TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU KHAI THÁC CÁC GEN MÃ HÓA ENZYME THỦY PHÂN HECMICELLULOSE TỪ HỆ VI SINH VẬT CỘNG SINH TRONG RUỘT MỐI COPTOTERMES GESTROI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học TS ĐỖ THỊ HUYỀN Hà Nội, 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS Trương Nam Hải tạo điều kiện cho tham gia nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật di truyền, TS Đỗ Thị Huyền đã tạo điều kiện để được tham gia nghiên cứu theo hướng nghiên cứu của đề tài đã cho những kiến thức, kinh nghiệm quá trình làm đồ án và hoàn thiện đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Quỳnh Giang, ThS Nguyễn Thanh Ngọc, ThS Nguyễn Thị Thảo, ThS Dương Thu Hương đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt từng bước suốt quá trình làm thực nghiệm Đồng thời xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và chỉ bảo rất tận tình suốt thời gian thực hiện đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh – KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giảng dạy truyền đạt cho tảng kiến thức vững để tiếp thu tốt kiến thức khoa học Cuối cùng, tình cảm chân thành xin gửi tới gia đình bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nguyễn Thu Phương Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thông tin trích dẫn khóa luận ghi rõ nguồn gốc Kí tên Nguyễn Thu Phương Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu .2 Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược loài mối 1.2 Sơ lược loài mối Coptortermes gestroi 1.4 Tổng quan Lignocellulose 1.4.1 Cellulose .6 1.4.2 Lignin 1.4.3 Hecmicellulose 1.5 Tổng quan enzyme thủy phân Hecmicellulose 11 1.5.1 Xylanase 13 1.5.2 β-Mannanase 14 1.5.3 α-L-Arabinofuranosidase 14 1.5.4 α -D-Glucurnonidase 14 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Mẫu vật 15 2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc, thiết bị .15 2.1.2.1 Hóa chất 15 2.1.2.2 Enzyme 15 2.1.2.3 Máy móc thiết bị 15 2.1.3 Dung dịch môi trường sử dụng 15 2.1.3.1 Dung dịch sử dụng tách chiết tinh DNA metagenome .15 2.1.3.2 Dung dịch sử dụng điện di DNA gel agarose 16 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết AND metagenome hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối 16 2.2.2 Điện di DNA gel agarose 19 2.2.3 Tinh DNA metagenome phương pháp troughing 20 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Tách chiết tinh DNA metagenome 23 3.1 Thu ruột mối từ mối thợ thuộc chi Coptotermes gestroi .23 3.1.2.Tách chiết DNA metagenome phức hệ vi sinh vật ruột mối .24 3.2 Giải trình tự mẫu DNA metagenome xử lý trình tự thu .32 3.3 Đánh gia độ đa dạng vi sinh vật ruột mối 36 3.4 Khai thác gen mã hóa enzyme hemicellulase 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid deoxyribonucleic Bp Base pair (cặp nucleotit) EDTA Ethylene diamine tetra acid acetic EtBt Ethidium bromide Kb Kilobase OD Optical density ( mật độ tế báo quang học) PBS Phosphate buffered saline RNAse Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA CTAB Cetryl Ammonium Bromide PE Buffer PE ( đệm) VSV Vi sinh vật d H2O Nước đầy ion PEG 8OOO Polyethylene Glycol 8000 Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong bối cảnh kinh tế giới bước vào toàn cầu hóa, biến động giới ảnh hưởng tới quốc gia, có Việt Nam Trong vài năm trở lại thị trường xăng dầu biến động, tăng giá liên tục, ảnh hưởng không nhỏ tới kinh tế nước ta.Theo dự đoán nhà khoa học, trữ lượng loại nhiên liệu hóa thạch giới cạn kiệt dần vòng vài chục năm tới Thế giới bị lệ thuộc nhiều vào dầu khí, nhiều nước giới tìm cách phát triển nguồn nhiên liệu thay thế, phải kể đến nhiên liệu sinh học Cũng nhiều quốc gia khác, việc sử dụng lượng gió, lượng mặt trời, lượng từ nguồn sinh khối giải pháp áp dụng Việt Nam Và số nhiên liệu thay đó, cồn sinh học (bio ethanol) lên ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng tiêu chuẩn dễ sản xuất, giá rẻ “thân thiện” với môi trường Cồn sinh học sản xuất phương pháp lên men sản phẩm hữu có chứa hàm lượng carbonhydrate cao loại ngũ cốc chứa tinh bột chuyển hóa thành đường đơn (ngô, lúa mì, lúa mạch, gạo, ) hay loại cỏ chứa lignocellulose ( rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu, ) Là nước nông nghiệp, Việt Nam đứng hai giới xuất gạo chất thải nông nghiệp rơm rạ, cỏ, lá,vv nguyên liệu tự nhiên có sẵn cánh đồng hoa màu Ước tính hàng năm có khoảng 3040 triệu rơm rạ, triệu trấu bị bỏ phí (Tran, 2008), (Nguyen et al 2010) Gần đây, Thủ Tướng Chính Phủ định số 177/2007/QDTTg phê duyệt kế hoạch cho phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn đến năm 2025 Trong đó, nghiên cứu, sản xuất ứng dụng nhiên liệu sinh học nhấn mạnh Tuy nhiên, giá thành sản xuất cồn Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh sinh học từ phế phụ phẩm nông nghiệp cao, nguyên nhân cho chưa có nguồn enzyme chuyển hóa nhanh, hiệu lignocellulose thành đường đơn dùng lên men cồn Vì vậy, mục tiêu trước mắt phải tìm nguồn enzyme có đặc điểm tốt để dùng cho chuyển hóa lignocellulose Mối động vật chân khớp có khắp nơi tiêu hóa lignocellulose hiệu Ngoài enzyme phân giải hecmicellulose có từ thân mối, vi sinh vật cộng sinh ruột mối đóng vai trò đáng kể làm tăng hiệu chuyển hóa lignocellulose Do đó, ruột mối xem nguyên liệu tiềm để khai thác gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose cho định hướng nghiên cứu ứng dụng [9] Metagenomic phương pháp nghiên cứu metagenom – vật liệu di truyền tồn mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm genom nhiều cá sống môi trường [9] Metagenomic sử dụng rộng rãi thành công giới gần 40 năm qua [23] Một số tác giả sử dụng kỹ thuật metagenomic xây dựng thư viện DNA tách chiết thành công số dòng hecmicellulose phương pháp metagenomic từ môi trường khác mẫu đất [10], cỏ trâu bò [6] hay phân thỏ [8] Dựa vào lợi metagenomic, thực đề tài “Nghiên cứu khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi” Mục tiêu nghiên cứu Khai thác thành công gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược loài mối Mối thuộc Cánh (Isoptera), lớp Côn trùng (Insecta), loài côn trùng có đời sống xã hội, mối sống thành tập đoàn, mà hình thành từ hàng trăm hàng triệu thành viên [14] Mối có khả tiêu hóa lignocellulose, có hecmicellulose làm nguồn lượng có ích Khả có nhờ phần vào sinh vật cộng sinh ruột mối, sinh vật tiết enzyme cellulase, hecmicellulase thủy phân hoàn toàn lignocellulose thành đường [12] Có khoảng 2600 loài mối giới, chúng thường phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Theo kết nghiên cứu loài mối Việt Nam “Viện phòng trừ Mối bảo vệ công trình” (2009) có tổng số 141 loài mối thuộc họ, phân họ 38 giống mối tìm thấy Việt Nam, 120 loài số chúng định danh đầy đủ tên khoa học, 21 loài chưa định danh 1.2 Sơ lược loài mối Coptortermes gestroi Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae ) loài đặc hữu khu vực Đông Nam Á, phổ biến nơi ấm áp, lượng mưa cao, độ cao thấp khu vực đông dân Hiện khu vực phân bố chúng lan rộng đến nhiều nơi khác giới [15] Giống loài mối mọt khác, loài Coptotermes gestroi chia làm cấp chính:mối chúa, mối lính mối thợ Mối thợ có trách nhiệm nuôi dưỡng tổ chăm sóc mối khác Mối lính có trách nhiệm bảo vệ an ninh cho tổ Bề ngoài, mối lính Coptotermes gestroi có thóp trán, có cặp lông gần mép thóp Mối lính lớn mối thợ, màu trắng đục, đầu hình trứng, phân đoạn trước bụng có màu nâu đậm Cơ thể mối Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh thợ nhỏ hơn, mập màu trắng đục Mối chúa có chức sinh sản liên tục thể lớn nhiều so với mối khác Coptotermes gestroi loài mối nguy hiểm, gây hại Chúng tiêu thụ tất vật liệu có chứa liglocellulose, từ gỗ, giấy vải Chúng khoan lỗ vật liệu cao su, nhựa xốp để tìm kiếm thức ăn Chúng công sống cách tiêu thụ tâm gỗ làm suy yếu, đổ Chúng sống lòng đất xây dựng tổ thông qua khe, vết nứt đất Chúng ăn gỗ từ bên bên ngoài, để lại lớp màng mỏng bề mặt sàn mảng phồng rộp [25] Theo số nghiên cứu, chiết xuất protein thô từ C gestroi thu hiệu lượng enzym khoảng pH rộng loạt polysaccharides tự nhiên chứa nhiều liên kết glycosidic Phương pháp phân tích protein xác định thành công 55 loại protein khác phân loại thành 29 họ CAZy Dựa tổng số peptide xác định, phần lớn thành phần tìm thấy C gestroi digestome enzyme cellulose , enzyme Xylanolytic, men Mannan-thủy phân, pectinaza enzyme phân hủy tinh bột Phân tích proteomic toàn diện, tiết lộ sưu tập đầy đủ enzym thủy phân bao gồm cellulase (GH1, GH3, GH5, GH7, GH9 CBM 6), hemicellulases (GH2, GH10, GH11, GH16, GH43 CBM 27) pectinaza (GH28 GH29 ) Dựa kết này, nhà nghiên cứu kết luận cộng đồng vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi có vai trò quan trọng tiêu hóa thức ăn liglocellulose [25] Nguyễn Thu Phương Lớp K35C – Sinh cứu theo cách tiếp cận gen mã hóa protein giống expansin Bacillus, beta-glucosidase vi sinh vật ruột mối, feruloyl esterase vi sinh vật ruột mối 3.2 Giải trình tự mẫu DNA metagenome xử lý trình tự thu Giải trình tự genomes hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối thực theo phương pháp metagenomics sequencing sau: Hệ genome tinh giải trình tự toàn hệ thống máy giải trình tự Illumina’s HiSeq (BGI, Hồng Kông) để kho liệu thô Toàn liệu thô có kích thước 5,618.21 M bp loại bỏ trình tự đọc có chất lượng không tốt, chứa "N" thu liệu có chất lượng tốt 5,431.60 M bp Cụ thể việc giải trình tự thực theo bước sau : Dữ liệu thô ban đầu Dữ liệu có ích Loại bỏ đầu đọc chứa “N” Loại bỏ trình tự genomes vật chủ Loại bỏ adapter Dữ liệu xử lý Loại bỏ đầu đọc chứa ‘N’ Loại bỏ đầu đọc chứa N bp trình tự adapter, xử lý liệu thu Chúng xây dựng đồ liệu trình tự genomes vật chủ, loại bỏ đầu đọc tương ứng ( trình tự giống 90 % đầu đọc bị loại bỏ) thêm liệu có ích, điều cần thiết Các đoạn trình tự sau so sánh tương đồng để lắp ghép thành trình tự liên tục Các trình tự gọi contig (Hình 3.9) Nguyễn Thu Phương 32 Lớp K35C – Sinh Hình 3.9: Ví dụ cách xếp trình tự để tạo thành contig Các trình thuộc gen trình phân cắt ngẫu nhiên gây xáo trộn nối lại thấy đoạn có trình tự gối lên chứng tỏ trước cắt đoạn nối liền Ta nối đoạn có trình tự gối với nhau, sau cắt bỏ trình tự gối để thu contig hoàn chỉnh Hình 3.10 thể phân bố kích thước đoạn contig Số lượng contig có kích thước nhỏ lớn so với contig có kích thước lớn Nguyễn Thu Phương 33 Lớp K35C – Sinh Hình 3.10: Phân bố kích thước đoạn contig Sau phần mềm Soapalignier trình tự thư viện so sánh tương đồng với contig để tìm read có chất lượng cao, mang toàn gen hay mang vùng gen chức Chỉ số PE số lượng đoạn trình tự có đầu tận tương đồng với đoạn trình tự khác đầu tận xác Những đoạn trình tự có đầu hai đầu không (các lỗi xảy trình giải trình tự nên đoạn trình tự DNA tương đồng với contig) gọi đoạn SE Dựa số K (phân tích thống kê) chọn 18,709,714 trình tự PE tổng số 54,316,028 (Bảng 1) Nguyễn Thu Phương 34 Lớp K35C – Sinh Bảng 1: Các đoạn đọc sử dụng cho lắp ghép Bản đồ contig Mẫu K-mer Trình tự đọc PE SE tổng số Tỉ lệ (%) Termite-2 K41 18,709,714 3,063,638 54,316,028 40.09 Termite-2 K43 18,657,620 3,093,130 54,316,028 40.04 Termite-2 K45 18,614,692 3,133,613 54,316,028 40.04 Termite-2 K47 18,444,742 3,030,261 54,316,028 39.54 Termite-2 K49 18,252,980 3,039,030 54,316,028 39.20 Sử dụng phầm mềm MetaGeneAnnotator, tìm ra contig mã hóa cho protein chức (ORF-khung đọc mở mã hóa cho protein có chức năng) Kết trình bày Bảng Bảng 2: Tóm tắt kết dự đoán gen Mẫu Termite-2 #ORFs 125,431 Nguyễn Thu Phương Tổng chiều dài (bp) 78,271,365 Chiều ORF dài trung hoàn bình (bp) chỉnh 624.02 37,545 35 Fragmental ORFs Phạm vi 87,886 95.87 gen Lớp K35C – Sinh 3.3 Đánh gia độ đa dạng vi sinh vật ruột mối Hình 3.11: Biểu đồ tỷ lệ có mặt giới sinh vật có ruột mối Qua bảng ta thấy mật độ phân bố sinh vật có ruột mối Trong nhóm vi khuẩn chiếm nhiều tới 80%, nhóm vi khuẩn cổ chiếm 0,42% , nhóm sinh vật nhân chuẩn chiếm 0,58%, nhóm virut chiếm 0,2 % nhóm chưa định loại chiếm đến 18.79% Các trình tự có ý nghĩa so sánh với trình tự genome ngân hàng gen NCBI, RDP, liệu genome nấm Kết (bảng 3) Bảng 3: Bảng thống kê độ đa dạng vi sinh vật ruột mối Phylum Class Order Family Genus Species Archaea 10 15 21 47 61 Bacteria 22 41 97 217 628 1368 Eukaryota 20 14 25 33 43 24 11 13 138 282 731 1460 Viruses Total 46 Nguyễn Thu Phương 65 36 Lớp K35C – Sinh 3.4 Khai thác gen mã hóa enzyme hemicellulase Sử dụng BlastP để tìm kiếm khung đọc mở (ORF) tương đồng thư viện eggNOG KEGG, kết cho thấy có 12 000 khung đọc mở có liên quan đến chu trình chuyển hóa carbon Đây nhóm trình tự quan tâm để khai thác (Hình 3.12) Hình 3.12: Phân loại đường KEGG Hình 3.13: Biểu đồ thể % nhóm enzyme Lignocellulolytic tổng số enzyme có vi sinh vật cộng sinh ruột mối Nguyễn Thu Phương 37 Lớp K35C – Sinh Trong nhóm enzyme Lignocellulolytic chiếm 584,7% , lại nhóm enzyme khác chiếm 7924,93%, nhóm vai trò việc thủy phân lignocellulose mà chúng tham gia cu trình chuyển hóa cacbon Trong tổng số 290 000 ORF, lọc 8508 ORF (2.93%) có chức liên quan đến trình trao đổi carbohydrate Tuy nhiên, số ORF này, có 441(5.18%) đoạn ORF chưa xác định thuộc nhóm enzyme, protein có 585 ORF (6.88%) mã hóa cho cellulase, hemicellulase, lại số lượng lớn enzyme khác (7482 ORF) tham gia trình chuyển hóa đường Điều cho thấy hệ vi sinh vật ruột mối có khả sử dụng nhiều nguồn cacbon khác tạo nguồn lượng lớn để mối sử dụng Số ORF thuộc nhóm enzyme mã hóa cho hemicellulase gồm loại:alpha-galactosidase, alpha-glucuronidase, alpha-N-arabinofuranosidase, arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase, endo1,4-beta-xylanase, mannan endo-1,4-beta-mannosidase, xylan 1,4-betaxylosidase (bảng 4): Bảng 4: Sự đa dạng enzyme thủy phân hecmicellulose hệ vi sinh vật ruột mối STT Mã EC Hemicellulase mã hóa từ gen Complete Lack Lack Lack both Total 5'-end 3'-end ends 3.2.1.22 alpha-galactosidase 20 22 26 77 3.2.1.139 alpha-glucuronidase 20 3.2.1.55 11 14 29 69 3.2.1.99 12 3.2.1.8 endo-1,4-beta-xylanase 10 27 3.2.1.78 mannan endo-1,4-betamannosidase 1 alpha-N15 arabinofuranosidase arabinan endo-1,5-alpha-Larabinosidase Nguyễn Thu Phương 38 Lớp K35C – Sinh 3.2.1.37 xylan 1,4-beta-xylosidase 12 16 11 48 Total 130 145 205 584 104 Đồ thị hóa bảng ta có (hình 3.14): Hình 3.14 Sự đa dạng enzyme thủy phân hecmicellulose hệ vi sinh vật ruột mối Trong số ORF mã hóa cho hemicellulase số ORF mã hóa cho enzyme alpha-galactosidase chiếm tỉ lệ lớn (29,73%), tiếp alpha-Narabinofuranosidase chiếm tỉ lệ 26,64% Tuy nhiên,các ORF mã hóa cho enzyme thủy phân hemicellose mà không mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose, lignin (hợp chất khó phân hủy có thành phần lignocellulose) Điều chứng tỏ chế sinh hóa ruột mối nguồn chất xúc tác đầy tiềm Nguyễn Thu Phương 39 Lớp K35C – Sinh Sau kết thúc trình xử lý, phân tích liệu, khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi (Hình 3.15): No Gene code Identity Gene name Activity Termite-2_GL0070950 Termite-2_GL0076873 Termite-2_GL0080470 57.44 58.72 27.5 alpha-glucuronidase alpha-glucuronidase alpha-glucuronidase Enzyme code 3.2.1.139 3.2.1.139 3.2.1.139 Termite-2_GL0005721 43.41 alpha-galactosidase 3.2.1.22 Termite-2_GL0050278 50.13 alpha-galactosidase 3.2.1.22 Termite-2_GL0071480 47.27 alpha-galactosidase 3.2.1.22 Termite-2_GL0095952 53.56 alpha-galactosidase 3.2.1.22 Termite-2_GL0109301 69.16 alpha-galactosidase 3.2.1.22 Termite-2_GL0114552 28.85 alpha-galactosidase 3.2.1.22 10 Termite-2_GL0120095 64.11 alpha-galactosidase 3.2.1.22 11 Termite-2_GL0123535 43.79 alpha-galactosidase 3.2.1.22 12 Termite-2_GL0125198 48.58 3.2.1.22 13 Termite-2_GL0001262 65.89 14 Termite-2_GL0067868 25.5 15 Termite-2_GL0072252 24.83 16 Termite-2_GL0073471 31.15 17 Termite-2_GL0076106 64.44 18 Termite-2_GL0090776 25.99 19 Termite-2_GL0091901 35.51 20 Termite-2_GL0092519 21 Termite-2_GL0093723 24.12 27.5 alpha-galactosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-beta- Nguyễn Thu Phương aguA aguA aguA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.22A, melA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.22A, melA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.22A, melA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.22B, galA, rafA E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, 40 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 Lớp K35C – Sinh 22 Termite-2_GL0104795 69.49 23 Termite-2_GL0106554 68.1 24 Termite-2_GL0112518 55.52 25 Termite-2_GL0010336 65.59 26 Termite-2_GL0021085 36.81 27 Termite-2_GL0024829 26.38 28 Termite-2_GL0028245 55.85 29 Termite-2_GL0051579 39.67 30 Termite-2_GL0072752 35.02 31 Termite-2_GL0074253 60.89 32 Termite-2_GL0074257 45.84 33 Termite-2_GL0074258 54.14 34 Termite-2_GL0075126 59.21 35 Termite-2_GL0075711 34.02 36 Termite-2_GL0076016 83.08 37 Termite-2_GL0079057 28.97 38 Termite-2_GL0085651 38.46 39 Termite-2_GL0107923 58.52 40 Termite-2_GL0017317 35.01 41 Termite-2_GL0005720 31.73 42 Termite-2_GL0024062 27.27 43 Termite-2_GL0046968 35.77 xynB E3.2.1.37, xynB xylosidase xylan 1,4-betaxylosidase E3.2.1.37, xynB E3.2.1.37, xynB E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA E3.2.1.55, abfA xylan 1,4-betaxylosidase xylan 1,4-betaxylosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase alpha-Narabinofuranosidase mannan endo-1,4beta-mannosidase endo-1,4-betaxylanase endo-1,4-betaxylanase endo-1,4-betaxylanase E3.2.1.78 E3.2.1.8, xynA E3.2.1.8, xynA E3.2.1.8, xynA 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.37 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.55 3.2.1.78 3.2.1.8 3.2.1.8 3.2.1.8 Hình 3.15: Các gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi Nguyễn Thu Phương 41 Lớp K35C – Sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu trình thực đề tài, rút số kết luấn sau: • Phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ sinh vật cộng sinh ruột mối hoàn thiện • Kết khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi thu nhận với chất lượng tốt KIẾN NGHỊ • Tiếp tục tìm gen mã hóa hecmicellulose dựa vào cặp mồi thiết kế • Dựa vào kết thu tiếp tục thí nghiệm nghiên cứu biểu gen tối ưu hóa điều kiện hoạt động enzyme tham gia thủy phân hecmicellulose Nguyễn Thu Phương 42 Lớp K35C – Sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga ( 2004), “Hình thái-giải phẫu học thực vật” , NXB Đại học Sư phạm, Hà Nội, 57-58 Hồ Diên Vĩnh (2012), “ Nghiên cứu tạo thư viện metagenome từ vi khuẩn cộng sinh ruột mối dùng cho việc sàng lọc enzym tham gia thủy phân lignocellulose”, Đại học Khoa học tự nhiện, Hà Nội Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), “Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23, 75-85 Tài liệu nước Bronnenmeier K, Meissner H, Stocker S, Staudenbauer WL (1995), “alpha-D-glucuronidases from the xylanolytic thermophiles Clostridium stercorarium and Thermoanaerobacterium saccharolyticum”, Microbiology, 141 ( Pt 9):2033-40 Dalia Shallom, Yuval Shoham (2013), “Microbial hemicellulases”, Current Opinion in Microbiology, 219–228 Duan CJ, Xian L, Zhao GC, Feng Y, Pang H, Bai XL, Tang JL, Ma QS, Feng JX (2009), “Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens”, J Appl Microbiol , 107(1): 245-56 de Sanctis D, Inácio JM, Lindley PF, de Sá-Nogueira I, Bento I (2010), “New evidence for the role of calcium in the glycosidase reaction of GH43 arabinanases”, FEBS J, 277(21):4562-74 Nguyễn Thu Phương 43 Lớp K35C – Sinh Feng Y, Duan CJ, Pang H, Mo XC, Wu CF, Yu Y, Hu YL, Wei J, Tang JL, Feng JX (2007), “Cloning and identification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of the expressed cellulases”, Appl Microbiol Biotechnol, 75(2):319-28 Franco Cairo JP, Leonardo FC, Alvarez TM, Ribeiro DA, Büchli F, Costa-Leonardo AM, Carazzolle MF, Costa FF, Paes Leme AF, Pereira GA, Squina FM (2011), “Functional characterization and target discovery of glycoside hydrolases from the digestome of the lower termite Coptotermes gestroi”, Biotechnol Biofuels, 4, 50 10 Gillespie DE, Brady SF, Bettermann AD, Cianciotto NP, Liles MR, Rondon MR, Clardy J, Goodman RM, Handelsman J (2002), “Isolation of antibiotics turbomycin a and B from a metagenomic library of soil microbial DNA”, Appl Environ Microbiol, 68(9): 4301-6 11 Harnpicharnchai P, Thongaram T, Sriprang R, Champreda V, Tanapongpipat S, Eurwilaichitr L (2007), “An efficient purification and fractionation of genomic DNA from soil by modified troughingmethod”, Lett Appl Microbiol, 45(4):387-91 12 He S, Ivanova N, Kirton E, Allgaier M, Bergin C, Scheffrahn RH, Kyrpides NC, Warnecke F, Tringe SG, Hugenholtz P (2013), “Comparative metagenomic and metatranscriptomic analysis of hindgut paunch microbiota in wood- and dung-feeding higher termites”, PLoS One, 8(4):e61126 13 Joseph Sambrook, David W Russell (2006), “Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform”, CSH Protoc, 2006(1) 14 Kambhampati S, Kjer KM, Thorne BL (1996), “Phylogenetic relationship among termite families based on DNA sequence of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene”, nsect Mol Biol, 5(4):229-38 Nguyễn Thu Phương 44 Lớp K35C – Sinh 15 Li HF, Fujisaki I, Su NY (2013), “Predicting habitat suitability of Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae) with species distribution models”, J Econ Entomol, 106(1):311-21 16 Nurizzo D, Nagy T, Gilbert HJ, Davies GJ (2002), “The structural basis for catalysis and specificity of the Pseudomonas cellulosa alpha-glucuronidase, GlcA67A”, Structure, 10(4):547-56 17 Prakash R, Johnston SL, Boldingh HL, Redgwell RJ, Atkinson RG, Melton LD, Brummell DA, Schröder R (2012), “Mannans in tomato fruit are not depolymerized during ripening despite the presence of endoβ-mannanase”, J Plant Physiol, 169(12):1125-33 18 Roos AA, Edlund U, Sjöberg J, Albertsson AC, Stålbrand H (2008), “Protein release from galactoglucomannan hydrogels: influence of substitutions and enzymatic hydrolysis by beta-mannanase”, Biomacromolecules, 9(8):2104-10 19 Sanchez-Silva L, López-González D, Villaseñor J, Sánchez P, Valverde JL (2012), “Thermogravimetric-mass spectrometric analysis of lignocellulosic and marine biomass pyrolysis”, Bioresour Technol, 109:163-72 20 Shallom D, Belakhov V, Solomon D, Gilead-Gropper S, Baasov T, Shoham G, Shoham Y (2002), “The identification of the acid-base catalyst of alpha-arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6, a family 51 glycoside hydrolase”, FEBS Lett, 514(2-3):163-7 21 Shallom D, Shoham Y (2003), “Microbial hemicellulases”, Curr Opin Microbiol, 6(3):219-28 Nguyễn Thu Phương 45 Lớp K35C – Sinh 22 Spanton SG, Prestwich GD (1981), “Chemical self-defense by termite workers: prevention of autotoxication in two rhinotermitids”, Science, 214(4527):1363-5 23 Valenzuela L, Chi A, Beard S, Orell A, Guiliani N, Shabanowitz J, Hunt DF, Jerez CA (2006), “Genomics, metagenomics and proteomics in biomining microorganisms”, Biotechnol Adv, 24(2), 197-211 24 Warnecke F, Luginbühl P, Ivanova N, Ghassemian M, Richardson TH, Stege JT, Cayouette M, McHardy AC, Djordjevic G, Aboushadi N, Sorek R, Tringe D, Madejska SG,Podar J, Kirton K, Mikhailova M, Martin HG, Kunin V, Dalevi D, Szeto E, Salamov A, Barry E, Platt N, Kyrpides NC, Matson EG, Ottesen EA, Zhang X,Hernández M, Murillo C, Acosta LG, Rigoutsos I, Tamayo G, Green BD, Chang C, Rubin EM, Mathur EJ, Robertson DE, Hugenholtz P, Leadbetter JR (2007), “Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite”, Nature, 450(7169):560-5 Tài liệu web: 25 http://tainguyenso.vnu.edu.vn/xmlui/handle/123456789/2522 Nguyễn Thu Phương 46 Lớp K35C – Sinh [...]... nhiên liệu sinh học nhờ các enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối có một ý nghĩa rất lớn Do đó, vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối là rất cần thiết Trong nghiên cứu này, DNA metagenome của các sinh vật trong ruột mối được tách chiết và tinh sạch thành công nhờ sự kết hợp các phương pháp truyền thống... metagenome này được mang đi giải trình tự và so sánh trình tự gen với các trình tự gen ngân hàng quốc tế và từ đó sẽ khai thác gen Để nghiên cứu vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi chúng tôi đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: 1 Tách DNA metagenome của vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối 2 Tinh sạch DNA metagenome... đoạn ruột nối liền với phần mấu cũng sẽ ra theo và ta bảo quản ruột mối trong đệm PBS trong suốt quá trình mổ Kết quả chúng tôi đã tách được ruột mối (hình 3.1): Hình 3.1: Hình ảnh ruột mối thu được dưới kính hển vi Nguyễn Thu Phương 23 Lớp K35C – Sinh 3.1.2.Tách chiết DNA metagenome của phức hệ vi sinh vật ruột mối Vi sinh vật trong ruột mối có tới 99% là các vi sinh vật không nuôi cấy được Do đó để phân. .. mẫu trong nitơ lỏng để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào vi sinh vật bằng enzyme, nhưng với phương pháp thông thường này, chúng tôi đã không thu được metagenome vi sinh vật ruột mối Có thể là trong quá trình xử lý mẫu ruột mối và phá vỡ tế bào vi sinh vật, các nuclease nội bào của chính tế bào ruột mối cũng như của vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối được giải phóng ra khỏi tế bào Lượng nuclease này và các. .. vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối đủ tiêu chuẩn cho giải trình tự DNA metagenome bằng máy giải trình tự thế hệ mới Illumina 3 Khai thác gen mã hóa hemicellulase Nguyễn Thu Phương 22 Lớp K35C – Sinh 3.1 Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome 3.1 1 Thu ruột mối từ mối thợ thuộc chi Coptotermes gestroi Để thu ruột chúng tôi sử dụng mối thợ vì đây là nhóm giữ chức năng kiếm ăn cho cả tổ mối nên có hệ. .. được gen từ các vi sinh vật này đặc biệt là các gen từ vi khuẩn, đề tài đã tiếp cận phương pháp mới đó là metagenomics Phương pháp này cho phép tách hệ gen tổng số (metagenome) của hệ vi sinh vật trực tiếp từ môi trường sống của nó mà không thông qua nuôi cấy do đó sẽ giảm thiểu được sự mất mát nguồn gen quý trong quá trình thu mẫu Tuy nhiên, do tính không đồng nhất của tập hợp các tế bào vi sinh vật từ. .. của các loài vi sinh vật khác nhau, nằm ở các pha sinh trưởng khác nhau) và khả năng lớn là lẫn tạp chất từ vật chủ và môi trường sống, nên không có một phương pháp chung nào hiệu quả cho vi c tách metagenome từ mọi loại môi trường M 1 2 Hình 3.2: Ảnh điện di DNA metagenome được tách từ hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng QIAamp DNA mini kit (Qiagen) trên gel agarose 1: DNA metagenome tách từ ruột mối. .. pháp nghiền để thu mẫu ruột, chắc chắn DNA metagenome có chứa lẫn nhiều DNA của mối, dẫn tới vi c khai thác gen trong vi sinh vật ruột mối không hiệu quả Do đó, chúng tôi đã cố gắng hoàn thiện phương pháp để có thể tách chiết được mẫu với lượng DNA chủ yếu từ khu hệ vi sinh ruột mối Để làm được vi c này chúng tôi có thay đổi về phương pháp tách chiết DNA từ ruột mối, cụ thể là ruột mối sau khi thu không... : Loài mối Coptotermes gestroi 1.3 Phương pháp Metagenomic Metagenomic là phương pháp nghiên cứu về metagenom - vật liệu di truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genom của nhiều cá thế sống trong môi trường đó [9] Đây là lĩnh vực tương đối mới của nghiên cứu di truyền cho phép nghiên cứu về vi sinh vật không qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lí... tiêu hóa phát triển đồng thời với hệ vi sinh vật trong trong ruột cũng phát triển theo để phân giải được các vật chất hữu cơ có nguồn gốc hecmicellulose mà mối ăn vào [22] Trong tổ mối ta gặp nhiều nhất là mối thợ và mối lính, đặc điểm phân biệt chúng là mối lính có đầu đen, mình thuôn nhọn còn mối thợ thì đầu thường trắng hơn và mình tròn hơn [22] (hình 1.1) Theo Waenecke và cộng sự [24], vi khuẩn cộng ... tài Nghiên cứu khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi Mục tiêu nghiên cứu Khai thác thành công gen mã hóa enzyme thủy phân. .. tách chiết DNA metagenome hệ sinh vật cộng sinh ruột mối hoàn thiện • Kết khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi thu nhận... nghĩa lớn Do đó, vi c khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối cần thiết Trong nghiên cứu này, DNA metagenome sinh vật ruột mối tách chiết tinh