khỏm phỏ dehidrogenaza (1912) ; Warburg nghiờn cu v enzyme tham gia vo quỏ trỡnh hụ hp; Michaelis v Mentan xut ng hc ca hot ng ca enzyme (1913) ; J.B Sumner (1887 1955) ot gii Nobel nm 1946, ln u tiờn kt tinh c mt enzyme v chng minh bn cht protein ca enzyme ureaza ny (1929), tripsin (1931), chimochipsin (1933) ; Kelin phõn lp c xitocrom c (1933) ; H.A.Krebs v Henselei khỏm phỏ chu trỡnh ure (1933) ; Embden v Meyerhof chng minh quỏ trỡnh phõn gii ng (1933), Kuhn xỏc nh vitamin B2 l thnh phn ca enzyme vng (1935) ; H.A.Krebs tỡm chu trỡnh axit citric (1937), gii Nobel 1953 cựng vi F.A lipmann; Lipmann xỏc nh vai trũ trung tõm ca ATP quỏ trỡnh chuyn nng lng (1939 1941) ; G.W Beadle v E.L Tatum chng minh lý thuyt 1gen enzyme (1940, gii Nobel 1958 cựng vi J lederberg) ; A Kornberg khỏm phỏ ADN polimeraza (gii Nobel 1959 cựng vi S.Ochoa) Tớnh n nm 1984 ngi ta ó bit n 2477 loi enzyme khỏc v enzyme ó cú mt rt nhiu hot ng sn xut v i sng ca ngi Cựng vi vic s dng enzyme bt ng, cụng ngh enzyme ó tr thnh mt cỏc mi nhn ca Cụng ngh sinh hc Nm 1970 mt s nh bỏc hc (H.O Smith, K.W.Wilkox, T.J Kelly ln u tiờn tỏch c loi emzyme cú kh nng ct ADN nhng v trớ xỏc nh Nm 1972 nhúm bỏc hc M H Boyer, P berg, S.N Cohen ln u tiờn tng hp c mt ADN theo ý mun, ngi ta gi l ADN tỏi t hp Trong khong 1975 1977 nhúm bỏc hc M F Sanger, v W Gilbert (gii Nobel 1980) v A Maxam phỏt hin mt k thut cho phộp xỏc nh nhanh chúng trt t cỏc nucleotit AND Nm 1978 ln tiờn sn xut insulin ( cha bnh tiu ng) bng cụng ngh gen (dựng vi khun ó c ghộp gen mó húa vic sinh tng hp insulin Nm 1982 thuc insulin tỏi t hp c M v Anh cho phộp ng dng rng rói Cng vo nm ny ngi ta ó ch to thnh cụng kớch t sinh trng ngi Nm 1988 J.D Watson nhn ch trỡ D ỏn h gen ngi vi kinh phớ c Chớnh ph M u t l t USD Nm 1996 hon thnh vic khỏm phỏ h gen ca men ru (Saccharomyces cerevisiae) Nm 1997 Jan Wilmut v cỏc cng s Vin nghiờn cu Roslin, gn Edinburg (Scotland) ln u tiờn cho i cu Dolly bng k thut sinh sn vụ tớnh khụng cn ti quỏ trỡnh th tinh Ngy 26/6/2000 cựng mt lỳc cỏc nh khoa hc thuc hai nhúm nghiờn cu c lp l nhúm Consortium ca F Collins v nhúm Celera Genomics ca Vainter ó cụng b vic khỏm phỏ hu nh ton b gen ca ngi.""(Theo sỏch Vi sinh vt hc ca Nguyn Lõn Dng) Vi sinh vt hc l mt ngnh khoa hc cú tc phỏt trin mnh m, nhiu gii thng Nobel ó c trao cho cỏc nh vi sinh vt hc hoc nhng cụng trỡnh nghiờn cu trờn i tng vi sinh vt Ngy nay, vi sinh vt hc ó phỏt trin rt sõu vi hng trm nh bỏc hc cú tờn tui v hng chc ngn ngi tham gia nghiờn cu Cỏc nghiờn cu ó i sõu vo bn cht ca s sng mc phõn t v di phõn t, i sõu vo k thut cy mụ v thỏo lp gene vi sinh vt v ng dng k thut thỏo lp ny cha bnh cho ngi, gia sỳc, cõy trng v ang i sõu vo gii quyt dn bnh ung th loi ngi Mt s cỏc mc quan trng 1546- Girolamo Fracastoro (1478, 1553) cho rng cỏc c th nh l tỏc nhõn gõy bnh tt ễng vit bi th Syphilis sive de morbo gallico (1530) v t ta ca bi th ú, ngi ta dựng t tờn bnh 1590-1608- Zacharias Janssen ln u tiờn lp ghộp kớnh hin vi 1676- Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) hon thin kớnh hin vi v khỏm phỏ th gii vi sinh vt (m ụng gi l anmalcules) 1688- Nh vt hc ngi í Francisco Redi cụng b nghiờn cu v s phỏt sinh t nhiờn ca giũi 1765-1776- Spallanzani (1729-1799) cụng kớch thuyt Phỏt sinh t nhiờn 1786- Mỹller a s phõn loi u tiờn v vi khun 1798- Edward Jenner ngh phng phỏp chng m u bũ phong nga bnh u 1838-1839- Schwann v Schleiden cụng b Hc thuyt t bo 1835-1844- Basi cụng b bnh ca tm nm gõy nờn v nhiu bnh tt khỏc vi sinh vt gõy nờn 1847-1850- Semmelweis cho rng bnh st hu sn lõy truyn qua thy thuc v kin ngh dựng phng phỏp vụ khun phũng bnh 1849- Snow nghiờn cu dch t ca bnh t vựng London 1857- Louis Pasteur (1822-1895) chng minh quỏ trỡnh lờn men lactic l gõy nờn bi vi sinh vt 1858- Virchov tuyờn b t bo c sinh t t bo 1861- Pasteur chng minh vi sinh vt khụng t phỏt sinh nh theo thuyt t sinh 1867- Lister cụng b cụng trỡnh nghiờn cu v phu thut vụ khun 1869- Miescher khỏm phỏ acid nucleic 1876-1877- Robert Koch (1843-1910) chng minh bnh than vi khun Bacillus anthracis gõy nờn 1880- Alphonse Laveran phỏt hin ký sinh trựng Plasmodium gõy bnh st rột 1881- Robert Koch nuụi cy thun khit c vi khun trờn mụi trng c cha gelatin Pasteur tỡm vaccin chng bnh than 1882- Koch phỏt hin vi khun lao - Mycobacterium tuberculosis 1884- Ln u tiờn cụng b Nguyờn lý Koch Elie Metchnikoff (1845-1916) miờu t hin tng thc bo (phagocytosis) - Trin khai ni kh trựng cao ỏp (autoclave) - Trin khai phng phỏp nhum Gram 1885- Pasteur tỡm vaccin chng bnh di Escherich tỡm vi khun Escherichia coli gõy bnh tiờu chy 1886- Fraenkel phỏt hin thy Streptococcus pneumoniae gõy bnh viờm phi 1887- Richard Petri phỏi hin ta cỏch dựng hp lng (a Petri) nuụi cy vi sinh vt 1887-1890- Winogradsky nghiờn cu v vi khun lu hunh v vi khun nitrat hoỏ 1889- Beijerink phõn lp c vi khun nt sn t r u 1890- Von Behring lm khỏng c t chng bnh un vỏn v bnh bch hu 1892- Ivanowsky phỏt hin mm bnh nh hn vi khun (virus) gõy bnh khm cõy thuc lỏ 1894- Kitasato v Yersin khỏm phỏ vi khun gõy bnh dch hch (Yersina pestis) 1895- Bordet khỏm phỏ B th (complement) 1896- Van Ermengem tỡm mm bnh ng c tht (vi khun Clostridium botulinum) 1897- Buchner tỏch c cỏc men (ferments) t nm men (yeast) Ross chng minh ký sinh trựng st rột lõy truyn bnh qua mui 1899- Beijerink chng minh nhng ht virus ó gõy nờn bnh khm lỏ thuc lỏ 1900- Reed chng minh bnh st vng lõy truyn mui 1902- Landsteiner khỏm phỏ cỏc nhúm mỏu 1903- Wright v cng s khỏm phỏ Khỏng th (antibody) mỏu ca cỏc ng vt ó dch 1905- Schaudinn v Hoffmann tỡm mm bnh giang mai (Treponema pallidum) 1906- Wassermann phỏt hin xột nghim c nh b th chn oỏn giang mai 1909- Ricketts chng minh bnh St ban nỳi ỏ lan truyn qua ve l mm bnh vi khun (Rickettsia rickettsii) 1910- Rous phỏt hin ung th gia cm 1915-1917- DHerelle v Twort phỏt hin virus ca vi khun (thc khun th) 1921- Fleming khỏm phỏ lizụzim (lysozyme) 1923-Xut bn ln u cun phõn loi Vi khun (Bergeys Manual) 1928- Griffith khỏm phỏ vic bin np (transformation) vi khun 1929- Fleming phỏt hin penicillin 1931- Van Niel chng minh vi khun quang hp s dng cht kh nh ngun cung cp electron v khụng sn sinh ụxy 1933- Ruska lm chic kớnh hin vi in t u tiờn 1935- Stanley kt tinh c virus khm thuc lỏ (TMV) Domag tỡm thuc sulfamide 1937- Chatton phõn chia sinh vt thnh hai nhúm: Nhõn s (Procaryotes) v Nhõn tht (Eucaryotes) 1941- Beadle v Tatum a gi thuyt mt gen- mt enzym 1944- Avery chng minh ADN chuyn thụng tin di truyn quỏ trỡnh bin np 1946- Lederberg v Tatum khỏm phỏ quỏ trỡnh tip hp (conjugation) vi khun 1949- Enders, Weller v Robbins nuụi c virus Polio (Poliovirus) trờn mụ ngi nuụi cy 1950- Lwoff xỏc nh c cỏc thc khun th tim tan (lysogenic bacteriophages) 1952- Hershey v Chase chng minh thc khun th tiờm ADN ca mỡnh vo t bo vt ch (host) Zinder v Lederberg khỏm phỏ quỏ trỡnh ti np (transduction) vi khun 1953- Frits Zernike Lm kớnh hin vi tng phn pha (phase-contrast microscope) Medawar khỏm phỏ hin tng nhn dch (immune tolerance) Watson v Crick khỏm phỏ chui xon kộp ca ADN 1955- Jacob v Monod khỏm phỏ yu t F l mt plasmid Jerne v Burnet chng minh lý thuyt chn lc clone (clonal selection) 1959- Yalow trin khai k thut Min dch phúng x 1961- Jacob v Monod gii thiu mụ hỡnh iu ho hot ng gen nh operon 1961-1966- Nirenberg, Khorana v cng s gii thớch mó di truyn 1962- Porter chng minh cu trỳc c bn ca Globulin dch G Tng hp c quinolone u tiờn cú tỏc dng dit khun (acid nalidixic) 1970- Arber v Smith khỏm phỏ enzym gii hn (restriction endonuclease) Temin v Baltimore khỏm phỏ enzym phiờn mó ngc (reverse transcriptase) 1973- Ames trin khai phng phỏp vi sinh vt hc khỏm phỏ cỏc yu t gõy t bin (mutagens) Cohen, Boyer, Chang v Helling s dng vect plasmid tỏch dũng gen vi khun 1975- Kohler v Milstein phỏt trin k thut sn xut cỏc khỏng th n dũng (monoclonal antibodies) 1977- Woese v Fox tha nhn Vi khun c (Archaea) l mt nhúm vi sinh vt riờng bit Gilbert v Sanger trin khai k thut gii trỡnh t ADN (DNA sequencing) 1979-Tng hp Insulin bng k thut tỏi t hp ADN Chớnh thc ngn chn c bnh u 1980- Phỏt trin kớnh hin vi in t quột 1982- Phỏt trin vaccin tỏi t hp chng viờm gan B 1982-1983- Cech v Altman phỏt minh ARN xỳc tỏc 1983-1984- Gallo v Montagnier phõn lp v nh loi virus gõy suy gim dch ngi Mulli trin khai k thut PCR (polymerase chain reaction) 1986- Ln u tiờn ng dng trờn ngi vaccin c sn xut bng k thut di truyn (vaccin viờm gan B) 1990- Bt u th nghim ln u tiờn liu phỏp gen (gene-therapy) trờn ngi 1992- Th nghim u tiờn trờn ngi liu phỏp i ngha (antisense therapy) 1995- Hoa K chp thun s dng vaccin u g Gii trỡnh t h gen ca vi khun Haemophilus influenzae 1996- Gii trỡnh t h gen ca vi khun Methanococcus jannaschii Gii trỡnh t h gen nm men 1997- Phỏt hin loi vi khun ln nht Thiomargarita namibiensis; Gii trỡnh t h gen vi khun Escherichia coli 2000- Phỏt hin vi khun t Vibrio cholerae cú nhim sc th riờng bit 10 hũa tan iu hũa ỏp sut thm thu v ngoi t bo õy l s t iu chnh ỏp sut VSV ng dng : Mui tht, mui cỏ, ngõm xiro Thng hay s dng ng v mui vỡ hai loi ny cú kh nng to dung dch cú ỏp sut thm thu ln 4.1.3 Nhit Vi sinh vt cú cỏc phn ng khỏc v nhit khỏc Cn c vo quan h ca vi sinh vt vi nhit m ngi ta chia vi sinh vt thnh nhúm chớnh : vi sinh vt a lnh, vi sinh vt a m vi sinh vt a nhit v vi sinh vt a siờu nht Nhit cc tiu (0C) Nhit ti u (0C) Nhit cc i (0C) VSV a lnh 5-10 20-30 VSVa m 25-37 45-50 VSVa nhit 30 50-60 70 VSV a siờu nhit 75 85-100 110 Nhúm vi sinh vt Nhit quỏ gii hn nhit cc i s cú tỏc dng tiờu dit vi sinh vt vỡ lm mt hot tớnh enzym Kh nng chu nhit cao ca cỏc vi sinh vt khỏc l khỏc v ph thuc vo trng thỏi sinh lý ca t bo Vớ d: vi khun b tiờu dit sau 30 phỳt 60-700C; Nm b tiờu dit sau 5-10 phỳt 50-600C; Bo t b tiờu dit sau 1-1.5h 150-1600C Cn c vo nh hng ca nhit vi vi sinh vt, ngi ta cỏc bin phỏp dit trựng bng nhit cao v nhit thp (i) Dit trựng bng nhit cao cú hai hỡnh thc chớnh: bng sc núng t v sc núng khụ Dit trựng bng sc núng t Thanh trựng (Pasteurisation): Nõng nhit lờn 60-800C, sau ú lm ngui nhanh Thi gian trựng ph thuc vo nhit , loi sn phm, dung tớch sn phm m cú th kộo di t 10-30 phỳt Tuy nhiờn cng cú th tin hnh un sụi vi giõy un núng nhanh ri lm lnh t ngt cng gúp phn lm vi sinh vt cht Mc tiờu cu trựng l tiờu dit t bo sinh dng S dng phng phỏp ny trựng cỏc loi hp rau qu, nc gii khỏt u im: Tin hnh nhanh, ớt lm bin tớnh sn phm, khụng lm gim giỏ tr sn phm Nhc im: Khụng dit trựng c trit , bao gi cng cũn bo t Thi gian trựng ph thuc: - S lng vi sinh vt v bo t - Nhit tỏc ng - Dung tớch sn phm - Thnh phn húa hc ca sn phm ( hp cha cỏc cht mn, chua thỡ thi gian trựng ngn; hp cha cht nhiu du, m, thi gian trựng di) 97 Ch trựng cú th c biu din nh sau: A B C t Trong ú: A: thi gian nõng nhit; B: thi gian gi nhit; C: thi gian h nhit; t: nhit tỏc ng (Bi c thờm: c s ca quỏ trỡnh trựng hp) Tit trựng (Sterilisation): dit trựng nhit t 100-1400C khong 15-40 phỳt Mc ớch l tiờu dit t bo sinh dng v bo t ca nú u im: dit trựng trit , c ng dng dit trựng cỏc loi hp tht, cỏ c s dng phũng thớ nghim vi sinh kh trựng mụi trng nuụi cy Nhc im: d lm bin tớnh sn phm Phng phỏp trựng giỏn on Thanh trựng bng hi nc nhit 1000C 30 phỳt, lm ba ngy, mi ngy mt ln Sau mi ln trựng, sn phm c t vo t m cú nhit thớch hp cho bo t ny mm u im: Dit trựng c trit Nhc im: Tn thi gian Phng phỏp ny c s dng trựng i vi cỏc thc phm d b hng tỏc ng nhit cao Dit trựng bng sc núng khụ Phng phỏp ny c s dng dit trựng cỏc dựng kim loi, thy tinh v cỏc dng c chu nhit khỏc (sy) Cú th t núng trc tip trờn ngn la sỏt trựng cỏc dng c kim loi cú kớch thc nh (que cy ) (ii) Dit trựng bng nhit thp Nhit thp ớt cú kh nng tiờu dit vi sinh vt m ch yu ch l ỡnh ch cỏc hot ng trao i cht ca chỳng Phng phỏp ny c s dng bo qun lnh v bo qun lnh ụng Bo qun lnh: Gi sn phm t 0-60C, hỡnh thc ny cú thi gian bo qun ngn Bo qun lnh ụng: gm cú ụng thng (0-(-180)) v ụng sõu ( -80 C) Vi phng phỏp ny, t bo cú th b v quỏ trỡnh lm lnh v lm tan mu Mt nguyờn nhõn dn n lm v t bo l vic tớch lu cỏc cht in gii mu bo qun v hỡnh thnh cỏc tinh th nc t bo khc phc nhc im ny ngi ta ó b sung cỏc cht lm hn ch tc lnh sõu v lm tan nhanh nh glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Vic bo qun theo phng phỏp lnh sõu ny c thc hin cỏc thang nhit khỏc 103 nh -20 C, -30 C, -40 C, -70 C, -140C v -196 C Núi chung mc nhit cao hn -30 C cho hiu qu thp t bo chu nng mui cao sinh t cỏc cht in gii Phng phỏp bo qun ny cú hiu qu vi nhiu nhúm vi sinh vt khỏc nh nm si, nm men, vi khun, x khun v virut c bit vi phng phỏp bo qun lnh sõu nit lng l phng phỏp nng hn c Phng phỏp ny thớch hp vi nhiu i tng vi sinh vt khỏc nh vi khun, nm si, nm men, virut, to v c cỏc dũng t bo ng vt Tuy nhiờn, phng phỏp ny cng bc l mt s nhc im nh u t kinh phớ cho thit b v in, nit lng hoc ri ro nh chỏy n c bit phng phỏp ny khụng thớch hp vi cỏc chng vi sinh vt thng xuyờn dựng n Núi chung phng phỏp ny thng c dựng vi cỏc chng vi sinh vt cú nhng c tớnh quớ m khụng thớch hp vi phng phỏp ụng khụ Hỡnh Bo qun nit lng Mt s phng phỏp ph bin s dng bo qun cỏc nhúm vi sinh vt c th: Trong phn ny chỳng tụi gii thiu c th mt s phng phỏp thụng dng nht 4.1 Cỏc phng phỏp dựng cho bo qun vi khun v x khun: Bo qun vi khun: a Phng phỏp ụng khụ (Freeze drying/ lyophilization): õy l phng phỏp ph bin c s dng ti mi bo tng vi sinh vt trờn th gii Phng phỏp ụng khụ hn ch c s thay i cỏc c tớnh ca vi sinh vt v bo qun c mt thi gian di Phng phỏp ụng khụ c trỡnh by õy l phng phỏp c dựng ti NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) - Nuụi vi khun cho ụng khụ: Vi khun c cy trờn mụi trng ng thch nghiờng thớch hp Tuy nhiờn, cng cú th chun b dch vi khun trờn mụi trng dch th nhng phi lm m c t bo bng li tõm Tui ca t bo cng rt quan trng ú thng chn t bo nm pha sinh trng log - Chun b m mu: Cú th dựng mt hai loi m sau: + m huyt thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyt nga (s 3): 100 ml Thanh trựng bng phng phỏp lc vi khun, sau ú phõn 5ml vo cỏc bỡnh vụ trựng + m inositol: Mụi trng dinh dng bt s 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nc ct: 100 ml Phõn ml vo cỏc bỡnh v kh trựng ti nhit 121OC - Chun b dch t bo: Mt t bo cú ý ngha quan trng i vi cht lng bo qun Thụng thng cú th thu sinh t mi ng thch nghiờng ch dựng cho 1-2 ml m pha mu to dch huyn phự t bo Mt vi khun thụng thng cn t 1010 (i vi vi sinh vt khụng cú bo t) Mt trờn cú th gim vi cỏc vi sinh vt cú bo t Hai m pha 104 mu trờn cú th dựng vi mi vi khun nhng trng hp enterobacteria thỡ khụng dựng m huyt vỡ s gõy thay i c tớnh dch ca vi khun - Chun b ng ụng khụ: ng ụng khụ c sch sau ú ngõm qua m vi dch acid loóng (HCl 2%) v li c sch, lm khụ v chun b nỳt bụng, ng c trựng khụ hoc kh trựng theo phng phỏp thụng thng - Chun b mu trc ụng khụ: Lng dch huyn phự vi khun c a cn thn bng pipet pasteur vo ng ụng khụ khong 0.1- 0.2 ml Chỳ ý mi thao tỏc phi cn thn trỏnh dớnh mu vo thnh hay phớa trờn ca ng ụng khụ - Bc tin ụng khụ: Mc tiờu ca bc ny l lm bay hi ht nc cú th b lnh ụng to ỏ Trc tin hnh ụng khụ mu c chun b qua bc tin ụng (nh trỡnh by trờn) sau ú bc tin ụng khụ tin hnh mu c lp vo h thng ụng khụ v quỏ trỡnh lm mt nc iu kin lnh c tin hnh khong gi - To ch tht trờn ng ụng khụ: Sau bc tin ụng khụ, yờu cu phi to vt tht Vic to vt tht c thc hin vi h thng ốn hn Tuy nhiờn, hin cỏc c s bo qun vi sinh vt s dng h thng hn v to vt tht trờn thit b t ng - Hu ụng khụ: Trong bc ny mu li tip tc c lm khụ cho n m cui cựng t khong 1% Thi gian cho bc ny cú th thay i t 1-2 gi - Hn ng ụng khụ: Vic hn ng trc tip trờn thit b ụng khụ (manifold) cn cú kinh nghim v cn thn Trc ht phi tin hnh khoỏ van v sau ú mi thc hin thao tỏc hn ng ụng khụ - Kim tra chõn khụng ca ng ụng khụ: Ngi ta s dng thit b l ốn phỏt hin mc chõn khụng Vi cỏc mu t chõn khụng cn thit thỡ xut hin mu xanh tớm nht i vi cỏc mu khụng t tiờu chun thỡ khụng cú tớn hiu hoc mu tớm m - Kim tra kh nng sng ca mu: m s lng t bo l phng phỏp ch yu ỏnh giỏ cht lng bo qun Vic m c thc hin trc v sau ụng khụ Cỏc bc kim tra tip theo cú th c thc hin sau hoc nm ỏnh giỏ cht lng ca mu ụng khụ Núi chung kh nng sng ca vi sinh vt cú bo t cao hn vi sinh vt khụng cú bo t v loi gram dng cao hn vi sinh vt gram õm Tuy nhiờn, vi vi sinh vt k khớ thỡ yờu cu phi c tin hnh theo ỳng qui trỡnh, trỏnh vi sinh vt tip xỳc vi oxy - Bo qun mu: Mu thụng thng c bo qun ti 4OC hay nhit phũng b Phng phỏp gi lnh sõu: - Chun b t bo cho lnh sõu: T bo c nuụi cy trờn mụi trng v nhit thớch hp nht ti gia hoc u pha log - Pha dch t bo vi glycerol hoc DMSO ó trựng trc t nng cui cựng 10% v mt t bo 106 Dch huyn phự t bo c a vo ng lnh sõu v úng np (trong trng hp hn ng thu tinh, cn dch xanh metylene 0.05% phỏt hin cỏc ng b rũ r) Ton b mu nhit phũng 30 phỳt cho cõn bng ỏp sut thm thu v ngoi t bo Trong trng hp cú nit lng thỡ mu c chuyn sang bỡnh nit lng 105 Mu a vo lnh sõu cng cn theo tc nht nh Thụng thng tc lnh dao ng 1-3 OC/phỳt t ti nhit -30OC ban u Sau ú mu c lm lnh tip vi tc cao hn 10-15 OC/phỳt t ti nhit lnh cn thit (-100OC n -80 OC) Hin nay, ó cú cỏc thit b lm lnh sõu c chng trỡnh hoỏ vi tc mong mun Tuy nhiờn, cng cú th n gin hn l mu ban u c t ỏ khụ sau ú li a vo t lnh sõu v t thi gian vi gi t nhit -65OC Hot hoỏ mu: mu lnh (lnh sõu hay nit lng) c hot hoỏ bng cỏch lm tan nhanh ti mc cú th (thụng thng a vo t m 37 OC 40-60 giõy) Nh vy, theo cỏch trờn cú th t c kh nng sng 95% t bo sau 10 nm bo qun c Mt s phng phỏp bo qun khỏc: Bo qun trờn gelatin v silicagel Bo qun x khun: X khun mang c c tớnh ca vi khun v nm si (cú si v bo t) ú cn cú nhng phng phỏp bo qun thớch hp Thụng thng x khun cng c bo qun theo cỏc cỏch thụng thng nh cy truyn, ụng khụ v lnh sõu nh vi vi khun trờn Tuy nhiờn, cú phng phỏp kinh t m m bo cht lng chng bo qun m chỳng tụi trỡnh by õy, ú l phng phỏp bo qun t Cỏc bc tin hnh bo qun t: Chun b t: ly t lm khụ ti 150 OC gi lm cht cỏc vi sinh vt cú bo t v trng giun nu cú t sau trựng c nghin nh qua li cú kớch thc 30 mesh t sau nghin c a vo ng nghim chun b nỳt bụng v trựng 60 phỳt Trc tin hnh bo qun phi kim tra nhim s khun t bng cỏch cy vũng que cy t t ng nghim t vo mụi trng giu dinh dng cho vi khun v gi 24 OC, 28 OC v 37 OC, kim tra sau 2-4 ngy Chun b dch huyn phự x khun Nc ct vụ trựng c dựng to dch huyn phự x khun (hay bo t x khun) t ng thch nghiờng Ly ml dch huyn phự cho vo mi ng nghim v khụ ti nhit phũng (24OC) thi gian thỏng p nh vo thnh ng cho cỏc ht tỏch u v bo qun mu ti 4OC Hot hoỏ mu n gin bng cỏch ly vũng que cy mu a lờn mụi trng (thch hoc dch th) v nhit thớch hp Bo qun vi to: Vi to thụng thng c bo qun theo phng phỏp: Cy truyn, lnh sõu v ụng khụ Cỏc phng phỏp ó c trỡnh by chi tit phn vi khun Mt s im cn chỳ ý bo qun vi to l ch: Nờn dựng t bo gi pha cõn bng, phng phỏp lnh sõu cho kt qu tt hn phng phỏp ụng khụ Cỏc phng phỏp dựng cho bo qun nm si: Phng phỏp cy truyn: Phng phỏp ny thng c ng dng vi cỏc si nm cú bo t Cỏc chng nm si c nuụi trờn mụi trng thch thớch hp v cho si nm phỏt trin n mc cc i, sau ú l quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t, cỏc ng ging ny s c bo qun theo cỏc cỏch khỏc nhau: - Cỏc ng thch c t lnh (4-7 OC) - Bo qun thch di lp du: Cỏc ng thch c bo qun di lp du parafin cú t trng tng i l 0.83- 0.89 ó c kh trựng nhit 121 OC 15 phỳt Lp du cỏch b mt thch khong cm Nhit bo qun l 15-20 OC - Bo qun nc, nm si c nuụi trờn mụi trng thch a Sau si phỏt trin cc i thỡ ct thnh tng ming nh kớch thc khong mm2 v cho vo l nc ó trựng Bo qun ti nhit phũng 106 Bo qun nm si cú bo t silicagel: Chun b: - L ng silicagel (10-15ml) cú np chu nhit (st hay nha) trựng nhit 170 OC gi - Silicagel: Loi sut, khụng cú mu, kớch thc v s lng ht silicagel a vo khụng quỏ 1/3 th tớch ca l, trựng nhit 170 C gi - Mụi trng sa tỏch b (Skimmilk) 20% kh trựng t (115OC/20 phỳt) - ng thch nghiờng (cú th a petri) cha bo t nm si, tu theo tng chng, mụi trng nuụi cy m thi gian thu bo t thớch hp khỏc (10-15 ngy) Cỏch tin hnh: - Dựng pipet pasteur ly khong 3-4 ml sa trựng cho vo ng nghim cha bo t nm si, dựng que cy to dch huyn phự bo t cú mt cao nht (i vi mt s chng cú s lng bo t thp thỡ cú th to dch bo t t mt vi ng thch bo t khỏc nhau) - Dựng pipet pasteur ly dch bo t cho vo l ng silicagel Chỳ ý silicagel hỳt nc v sinh nhit ú vic a dch bo t vo phi c thc hin chu nc ỏ Lng dch bo t a vo khụng vt quỏ 1/3 th tớch ht silicagel l Sau ú dựng tay lc u m bo cỏc ht silicagel u dớnh dch bo t nm si Dỏn nhón, ghi cỏc thụng tin cn thit nh s mó chng, ngy bo qun, mụi trng v nhit thớch hp - L silicagel c y np cn thn nhng khụng cht (ni 1,5 vũng) sau ú gi bỡnh hỳt m ( m 35-40%), 25OC tun Vn cht nỳt v qun giy parafil gi 4OC Kim tra sng sút sau bo qun: Mu silicagel C, dựng que cy vụ trựng ly ht silicagel trờn mt thch mụi trng mm thúc (Maltagar), lc u cho ht silicagel tip xỳc lờn mt mụi trng nhit thớch hp, kim tra tra khun lc nm theo thi gian thớch hp Bo qun nm si cú bo t theo phng phỏp ụng khụ (freez-drying): Chun b: - ng ụng khụ sch (sonic cleaner) 15 phỳt sau ú kh trựng 170OC gi - Mụi trng sa tỏch b (Skimmilk) 20% kh trựng t (115OC/20 phỳt) - ng thch nghiờng (cú th a petri) cha bo t nm si, tu theo tng chng mụi trng nuụi cy m thi gian thu bo t thớch hp khỏc (10-15 ngy) Cỏch tin hnh: - Dựng pipet pasteur ly khong 3-4 ml sa trựng cho vo ng nghim cha bo t nm si, dựng que cy to dch huyn phự bo t cú mt cao nht (i vi mt s chng cú s lng bo t thp thỡ cú th to dch bo t t mt vi ng thch bo t khỏc nhau) - Dựng pipet pasteur ly dch bo t cho vo ng ụng khụ (0,2 - 0,3 ml), thụng thng chun b 13 ng cho mi chng Dỏn nhón, ghi cỏc thụng tin cn thit nh mó s chng, ngy bo qun, mụi trng v nhit thớch hp Sau ú y bng nỳt bụng hay giy bc - Gi -80C gi trc tin hnh ụng khụ, ng thi bt mỏy Dura-Stop, nhit t 40OC, a mu vo t ụng khụ ca Dura-Stop, bt mỏy Dura-Dry, mc chõn khụng t 45 minitor, nhit -55OC, tng nhit Dura-Stop lờn -5OC, qua ờm - Tng nhit Dura-Stop lờn 25C, t nhit cn thit, tt mỏy hỳt chõn khụng nhng khụng tt Dura-Dry - Tt Dura-Stop, ln lt ni tube mu vo h thng manifold, bt mỏy Dura-Dry, tin hnh hn ng chõn khụng t 45-48 minitor, nhit -55OC Chỳ ý: Trong trng hp ch dựng Dura-Dry cú th c thc hin nh sau: 107 - Tin hnh cỏc bc 1,2,3,4 nh trờn - Mu c tin ụng khụ -80C gi Bt mỏy Dura-Dry, t nhit -60oC n -55oC, chõn khụng 45 minitor, gn ng mu vi h thng manifold tin hnh hn ng chõn khụng t 45-48 minitor, nhit -55oC Kim tra sng sút sau ụng khụ: - M ng ụng khụ bng cỏch t núng u hn trờn ốn cn v lm lnh t ngt bng cn t - Dựng pipet pasteur ly khong 1ml nc ct vụ trựng t ng nghim cha 9,8 ml nc ct vụ trựng lm tan u mu ụng khụ Hỳt ton b dch huyn phự sang ng nghim cha 9,8 ml nc ct Trn u v nh vo v trớ khỏc (mi v trớ git) trờn mụi trng thch a thớch hp v nghiờng cho dch chy u dc theo mt hng nh hỡnh v: - Sau ú y np a, bao quanh bng parafil v nhit thớch hp - Cỏch ỏnh giỏ: Rt tt: 100 khun lc Khỏ: 50 100 khun lc Trung bỡnh: 10-50 khun lc Kộm: < 10 khun lc Khụng mc Bo qun c thc hin vi cỏc mu t khỏ tr lờn Tuy nhiờn, cú mt s nm si m khun lc mc trn lan thỡ cú th ỏnh giỏ nh sau: Nu cỏc khun lc mc u khp trờn b mt a l tt M ụng khụ l thnh cụng nu nh s khun lc mc chim ớt nht l na b mt mụi trng a petri Cỏc mu cú s lng khun lc mc di mc trờn phi lm tng mt bo t trc ụng khụ nh thay i mụi trng sinh bo t, hoc chun b dch huyn phự bo t t 3-4 ng nghim bo t nm si Bo qun nm si bng phng phỏp ụng khụ trc tip: Phng phỏp ụng khụ trc tip thc hin tng t nh phng phỏp ụng khụ ó trỡnh by trờn v c thc hin nh sau: Chun b: - ng ụng khụ sch (sonic cleaner) 15 phỳt sau ú kh trựng 170oC gi - Mụi trng L-drying chun cú thnh phn nh sau: m phosphat: 0.1M : 100 ml; Monosodium glutamat: g; Adonitol: 1.5 g; Kh trựng 115oC/20 phỳt) - ng thch nghiờng (cú th a petri) cha bo t nm si, tu theo tng chng mụi trng nuụi cy m thi gian thu bo t thớch hp khỏc (10-15 ngy) Cỏch tin hnh: - Dựng pipet pasteur ly khong 3-4 ml mụi trng ó trựng trờn cho vo ng nghim cha bo t nm si, dựng que cy to dch huyn phự bo t nm cú mt cao nht (i vi mt s chng cú s lng bo t thp thỡ cú th to dch bo t t mt vi ng thch bo t khỏc nhau) - Dựng pipet pasteur ly dch bo t cho vo ng ụng khụ (0,2 ml), thụng thng chun b 13 ng cho mi chng, dỏn nhón, ghi cỏc thụng tin cn thit nh s mó chng, ngy bo qun, mụi trng v nhit thớch hp Sau ú y bng nỳt bụng hay giy bc 108 - ng thi bt mỏy Dura-Dry, mc chõn khụng t 45 minitor, nhit -75oC, ln lt ni ampoule mu vo h thng manifold (chỳ ý khoỏ van chõn khụng ni ampoule mu vi tube manifold sau ú li m ra, m bo chõn khụng cn thit lm ụng khụ phi ln lt a mu vo tớn hiu ốn ch th cho phộp) Khi chõn khụng t 45-48 minitor, nhit -55oC tin hnh quỏ trỡnh lm khụ gi Hn kớn ampoule mu: Khi mỏy cụ Dura-Dry ang chy m bo chõn khụng cn thit, ln lt khoỏ van cho tng ampoule mu v tin hnh hn vi cỏc mu ny ti v trớ ng b tht Dựng ngn la gas t núng phn ng tht cho u cỏc phớa v xoay u cho thu tinh chy bt kớn ng Sau ú dựng ngn la gas ct ri phn trờn (ni vi manifold) v phn di cha mu Ht t li khoỏ cỏc van ca cỏc ampoule mu tip theo v hn ln lt nh trờn Kim tra cht lng sau bo qun: kim tra sng sút ca mu nm si bo qun, cú th thc hin theo cỏch ó c mụ t phn ụng khụ - Kim tra thun chng: cỏc mu c cy trờn mụi trng thớch hp v quan sỏt hỡnh thỏi v cỏc c im sinh hc c trng cn thit ỏnh giỏ kh nng nhim v c tớnh sinh hc - Thớ nghim ỏnh giỏ nhanh thi gian bo qun: cỏc mu sau ụng khụ trc tip c gi 37oC tun sng sút ca mu bo qun gim tun 37oC tng ng vi bo qun 10 nm 4oC Bo qun nm si bng phng phỏp lnh sõu -80 oC v nit lng (-196 oC): Chun b: - Chun b dung dch glycerol 10% (3 ml ng nghim) kh trựng 121 oC 15 phỳt ng nha nỳt xoỏy (2 ml), sch sonic cleaner, kh trựng 170 oC gi - Chun b mu nm si trờn mụi trng thch a cú lng bo t ln Cỏch tin hnh: - Dựng pipet pasteur hỳt khong 0,3 ml glycerol ó trựng vo ng nha ng mu Sau ú dựng dao vụ trựng ct ly ming nh mụi trng cha c si v bo t nm si cho vo ng nha Lng glycerol ph lờn ming thch mu, y nỳt v bao bng parafil sau ú dỏn nhón - Mu trc tiờn phi 5oC (to iu kin cho glycerol i vo t bo), sau ú c lm lnh sõu t 25oC xung -55oC vi tc -1oC/phỳt Trong trng hp khụng cú thit b lm lnh thỡ cú th -20oC gi, sau ú chuyn sang -80oC hay nit lng (-196oC) Chỳ ý: Vic bo qun theo phng phỏp lnh sõu thớch hp vi hu ht cỏc nm si sinh bo t v t bo cú vỏch ngn Nhng phng phỏp ny t khụng thớch hp vi cỏc nm si khụng sinh bo t v khụng cú vỏch ngn Trong trng hp ny cn nuụi cy nm si trờn mụi trng thớch hp to bo t Nu khụng khc phc c thỡ phi tin hnh nuụi trờn mụi trng dch th thu ly sinh v gi glycerol 10% nh trờn ỏnh giỏ kh nng sng ca mu bo qun: - Lm tan mu (mu ly t t lnh sõu -80oC hoc nit lng -196oC) b n nhit 37oC phỳt - Dựng que cy ly cỏc ming mụi trng thch t vo v trớ khỏc trờn mụi trng thch a thớch hp nhit thớch hp v xem kh nng mc sau thi gian thớch hp (2-4 ngy) Chỳ ý ly mu cn ly c si nm a vo mụi trng thch a Mt s iu chỳ ý i vi bo qun nm si: - nh hng ca ỏnh sỏng vi quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t: Phn ln trng hp thỡ s thnh cụng ca phng phỏp bo qun ph thuc vo s lng bo t nh sỏng l mt tỏc nhõn quan trng i vi quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t ca nm si, ỏnh sỏng cú bc súng ngn cú tỏc dng kớch thớch quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t, ỏnh sỏng gn vựng cc tớm (3100 4000 nm) cú tỏc dng thay i mu sc v kớch thc khun lc 109 - Thnh phn mụi trng: Núi chung cỏc mụi trng cú thnh phn dinh dng nghốo thỡ thng cho lng bo t ln - Trỏnh nhim cỏc mt (mite), cỏc chng nm si lu gi thng b mt phỏ hoi u tiờn chỳng n chng ging v lm hng, sau ú gõy nhim mang bo t v vi khun trờn c th t ng ny sang ng khỏc Vỡ lý trờn m cn cú bin phỏp hn ch mt, thụng thng cỏc chng ging phi c bo qun ni sch, nhit 4-8oC Phng phỏp bo qun nm men: Tng t nh nm si, cú nhiu phng phỏp bo qun nm men Chỳng tụi ch cp n cỏc phng phỏp thụng dng nht ang c s dng ti cỏc b su nm men ln trờn th gii Phng phỏp cy truyn: Cy truyn l phng phỏp n gin, nhanh v r tin cng nh thụng dng nht, nhiờn nhng hn ch ca phng phỏp ny l d nhim cng nh nhng thay i cỏc c im sinh hc, tớnh trng di truyn s l bt li bo qun theo phng phỏp ny Cy truyn trờn mụi trng dch th: - Cỏch tin hnh rt n gin l chun b 10 ml mụi trng nuụi cy nm men (thụng thng l mụi trng YM Yeast extract Maltose) l McCartney kh trựng nhit 121oC 15 phỳt Thng lm l cho mi chng bo qun - Mt vũng que cy chng nm men bo qun c a vo mụi trng bng thao tỏc vụ trựng v gi 25oC 72 gi Phi kim tra s phỏt trin ca chng bo qun - Sau ú cỏc mu c gi 4oC - Thụng thng theo cỏch ny thi gian bo qun cỏc chng thng thay i t 2- thỏng Cy truyn trờn mụi trng thch: Cy truyn trờn mụi trng thch tng t nh mụi trng dch th nhng õy mụi trng c b sung thch (1.6%) Ging sau cy c gi 72 gi nhit thớch hp t phỏt trin cn thit, sau ú c 4-8oC Theo phng phỏp ny ging cú thi gian sng lõu hn phng phỏp cy truyn dch th, thụng thng ging c bo qun t 3-6 thỏng Thi gian bo qun cú th c kộo di t 2-3 nm nu nh cỏc ng ging c bo qun du parafil ó trựng v c lờn trờn mụi trng thch cho to mt lp dy khong 1cm Phng phỏp bo qun lnh sõu v ụng khụ (xem phn cỏc phng phỏp dựng cho bo qun vi khun v x khun) 110 111 [...]... gồm 5 giới sinh vật: Sinh vật có nhân nguyên thủy, nguyên sinh vật, thực vật, nấm và động vật Ðó là hệ thống phân loại được thừa nhận rộng rãi nhất ngày nay 22 CHƢƠNG 1 -VI SINH VẬT NHÂN SƠ Mục đích: Giới thiệu nhóm vi sinh vật nhân sơ, trong đó đề cập đến hai đại diện cơ bản của nhóm này, đó là vi khuẩn và xạ khuẩn Giới thiệu hình thái, cấu tạo, sinh sản, phân loại của 2 đại diện chính này VI KHUẨN Trong... Nguyên sinh (Protista) một phần thuộc Thực vật (Plantae) Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm cổ khuẩn, vi khuẩn và nguyên sinh Trong giới nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều được coi là vi sinh vật Như vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới động vật và thực vật Người ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200 000 loài vi. .. sinh vật (100 000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90 000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn) Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật Virus là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể cho nên chưa được kể đến trong số 200 000 loài vi sinh vật nói trên Số virus đã được đặt tên là khoảng 4000 loài PHÂN LOẠI VI. .. thuộc giới sinh vật nào? Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn Từ trước đến nay có rất nhiều hệ thống phân loại sinh vật Các đơn... 2 giới là Thực vật và Động vật Năm 1866 E H Haeckel (18341919) bổ sung thêm giới Nguyên sinh (Protista) Năm 1969 R H Whitaker (1921-1981) đề xuất hệ thống phân loại 5 giới: Khởi sinh (Monera), Nguyên sinh (Protista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) và Động vật (Animalia) (hình) Khởi sinh bao gồm Vi khuẩn (Bacteria) và Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) Nguyên sinh bao gồm Động vật nguyên sinh (Protzoa),... lại thì không thấy vi sinh vật xuất hiện nữa Nhiều người cho rằng nguyên nhân chủ yếu không phải do cách ly với thế giới vi sinh vật bên ngoài mà là do cách ly với oxy không khí, một chất rất cần thiết cho quá trình tự sinh của vi sinh vật Để chấm dứt cuộc tranh luận gay gắt này, vi n Hàn lâm khoa học Pháp đã treo giải thưởng lớn cho ai hoặc chứng minh, hoặc phủ nhận được thuyết tự sinh Đến năm 1862... vi sinh vật học (nghiên cứu những cơ thể sống không nom thấy được bằng mắt thường) Năm 1683, Leeuwenhuck đã phát hiện ra những vật còn nhỏ hơn cả nguyên sinh động vật Song sự mô tả những vật còn mơ hồ, vì thế không đủ bằng chứng để hoàn toàn tin tưởng rằng lần đầu tiên trong lịch sử loài người, Leeuwenhuck là người đã thấy những sinh vật mà sau này người ta gọi là vi khuẩn Vi c cải tiến kính hiển vi. .. thực tế Vấn đề tự sinh trở thành một bộ phận tranh luận tương đối rộng rãi, đặc biệt gay go trong cuối thế kỷ 18 Ðối với người duy vật cho rằng giới vô sinh và giới hữu sinh chỉ tuân theo một số quy luật nhất định thì vi sinh vật đặc biệt là lý thú vì chúng là cầu nối độc đáo giữa vật chất sống và vật chất không sống Người sinh lực luận kế sau đó đã phủ nhận hoàn toàn khả năng tự sinh theo họ giữa... cho Sinh lý và Y học Năm 1906, ông quay lại Trung Phi để nghiên cứu về vi c kiểm soát bệnh trùng mũi khoan (trypanosomiasis), và ở đó ông đã báo cáo rằng atoxyl có tác dụng chống lại bệnh này giống như thuốc kí ninh đối với sốt rét Sau đó Koch tiếp tục công vi c thực nghiệm về vi khuẩn học và huyết thanh học Bác sĩ Koch mất ngày 27 tháng 5 năm 1910 tại Baden-Baden 18 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT Vi sinh vật. .. hay là Systematics) nghiên cứu sắp xếp các loài sinh vật Ví dụ: Linnaeus chia giới thực vật thành 24 lớp, giới động vật thành 6 lớp Ðóng góp lớn nhất của Linnaeus đối với công tác phân loại là đã nghĩ ra được một cách đặt tên sinh vật rất chặt chẽ và thuận tiện Mỗi sinh vật được gọi bằng hai tên của tiếng Latinh, tên đầu vi t hoa, chỉ Chi (Genus), tên sau vi t thƣờng, chỉ Loài (Species) Chẳng hạn trong ... cụng vic thc nghim v vi khun hc v huyt hc Bỏc s Koch mt ngy 27 thỏng nm 1910 ti Baden-Baden 18 PHN LOI VI SINH VT Vi sinh vt thuc gii sinh vt no? Vi sinh vt khụng phi l mt nhúm phõn loi sinh. .. phi s dng kớnh hin vi Vi sinh vt hc (Microbiology) l khoa hc nghiờn cu v hỡnh thỏi, cu to, c tớnh sinh lý, sinh hoỏ, di truyn v phõn loi ca cỏc vi sinh vt Gia cỏc nhúm vi sinh vt khỏc hu nh ch... Semmelweis vi bin phỏp tay, Lister vi k thut sỏt trựng, Nightingale vi vic chm súc sc kho, Jenner vi vaccin, Gram vi vic nhum vi khun, cui cựng Ehrlich (1854-1915) lm ni bt giai on ny bi nhng vi n