Đang tải... (xem toàn văn)
Ức chế vi sinh vật bằng các tác nhân vật lý và hóa học
Bài 16 Ức chế vi sinh vật tác nhân vật lý hóa học Mặc dầu đa số vi sinh vật có ích cần thiết cho nhân loại, hoạt động vi sinh vật gây nên nhiều tác hại cho người Chẳng hạn việc gây nên bệnh tật cho người, gia súc, gia cầm, việc làm hư hỏng thực phẩm, nguyên vật liệu Vì phải nắm vững phương pháp để tiêu diệt ức chế vi sinh vật có hại, làm giảm bớt thiệt hại chúng gây nên Chủ yếu : (1) - Tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cản trở lan truyền chúng (2) - Giảm bớt hạn chế vi sinh vật gây ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm phá hủy nguyên vật liệu khác Trong thời kỳ dài, từ chưa biết đến tồn vi sinh vật tổ tiên biết khơng biện pháp để tiêu độc diệt khuẩn Người Cổ Ai Cập biết dùng lửa để diệt khuẩn, dùng chất tiêu độc để xử lý vật thối rữa Người Cổ Hy Lạp biết cách xông lưu huỳnh để bảo quản vật liệu kiến trúc Người Hê-Brơ (Hebrews) có luật thiêu hủy toàn quần áo người bị bệnh hủi Hiện nay, việc nắm vững kỹ thuật tiêu diệt vi sinh vật quan trọng, chẳng hạn việc sử dụng kỹ thuật vô khuẩn nghiên cưứ vi sinh vật, việc bảo quản lương thực, thực phẩm, việc phòng chống bệnh truyền nhiễm 15.1 ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ - Diệt khuẩn hay Khử trùng (sterilization): Từ gốc La Tinh sterilis tuyệt dục, vô sinh Có nghĩa tiêu diệt tất vi sinh vật, bào tử, virus, viroid Để diệt khuẩn dùng chất diệt khuẩn (sterilant) dùng nhân tố vật lý khác - Tiêu độc hay Khử độc (disinfection) tiêu diệt, ức chế loại trừ vi sinh vật gây bệnh Mục tiêu chủ yếu tiêu diệt mầm bệnh thực tế làm giảm số lượng chung vi sinh vật Để tiêu độc cần dùng chất tiêu độc (disinfectant) Đó thường hóa chất thường dùng để tiêu độc vật liệu thể người động thực vật Các chất tiêu độc không diệt bào tử số vi sinh vật, dùng để diệt khuẩn -Tiêu độc vệ sinh (sanitization) có liên quan mật thiết với tiêu độc Trong trình tiêu độc vệ sinh số lượng vi sinh vật giảm xuống tới từ mức an toàn trở xuống sức khỏe công cộng, tức đạt đến tiêu chuẩn vệ sinh Các chất tiêu độc vệ sinh (sanitizer) thường dùng để làm môi trường vật dụng thể người động thực vật - Phịng thối (antisepsis) dùng hóa chất để khống chế vi sinh vật sinh trưởng vi sinh vật tổ chức sinh vật (các mô) Gốc Hy Lạp , anti đối kháng, sepsis nhiễm trùng máu Chất phòng thối (antiseptic) nhiều người gọi chất sát trùng chưa xác, dễ nhầm với chất diệt khuẩn (sterilant) Sử dụng chất phòng thối để phòng nhiễm khuẩn, mưng mủ nhờ tiêu diệt hay ức chế vi sinh vật gây bệnh, ngăn ngừa sinh trưởng vi sinh vật mô sinh vật, giảm thiểu tổng số vi sinh vật Độc tính chất phịng thối thấp chất tiêu độc cần tránh việc làm chết nhiều tế bào mô - Chất kháng vi sinh vật (antimicrobial agent) chia thành nhiều loại Chất diệt khuẩn (germicide), gốc La Tinh cide giết chết, chất tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh (pathogens) Như tiếng Việt có hai chữ Chất diệt khuẩn để germicide lẫn sterilant Thực chất chất gần giống nhau, sterilant có phạm vi diệt khuẩn rộng germicide Các chất diệt nấm (fungicide), chất diệt tảo (algicide), chất diệt virus (viricide) để chất tiêu diệt đối tượng riêng biệt Có hóa chất khơng làm chết vi sinh vật ức chế sinh trưởng chúng Có thể thường gặp chất ức chế vi khuẩn (bacteriostatic), chất ức chế nấm (fungistatic), theo gốc Hy Lạp statikos đình Tất chất nói thường định nghĩa dựa ảnh hưởng vi sinh vật gây hại Có loại giết chết, có loại ức chế, hầu hết trường hợp làm giảm tổng số vi sinh vật nói chung (khơng riêng vi sinh vật gây bệnh) 15.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TIÊU DIỆT VI SINH VẬT Dưới tác dụng số nhân tố gây chết quần thể vi sinh vật không chết toàn Giống sinh trưởng quần thể , chết quần thể vi sinh vật thường xảy theo phương thức số (exponential) hay phương thức logarit (logarithmic) Có nghĩa quần thể vi sinh vật giảm xuống tương ứng với khoảng cách thời gian Bảng 15.1: Thí nghiệm giết vi sinh vật nhiệt theo lý thuyết (Theo sách Prescott, Harley Klein) Phút Số lượng vi sinh vật theo số phút 106 105 104 103 102 101 Số lượng vi sinh vật bị chết phút x 105 x 104 x 103 x 102 x 10 0,9 Log10 số lượng vi sinh vật sống -1 Lấy thời gian gây chết trục hồnh ta có đường biểu thị đường thẳng Sau giảm đa số vi sinh vật sống tốc độ chết vi sinh vật giảm Đó tính đề kháng cao vi sinh vật sống sót Để nghiên cứu hiệu lực nhân tố gây chết phải xác định vi sinh vật chết Đó chuyện khó, khó xác định tế bào.Sau đưa vi khuẩn vào mơi trường ni cấy điều kiện sinh trưởng bình thường mà thấy chúng khơng sinh trưởng chứng tỏ chúng chết Với virus khơng cảm nhiễm vào vật chủ bình thưởng chứng tỏ chết Hình 15.1: Phương thức chết vi sinh vật (Theo sách Prescott, Harley Klein) Xử lý 121°C, ví dụ D 121 phút 15.3 CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA CÁC NHÂN TỐ KHÁNG VI SINH VẬT Làm chết ức chế sinh trưởng vi sinh vật không đơn giản, nhân tố kháng vi sinh vật (nhân tố làm chết ức chế sinh trưởng vi sinh vật) chịu ảnh hưởng yếu tố sau đây: 1- Số lượng quần thể vi sinh vật: Vì khoảng cách thời gian số lượng vi sinh vật chết theo cấp số nhau, thời gian làm chết lượng lớn vi sinh vật dài so với lượng nhỏ vi sinh vật Có thể tham khảo số liệu bảng 15.1 hình 15.1 Cùng nguyên lý nhân tố hóa học kháng vi sinh vật 2- Thành phần quần thể vi sinh vật: vi sinh vật khác có tính mẫn cảm khác với nhân tố gây chết: Vì nhân tố gây chết tình khác nhau, với loài vi sinh vật khác hiệu tác dụng khác Ví dụ, bào tử vi sinh vật có tính đề kháng cao rõ rệt so với tế bào dinh dưỡng tế bào non Một số lồi vi sinh vật có tính chống chịu cao so với ảnh hưởng bất lợi loài khác Ví dụ vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao có tính chống chịu với nhân tố kháng vi sinh vật cao so với vi khuẩn khác 3- Nồng độ cường độ nhân tố kháng vi sinh vật: Thông thường (không phải trường hợp) nồng độ cao nhân tố hóa học hay cường độ cao nhân tố vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật chết nhanh Nhưng hiệu suất nhân tố không phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ cường độ Trong phạm vi tương đối nhỏ tăng nhỏ nồng độ cường độ làm tăng hiệu ứng gây chết nhân tố kháng vi sinh vật Vượt qua khoảng xa tiếp tục nâng cao nồng độ cường độ không làm tăng tốc độ gây chết vi sinh vật Có lúc, nồng độ thấp lại có hiệu cao hơn, ví dụ cồn 70% có hiệu diệt khuẩn cao cồn 95%, hoạt tính chúng nâng cao có mặt nước Có tài liệu cho với nồng độ cồn cao phần protein bên tế bào vi khuẩn ngưng tụ lại làm thành vỏ bọc che chở cho vi khuẩn 4- Thời gian tác dụng: Thời gian tác dụng nhân tố kháng vi sinh vật dài số lượng vi sinh vật chết nhiều (hình 15.1) Để đạt đến mục đích diệt khuẩn thời gian tác dụng phải đủ tỷ lệ sống sót 10-6 thấp 5- Nhiệt độ: Tăng nhiệt làm tăng hiệu hoạt tính hóa chất Thơng thường với nồng độ thấp chất tiêu độc (disinfectant) hay nhân tố diệt khuẩn cần xử lý nhiệt độ cao 6- Môi trường bên vi sinh vật: Việc khống chế quần thể vi sinh vật không tách rời mà gắn với nhân tố môi trường, làm tăng hay làm giảm tác động gây chết Ví dụ điều kiện acid, nhiệt độ có hiệu diệt khuẩn cao hơn, đồ uống có tính acid nước quả, nước cà chua dễ diệt khuẩn theo kiểu Pasteur (pasteurise) so với thực phẩm có pH cao sữa chẳng hạn Nhân tố môi trường quan trọng thứ hai số chất hữu bảo vệ vi sinh vật đề kháng với tác dụng nhiệt độ hay chất tiêu độc hóa học Màng sinh học (biofilm) ví dụ rõ Các chất hữu bề mặt màng sinh học bảo vệ vi sinh vật tạo thành màng sinh học, màng sinh học vi sinh vật khó trừ khử Vì trước diệt khuẩn hay tiêu độc số vật phẩm trước hết cần rửa Đối với ống tiêm dụng cụ y khoa hay nha khoa trước diệt khuẩn cần phải rửa để tránh có mặt nhiều chất hữu giúp bảo vệ cho mầm bệnh làm tăng nguy nhiễm khuẩn Khi chế tạo nước uống cần ý nguồn nước thành phố chứa nhiều chất hữu cần dùng nhiều chlorine đủ sức tiêu độc 15.4 SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐỂ KHỐNG CHẾ VI SINH VẬT Tăng nhiệt việc dùng phương pháp vật lý khác thường dùng để diệt khuẩn Các phịng thí nghiệm vi sinh vật dùng nồi hấp áp suất cao (autoclave) để diệt khuẩn Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng xạ điện ly phương pháp vật lý thường sử dụng 15.4.1 Tăng nhiệt Người Cổ Hy Lạp biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc Tăng nhiệt đến phương pháp thường dùng để diệt khuẩn Chủ yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm sức nóng khơ Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virus, vi khuẩn nấm (bảng 15.2) Trong nước sôi sau 10 phút làm chết tế bào dinh dưỡng bào tử vi sinh vật có nhân thực Nhưng nhiệt độ sôi (100°C) không đủ sức làm chết nội bào tử vi khuẩn Bào tử vi khuẩn tồn vài nước sơi Do cách đun sơi dùng để đun nước uống để tiêu độc vật phẩm không bị phá hủy nước sôi, dùng để diệt khuẩn Bảng 15.2: Điều kiện ước chừng để diệt khuẩn sức nóng ẩm Vi sinh vật Tế bào dinh dưỡng Nấm men min., 50-60°C Nấm sợi 30 min., 62°C Vi khuẩn 10 min., 60-70°C Virus Bào tử min., 70-80°C 30 min., 80°C 2-trên 800 min., 100°C 0,5-12 min, 121°C 30 min., 60°C (Theo sách Prescott, Harley Klein) Vì tăng nhiệt biện pháp quan trọng để khống chế vi sinh vật cần có tiêu chuẩn xác hiệu suất diệt khuẩn sức nóng (heat-killing efficiency) Trước dùng điểm gây chết nhiệt (thermal death point, TDP) Đó nhiệt độ thấp đủ để diệt hết vi sinh vật dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút Nhưng vi sinh vật chết theo phương thức logarit, lý thuyết khơng tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật mẫu vật, tức phải kéo dài thời gian tăng nhiệt Vì có phương thức biểu thị xác tiếp nhận rộng rãi, Thời gian giảm thiểu thập phân (decimal reduction time, D) gọi Trị số D (D value) Trị số D thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật bào tử mẫu vật nhiệt độ định Trên đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) thấy rõ số lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt (hình 15.2) Trị số D thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần Trị số D liên quan đến tính đề kháng vi sinh vật nhiệt độ khác Từ trị số D mà tính trị số Z (Z value) Trị số Z nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D Một cách biểu thị khác trị số F (F value) thời gian cần thiết (tính min.) đủ để diệt hết quần thể tế bào bào tử nhiệt độ định (thường 121°C) Hình 15.2: Tính tốn trị số Z Căn vào trị số D nhiệt độ khác để tính trị số Z Trị số Z dùng để tính tốn mối quan hệ nhiệt độ thời gian sống sót vi sinh vật Trị số Z số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D Trong đồ thị trị số Z 10,50C Trị số D biểu thị thang logarit (Theo sách Prescott, Harley Klein) Trị số D trị số Z ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau đưa thực phẩm vào hộp hàn hộp lại Cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum Vi khuẩn gây độc tố botulism nguy hiểm Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào tử vi khuẩn có từ 1012 giảm xuống cịn bào tử (10°) Trị số D bào tử vi khuẩn 121°C 0,204 min., để tiêu diệt 1012 bào tử xuống bào tử cần 12D hay 2,5 phút Trị số Z Clostridium botulinum 10°C - tức tăng 10°C giảm 10 lần trị số D Nếu diệt khuẩn 111°C trị số D phải tăng 10 lần, tức 2,04 phút trị số 12D tăng lên đến 24,5 phút Bảng 15.3 nêu lên trị số D trị số Z số vi khuẩn thường gặp thực phẩm Bảng 15.3: Trị số D trị số Z số vi khuẩn gây bệnh gặp thực phẩm Vi sinh vật Cơ chất D(°C),phút Z (°C) Clostridium botulinum Đệm phosphat D121=0,204 10 Cl.perfringens (chủng kháng nhiệt) MT nuôi cấy D90=3-5 6-8 Salmonella Sản phẩm gà D60=0,39-0,40 4,9-5,1 Staphylococcus aureus Sản phẩm gà SP gà tây Dung dịch NạCl 0,5% D60=5,17-5,37 D60=15,4 D60=2,0-2,5 5,2-5,8 6,8 5,6 (Theo sách Prescott,Harley Klein) Có số liệu tụ cầu vàng (S.aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào môi trường hiệu bảo vệ chất hữu Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao 100°C diệt nội bào tử (endospores) vi khuẩn, cần có áp suất cao điều kiện bão hòa hới nước Thiết bị diệt khuẩn thường dùng gọi autoclave (hình 15.3) Hình 15.3: Hai loại autoclave nhỏ lớn Về autoclave tương tự nồi hầm chịu áp lực thường dùng gia đình Tùy yêu cầu mà có dùng lửa, có dùng điện, có dùng nước chuyển vào, có nhỏ, có vừa, có lớn lớn Autoclave nhà khoa học Chamberland phát minh vào năm 1884 phát minh thúc đẩy phát triển Vi sinh vật học Autoclave phải có van để đẩy hết khơng khí nồi cịn có nước bão hịa Có thể đóng van từ đầu đợi áp lực nâng lên mở van để loại hết không khí Cũng mở van từ đầu, thấy hới nước bay nhiều đóng van lại Thường diệt khuẩn 121°C (áp suất 15 pounds) 15 phút Có thể diệt hết tế bào vi sinh vật bào tử Diệt khuẩn sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy acid nucleic, làm biến tính enzym protein khác, đồng thời cịn phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật Diệt khuẩn sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để có hiệu Khi chưa loại bỏ hết khơng khí áp suất 15 pounds nhiệt độ đạt đến 121°C Các vật cần xử lý không nên xếp chật cản trở việc tiếp xúc với nước nóng Lúc diệt khuẩn bình tích lớn phải giữ thời gian dài hơn, để làm cho toàn dịch thể phải đạt tới 121°C Chẳng hạn diệt khuẩn bình lít phải xử lý 70 phút Để khắc phục nhân tố nói người ta thường xếp kèm với sinh vật thị diệt khuẩn vật phẩm Khi dùng ống (ampule) chứa mơi trường dinh dưỡng vơ khuẩn có thêm mảnh giấy có tẩm bào tử vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium sp PA3679 Diệt khuẩn xong phá vỡ ống điều kiện vô khuẩn nuôi cấy vài ngày Nếu sinh vật thi khơng sinh trưởng việc diệt khuẩn thành công Người ta thường xử lý nhiệt độ sôi sữa nhiều chất khác Phương pháp gọi phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỷ niệm phát minh ông Vào thập kỷ 60 kỷ 19 rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quản vận chuyển, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang Pháp Pasteur dùng kính hiển vi quan sát thấy rượu bị nhiễm có mặt vi khuẩn lên men lactic acetic Ông thấy xử lý nhiệt độ 55-60°C làm chết vi sinh vật bảo quản tương đối lâu dài rượu vang Năm 1886 hai nhà hóa học Đức V.H Soxhlet F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật để bảo quản sữa làm giảm việc sữa lây truyền mầm bệnh Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur với sữa nhập vào Hoa Kỳ người ta dùng phương pháp để xử lý sữa, bia, nhiều loại bđồ uống khác Phương pháp tiêu độc Pasteur khơng đạt tới mục đích diệt khuẩn đủ làm chết vi khuẩn gây bệnh, giảm mạnh vi khuẩn không gây bệnh làm hư hỏng thực phẩm làm chậm rõ rệt tốc độ biến chất thực phẩm Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa Phương pháp tương đối cổ xử lý 63 °C 30 phút Còn phương pháp thường sử dụng phương pháp khử trùng ngắn (flash Pasteurization), gọi phương pháp khử trùng ngắn nhiệt độ cao (hightemperature short-term, HTST), tức xử lý 72°C 15 giây, sau nhanh chóng làm lạnh Trong cơng nghiệp thực phẩm có lúc cịn dùng phương pháp khử trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức xử lý sữa sản phẩm sữa nhiệt độ 140150°C 1-3 giây Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, bảo quản hai tháng an tồn nhiệt độ phịng Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp khách sạn thường diệt khuẩn theo phương pháp Nhiều vật phẩm diệt khuẩn sức nóng khơ (dry heat sterilization) Đưa vật phẩm vào tủ sấy giữ nhiệt độ 160-170°C 2-3 Vi sinh vật bị chết bị oxy hóa thành phần tế bào, làm biến tính protein Mặc dầu diệt khuẩn sức nóng khơ khơng có hiệu cao sức nóng ẩm Bào tử vi khuẩn Clostridium botulinum bị chết 121°C sau phút dùng sức nóng ẩm bị chết 160°C sau Diệt khuẩn sức nóng khơ có ưu riêng khơng làm ăn mịn vật liệu thủy tinh kim loại sức nóng ẩm, dùng để xử lý dạng bột, dầu chất tương tự Hầu hết phòng thí nghiệm xửn lý hộp Petri pipét sức nóng khơ Khơng thích hợp sử dụng phương pháp để xử lý vật phẩm chất dẻo cao su Hình 15.4: Tủ sấy nhiệt độ khô 15.4.2 Nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp sử dụng để ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật Đây phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm Ở nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình sinh trưởng Một số vi sinh vật bị chết tinh thể băng phá vỡ màng tế bào,.nhưng lạnh sâu không làm chết phần lớn vi sinh vật nhiễm vật phẩm Trên thực tế nhiều phịng thí nghiệm dùng tủ lạnh sâu -30°C hay -70°C để bảo quản vi sinh vật Vì thực phẩm đơng lạnh chứa nhiều vi sinh vật, làm tan băng phải xử lý để tiêu thụ, tránh để tổn hại vi sinh vật gây bện phát triển Bảo quản lạnh giúp làm chậm sinh trưởng phát triển vi sinh vật, không đủ làm ngừng hẳn sinh trưởng Đáng mừng phần lớn vi sinh vật gây bệnh thuộc loại ưa ấm (mesophilic) không sinh trưởng nhiệt độ 4°C Các vật giữ lạnh bị hư hỏng vi khuẩn ưa lạnh (psychrophilic) chịu lạnh (psychrotrophic) có tồn nước, tủ lạnh dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm vật phẩm khác 15.4.3 Qua lọc Phương pháp qua lọc phương pháp tốt để giảm thấp quần thể vi sinh vật vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ nhiều dùng để diệt khuẩn dung dịch Qua lọc đơn giản loại vi sinh vật khỏi dung dịch khơng phải diệt khuẩn Có hai loại lọc vi sinh vật Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): loại thiết bị cấu tạo sợi hay vật chất dạng hạt, tạo thành lọc dầy với lỗ nhỏ Dưới sức hút chân khơng dung dịch lọc qua cịn vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) bề mặt lọc Nguyên liệu để làm lọc thường đất Tảo silic (dimatomaceous earth) - thiết bị lọc Berkefield Cịn dùng loại sứ (unglazed porcelain) - thiết bị lọc Chamberlain Hoặc cịn dùng thạch miên (asbestos) hay nguyên liệu khác Gần người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay cho thiết bị qua lọc tầng sâu Màng lọc hình trịn, dày khoảng 0,1mm chế tạo acetate cellulose, nitrate cellulose, polycarbonate, fluoride polyvinylidene hay chất tổng hợp khác Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2μm dùng để lọc bỏ phần lớn tế bào dinh dưỡng vi sinh vật, trừ virus Dịch lọc thường từ 1ml đến vài lít Màng lọc lắp cố định giá đặc biệt (hình 15.5) Dưới áp lực máy hút chân khơng dịch lọc chuyển sang bình vơ khuẩn Loại thiết bị màng lọc dùng ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị môi trường nuôi cấy, loại dầu, chất kháng sinh nhiều vật chất chịu nhiệt khác 10 Chẳng hạn, NAD+ coenzyme mang electron bên tế bào Nhiều vitamin mà người cần đóng vai trị coenzyme tiền chất (precursor) coenzyme Niacin lắp vào NAD+ riboflavin lắp vào FAD Các ion kim loại liên kết với apoenzyme tác dụng cofactor Mặc dù tế bào chứa số lượng lớn đa dạng enzyme chúng xếp vào nhóm (Bảng 16.2) Tên enzyme thường đặt theo tên chất mà chúng tác dụng lên loại phản ứng xúc tác Ví dụ, Lactate dehydrogenase (LDH) loại bỏ hydrogen khỏi Lactate: Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+ Lactate dehydrogenase đặt tên đầy đủ chi tiết L-Lactate: NAD oxydoreductase Tên mô tả chất loại phản ứng xác Bảng 16.2 Phân loại enzyme (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Loại enzyme Phản ứng Ví dụ phản ứng enzyme xúc tác Oxydoreductase Các phản ứng oxy Lactate dehydrogenase: hóa khử Transferase Hydrolase Lyase Isomerase Ligase Pyruvate + NADH + H Lactate + NAD+ Aspartate Carbamoyltransferase: Các phản ứng chuyển nhóm phân tử Aspartate + CarbamoylPhosphate Thủy phân phân tử Carbamoylaspartate + Phosphate Glucose-6-Phosphatease: Glucose-6-Phosphate + H2O Glucose + Pi Loại bỏ nhóm Fumarate hydratase: để tạo thành nối đôi bổ L-malate Fumarate + H2O sung nhóm vào nối đơi Các phản ứng xúc Alanine racemase: tác đồng phân hóa L-alanine D-alanine Nối phân tử nhờ Glutamine synthetase: luợng 35 ATP (hay nucleoside Glutamate + NH3 + ATP triphosphate khác) Pi Glutamine + ATP + 16.2.2 Cơ chế phản ứng enzyme Cần nhớ enzyme tăng cường tốc độ phản ứng không làm thay đổi số cân Nếu phản ứng thu nhiệt enzyme không chuyển dịch cân nhiều sản phẩm tạo thành Các enzyme nâng cao tốc độ mà phản ứng diễn theo hướng cân cuối Để hiểu enzyme xúc tác phản ứng ta xem xét diễn biến phản ứng hố học thải nhiệt bình thường sau đây: A+B C+D Khi phân tử A B tiếp cận để phản ứng chúng tạo thành phức hợp trạng thái độ chi chất sản phẩm (Hình 16.13) Hình 16.13: Coenzyme chất mang Chức coenzyme vai trò mang chất khắp tế bào Coenzyme C với enzyme E1 tham gia ch uyển hóa A thành sản phẩm B Trong trình phản ứng coenzyme C nhận X từ chất A chuyển X sang chất P phản ứng Kết coenzyme lại trở dạng ban đẩu để sẵn sàng tiếp nhận 1X khác Coenzyme không tham gia vào phản ứng mà vận chuyển X khắp tế bào (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Năng lượng hoạt hoá cần nhằm mang phân tử phản ứng tiếp xúc với theo cách xác để đạt trạng thái độ (hay chuyển tiếp) Phức hợp trạng thái 36 độ phân ly để tạo thành sản phẩm C D Sự khác mức độ lượng tự chất phản ứng sản phẩm ∆Go’ Vì vậy, ví dụ nêu cân nằm phía sản phẩm ∆Go’ âm (nghĩa sản phẩm mức lượng thấp chất) Trong hình 16.13 rõ ràng A B khơng thể chuyển hố thành C D chúng không cung cấp lượng lượng tương đương với lượng hoạt hoá Enzyme thúc đẩy phản ứng cách hạ thấp lượng hoạt hố Do nhiều phân tử chất có lượng đầy đủ để tiếp cận tạo thành sản phẩm Mặc dù số cân (hoặc ∆Go’) không thay đổi cân đạt nhanh có mặt enzyme lượng hoạt hố giảm Hình 16.14: Enzyme hạ thấp luợng hoạt hóa Trong tiến trình phản ứng hóa học nêu A B chuyển thành C D Phức hợp chuyển tiếp biểu thị AB* luợng hoạt hóa cần để đạt trạng thái Ea Đường đỏ biểu thị tiến trình phản ứng có mặt enzyme Cần ý, luợng hoạt hóa phản ứng có enzyme xúc tác thấp nhiều (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Sở dĩ enzyme có khả hạ thấp lượng hoạt hố phản ứng chúng mang chất lại gần điểm đặc biệt gọi vị trí hoạt động vị trí xúc tác để tạo thành phức hợp enzyme - chất (Hình 16.15 16.16) Sự tương tác chất enzyme diễn theo hai đường: Enzyme có hình dạng cố định, khớp với hình dạng chất giúp cho chất liên kết xác thuận lợi cho phản ứng diễn Enzyme thay đổi hình dạng gắn với chất tạo điều kiện cho vị trí xúc tác bao quanh khớp xác với chất Cơ chế diễn theo đường thứ gọi mơ hình “ổ khố chìa khố” (lock - and - key model) Theo đường thứ hai chế gọi mơ hình “khớp cảm ứng” (induced fit) Mơ hình ứng dụng cho hexokinase nhiều enzyme khác (Hình 16.16) 37 Hình 16.15 Chức enzyme Sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Việc tạo thành phức hợp enzyme - chất hạ thấp lượng hoạt hố theo số cách Chẳng hạn, cách mang chất lại gần vị trí xúc tác, thực tế, enzyme làm tăng nồng độ chúng thúc đẩy phản ứng Tuy nhiên, enzyme không đơn giản làm đậm đặc nồng độ chất chúng mà liên kết chất cho chất hướng xác với để tạo thành phức hợp trạng thái độ Một định hướng hạ thấp lượng lượng mà chất cần để đạt trạng thái độ Các hoạt tính hoạt tính khác vị trí xúc tác tăng cường phản ứng hàng trăm nghìn lần vi sinh vật sinh trưởng 200C khoảng 1130C Những nhiệt độ không đủ cao để giúp cho hầu hết phản ứng hữu vắng mặt enzyme, tế bào sống sót nhiệt độ cao dùng nhà hố học hữu q trình tổng hợp hữu thường ngày Enzyme giúp cho sống tồn cách thúc đẩy phản ứng đặc biệt nhiệt độ thấp 38 Hình 16.16 Một ví dụ tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất a) Mô hình đầy đủ hexokinase nấm men chất Glucose (màu tía) Vị trí hoạt động khe tạo thành thùy nhỏ enzyme (màu lục) thùy lớn (màu xám) (b) Khi Glucose liên kết để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất hexokinase thay đổi hình dạng bao quanh cỏ chất (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) 16.2.3 Tác động mơi trường lên hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme thay đổi rõ rệt với thay đổi yếu tố môi trường mà yếu tố quan trọng nồng độ chất Như ta biết, nồng độ chất bên tế bào thường thấp Ở nồng độ chất thấp enzyme chậm tạo thành sản phẩm tiếp xúc với phân tử chất Nếu có mặt nhiều phân tử chất enzyme liên kết chất thường xuyên tốc độ phản ứng (thường thể tốc độ tạo thành sản phẩm) lớn nồng độ chất thấp Do tốc độ phản ứng enzyme xúc tác tăng lên theo nồng độ chất (Hình 16.17) Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng khơng tăng phân tử enzyme bão hồ chất chuyển hố chất thành sản phẩm với tốc độ cực đại (Vmax) Đường cong nồng độ chất đường hyperbole (Hình 16.17) Để biết nồng độ chất mà enzyme cần để hoạt động thích hợp người ta thường dùng số Michaelis (Km) Đây nồng độ chất enzyme cần để thực nửa tốc độ cực đại dùng đại lượng đo lực thực enzyme chất Giá trị Km thấp có ý nghĩa nồng độ chất mà enzyme xúc tác phản ứng thấp.Hoạt tính enzyme thay đổi theo thay đổi pH nhiệt độ (hình 16.18) Hình 16.17 Động học Michaelis-Menten Velocity= tốc độ, Substrate concentration: nồng độ chất 39 Sự phụ thuộc hoạt tính enzyme vào nồng độ chất Đường cong chất khớp với phương trình Michaelis-Menten cho hình; phương trình liên kết tốc độ phản ứng (v) với nồng độ chất (S) sử dụng tốc độ cực đại số Michaelis (Km) Km = nồng độ chất enzyme cần để hoạt động nửa tốc độ cực đại Vmax = tốc độ tạo thành sản phẩm enzyme bão hòa chất hoạt động nhanh tối đa (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Mỗi enzyme hoạt động mạnh pH thích hợp Khi pH chệch xa khỏi giá trị tối thích hoạt tính enzyme giảm enzyme bị hư hại Với nhiệt độ enzyme có giá trị tối thích cho hoạt tính cực đại Nếu nhiệt độ tăng cao so với giá trị tối thích cấu trúc enzyme bị huỷ hoại enzyme hoạt tính Hiện tượng biến tính (denaturation) enzyme hậu giá trị độ (tột cùng) pH nhiệt độ yếu tố khác Các giá trị tối thích pH nhiệt độ enzyme vi sinh vật thường phản ánh pH nhiệt độ nơi sống chúng Do đó, ta dễ hiểu, vi khuẩn sinh trưởng tốt nhiệt độ cao thường có enzyme với nhiệt độ tối thích cao độ bền nhiệt độ lớn Hình 16.18: pH, nhiệt độ hoạt tính enzyme Sự thay đổi hoạt tính enzyme với thay đổi pH nhiệt độ Phạm vi pH nhiệt độ tượng trưng Các enzyme khác vị trí điểm tối thích hình dạng đường cong pH nhiệt độ (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) 16.2.4 Sự kìm hãm enzyme Nhiều hoá chất độc đối vi sinh vật chất độc mạnh chất kìm hãm enzyme Một chất kìm hãm cạnh tranh trực tiếp cạnh tranh với chất vị trí xúc tác enzyme ngăn cản enzyme tạo thành sản phẩm Chẳng hạn, succinate dehydrogenase enzyme xúc tác oxy hố succinate thành fumarate chu trình Krebs Acid malonic có cấu trúc tương tự succinate chất kìm hãm cạnh tranh enzyme nói Sau liên kết vào enzyme malonat không bị oxy hố việc tạo thành fumarate khơng diễn Các chất kìm hãm cạnh tranh thường chi với chất bình thường khơng thể bị chuyển hố thành sản phẩm 40 Hình 16.19: Kìm hãm cạnh tranh succinate-dehydrogenase Acid malonic có cấu trúc tương tự acid succinic chất kìm hãm cạnh tranh enzyme nói (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Các chất kìm hãm cạnh tranh sử dụng để điều trị nhiều bệnh vi sinh vật Chẳng hạn thuốc sulfa sulfanilamit chi với p-aminobenzoat phân tử dùng việc tạo thành coenzyme acid folic Các thuốc cạnh tranh với p-aminobenzoat vị trí xúc tác enzyme tham gia tổng hợp acid folic ngăn cản tạo thành acid folic kìm hãm sinh trưởng vi khuẩn Cơ thể người khơng chịu tác dụng thuốc khơng có khả tổng hợp acid folic phải thu nhận acid từ thức ăn 16.3 TÍNH CHẤT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH TRAO ĐỔI CHẤT Bộ máy điều chỉnh có vai trị phức tạp khó khăn Các đường cần phải điều chỉnh phối hợp có hiệu cho tất thành phần tế bào có mặt với số lượng thích hợp, xác Hơn tế bào vi sinh vật phải có khả đáp ứng kịp thời với thay đổi môi trường cách sử dụng chất dinh dưỡng có cách bật mở đường dị hoá có mặt chất dinh dưỡng khác Vì tất thành phần hoá học tế bào thường khơng tồn mơi trường, vi sinh vật phải tổng hợp chúng phải thay đổi hoạt tính sinh tổng hợp đáp ứng với thay đổi việc sử dụng chất dinh dưỡng Thành phần hố học mơi trường bao quanh tế bào thường xun thay đổi, q trình điều chỉnh phải động phải liên tục đáp ứng với điều kiện thay đổi Việc điều chỉnh cần thiết cho tế bào vi sinh vật trì lượng, vật chất cân trao đổi chất Nếu nguồn lượng đặc biệt mặt, enzyme cần cho việc sử dụng nguồn lượng không cần thiết việc tổng hợp chúng tiếp tục tiêu phí C, N lượng Cũng tương tự vậy, vơ ích vi sinh vật chúng tổng hợp enzyme cần cho việc tạo thành sản phẩm cuối sản phẩm có mặt với số lượng đầy đủ Như vậy, dị hoá đồng hoá điều chỉnh theo cách cho hiệu hoạt động đạt tối đa Có thể thấy rõ xu hướng trì cân bảo tồn lượng vật chất đáp ứng điều chỉnh vi khuẩn E coli Khi sinh trưởng môi trường đơn giản chứa glucose nguồn C nguồn lượng vi khuẩn tổng hợp thành phần mà tế bào cần với số lượng cân (chẳng hạn acid amin tryptophan) Việc bổ sung sản phẩm sinh tổng hợp cuối vào môi trường dẫn đến kìm hãm đường tổng hợp sản phẩm cuối nói Việc tổng hợp enzyme đường 41 bị ngừng chậm lại Nếu chuyển E coli sang môi trường chứa lactose, vi khuẩn tổng hợp enzyme cần cho chuyển hoá đường Trái lại, sinh trưởng môi trường chứa glucose lactose E coli sử dụng glucose loại đường đơn giúp cho sinh trưởng vi khuẩn diễn nhanh sau glucose cạn kiệt, lactose sử dụng Dòng carbon chuyển hố qua đường điều chỉnh theo ba cách chủ yếu: Tập trung chất trao đổi enzyme phần khác tế bào, từ ảnh hưởng đến hoạt tính đường, Các enzyme quan trọng thường kích thích bị kìm hãm trực tiếp nhằm thay đổi nhanh hoạt tính đường, Số lượng phân tử enzyme điều hồ Các phân tử chất xúc tác có mặt nhiều hoạt tính đường lớn Ở vi khuẩn, việc điều chỉnh thường chịu tác dụng mức độ phiên âm Việc điều hoà tổng hợp mRNA chậm việc điều chỉnh trực tiếp hoạt tính enzyme tiết kiệm nhiều lượng nguyên liệu enzyme khơng tổng hợp khơng cần thiết Hai chế trình bày đây, là: khu trú trao đổi chất điều hồ hoạt tính enzyme 16.4 KHU TRÚ TRAO ĐỔI CHẤT (Metabolic Channeling) Một chế khu trú trao đổi chất phổ biến chia khoang (compartmentation) nghĩa phân bố biệt hoá enzyme chất trao đổi cấu trúc tế bào tách biệt bào quan có màng bao bọc Chẳng hạn, oxy hoá acid béo gặp bên ti thể tổng hợp acid béo lại diễn tế bào chất Chu chất vi khuẩn xem ví dụ chia khoang Sự chia khoang tạo điều kiện cho việc hoạt động điều chỉnh đồng thời tách biệt đường phối hợp nhờ điều chỉnh việc vận chuyển chất trao đổi coenzyme khoang tế bào Giả dụ, có hai đường tồn khoang tế bào khác cần NAD+ cho hoạt động Sự phân bố NAD+ hai khoang định hoạt tính tương đối đường cạnh tranh đường chiếm dư thừa NAD+ có lợi Sự chia khoang gặp bên khoang tế bào chất Nền (matrix) vật thể đơng đặc, có cấu trúc gồm nhiều khoang nhỏ Ở sinh vật nhân thật chia nhỏ lưới nội chất (endoplasmic reticulum) khung tế bào (cytoskeleton) Trong môi trường chất trao đổi coenzyme không khuếch tán nhanh gradien chất trao đổi thiết lập gần enzyme hệ thống enzyme cục Điều diễn enzyme vị trí đặc biệt chuyển hố chất thành sản phẩm dẫn đến giảm nồng độ nhiều chất trao đổi tăng nồng độ nhiều chất trao đổi khác Chẳng hạn, nồng độ sản phẩm cao gần enzyme thấp dần theo khoảng cách tăng lên tính từ enzyme 42 Sự khu trú tạo thay đổi rõ rệt nồng độ chất trao đổi ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính enzyme Nồng độ chất, nói chung, thường vào khoảng 10-3 - 10-6M/l, chí thấp hơn, nghĩa phạm vi nồng độ enzyme nhỏ số Michaelis (Km) nhiều enzyme Dưới điều kiện nồng độ chất enzyme điều hồ hoạt tính chất xúc tác nồng độ chất phần tăng lên đường cong hyperbole bão hồ chất (Hình 16.20) Hình 16.20: Điều hịa hoạt tính enzyme nồng độ chất Trong hình đường cong bão hịa enzyme-cơ chất với số Michaelis (Km) tốc độ tương đương với ½ tốc độ cực đại (Vmax) Tốc độ ban đầu phản ứng (v) dựng đồ thị nồng độ chất Tốc độ cực đại tốc độ lớn đạt với số lượng enzyme cố định điều kiện xác định Khi nồng độ chất nhỏ Km hoạt tính enzyme thay đổi tuyến tính với nồng độ chất Giả dụ, nồng độ chất tăng từ mức độ A tới mức độ B Vì nồng độ phạm vi Km nên hoạt tính enzyme tăng lên rõ rệt Sự giảm nồng độ từ B đến A hạ thấp tốc độ tạo thành sản phẩm (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Khi nồng độ chất tăng, chất chuyển thành sản phẩm nhanh hơn; nồng độ chất giảm đương nhiên dẫn đến hoạt tính enzyme thấp Nếu enzyme hai đường khác sử dụng chất trao đổi chúng trực tiếp cạnh tranh chất này, đường thắng cạnh tranh này, nghĩa đường với enzyme có giá trị Km thấp chất trao đổi, hoạt động gần hoàn toàn thống trị Do khu trú bên khoang tế bào điều chỉnh phối hợp trao đổi chất thông qua biến đổi nồng độ chất trao đổi nồng độ coenzyme 16.5 ĐIỀU HÒA HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt động nhiều đường trao đổi chất điều hồ nhờ việc điều chỉnh hoạt tính enzyme điều chỉnh Mục mơ tả enzyme nói đề cập vai trị chúng việc điều chỉnh hoạt tính đường 43 16.5.1 Điều chỉnh dị lập thể Các enzyme điều chỉnh thường enzyme dị lập thể (allosteric enzymes) Hoạt tính enzyme dị lập thể bị thay đổi phân tử nhỏ gọi effector (effector, chất tác động) modulator (modulator, chất điều biến) Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực không - cộng hố trị vào vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) gây thay đổi hình dạng hình thể enzyme (Hình 16.21) Hoạt tính vị trí xúc tác bị thay đổi Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính kìm hãm enzyme Những thay đổi hoạt tính thường bắt nguồn từ biến đổi lực biểu kiến enzyme chất, nhiên thay đổi tốc độ cực đại diễn Hình 16.21: Điều chỉnh dị lập thể Cấu trúc chức enzyme dị lập thể Trong hình bên effector modulator (chất điều biến) trước hết gắn vào vị trí điều hịa tách biệt làm thay đổi hình thể enzyme dẫn đến thay đổi hình dạng vị trí hoạt động Vị trí hoạt động liên kết chất hiệu Ở effector dương tính kích thích liên kết chất hoạt tính xúc tác (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Các enzyme điều chỉnh thường enzyme dị lập thể (allosteric enzymes) Hoạt tính enzyme dị lập thể bị thay đổi phân tử nhỏ gọi effector (effector, chất tác động) modulator (modulator, chất điều biến) Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực 44 không - cộng hố trị vào vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) gây thay đổi hình dạng hình thể enzyme (Hình 16.21) Hoạt tính vị trí xúc tác bị thay đổi Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính kìm hãm enzyme Những thay đổi hoạt tính thường bắt nguồn từ biến đổi lực biểu kiến enzyme chất, nhiên thay đổi tốc độ cực đại diễn Hình 16.22: Sự điều chỉnh ACTase Phản ứng Aspartate- carbamoyltransferase vai trò enzyme việc điều chỉnh sinh tổng hợp pyrimidine Sản phẩm cuối CTP kìm hãm hoạt tính ACTase (-) cịn ATP lại hoạt hóa enzyme (+) Cacbamoyl Phosphate synthetase bị kìm hãm sản phẩm cuối đường UMP (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Các đặc tính động học enzyme không - điều chỉnh chứng minh số Michaelis (Km) nồng độ chất cần cho enzyme hoạt động tốc độ nửa tốc độ cực đại Hằng số ứng dụng cho đường cong bão hoà chất hyperbole mà khơng cho đường cong xích-ma thường gặp với enzyme dị lập thể (Hình 16.23) Nồng độ chất cần cho nửa tốc độ cực đại với enzyme dị lập thể có đường cong chất xích-ma gọi giá trị [S]0,5 K0,5 Một enzyme điều chỉnh dị lập thể nghiên cứu kỹ Aspartatecarbamoyltransferase (ACTase) E coli Enzyme xúc tác ngưng tụ cacbamoylphosphate với aspartate tạo thành cacbamoylaspartate (Hình 16.22) ACTase xúc tác phản ứng định tốc độ đường sinh tổng hợp pyrimidine E coli Đường cong chất bão hoà xích-ma nồng độ hai chất thay đổi (Hình 16.23) 45 Hình 16.23: Động học Aspartate carbamoyltransferase E coli CTP effector âm làm tăng giá trị K0,5, ATP effector dương, hạ thấp K0,5 Vmax số (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) Enzyme có vị trí hoạt động liên kết phân tử chất vào vị trí hoạt động kích thích liên kết chất vào vị trí khác Hơn nữa, cytidine triphosphate (CTP), sản phẩm cuối sinh tổng hợp pyrimidine, kìm hãm enzyme, trái lại ATP (purine) lại hoạt hoá enzyme Cả hai effector thay đổi giá trị K0,5 enzyme không thay đổi tốc độ cực đại enzyme GTP kìm hãm cách nâng cao K0,5 chuyển dịch đường cong bão hoà chất lên giá trị cao Điều cho phép enzyme hoạt động chậm nồng độ chất đặc biệt CTP có mặt ATP hoạt hố cách chuyển đường cong tới giá trị nồng độ chất thấp khiến cho enzyme hoạt động cực đại qua phạm vi nồng độ chất rộng lớn Do đó, đường hoạt động tới mức nồng độ CTP tăng cao hoạt tính ACTase giảm tốc độ tạo thành sản phẩm cuối bị chậm lại Trái lại, nồng độ sản phẩm cuối ATP tăng lên so với CTP, ATP kích thích tổng hợp CTP thông qua tác dụng lên ACTase Aspartate carbamoyltransferase E coli cung cấp ví dụ rõ rệt vị trí điều chỉnh vị trí xúc tác riêng rẽ enzyme dị lập thể Enzyme protein lớn gồm đơn vị xúc tác đơn vị điều chỉnh (Hình 16.24a) Các đơn vị xúc tác chứa vị trí xúc tác khơng chịu ảnh hưởng CTP ATP Các đơn vị điều chỉnh không xúc tác phản ứng có vị trí điều chỉnh liên kết CTP ATP Khi liên kết vào enzyme hoàn toàn effector gây thay đổi hình thể dưới-đơn vị điều chỉnh, sau đơn vị xúc tác vị trí xúc tác Enzyme thay đổi thuận nghịch dạng T hoạt động dạng R hoạt động (Hình 16.24 b, c) Do vị trí điều chỉnh ảnh hưởng đến vị trí xúc tác khoảng cách khoảng 6,0 nm 46 Hình 16.24: Cấu trúc điều chỉnh Aspartate carbamoyltransferase E coli (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) 16.5.2 Cải biến cộng hố trị enzyme Các enzyme kích thích bị kìm hãm thơng qua cải biến cộng hố trị thuận nghịch Thơng thường điều diễn việc thêm loại bỏ nhóm đặc biệt, nghĩa dạng enzyme hoạt động dạng khác Chẳng hạn, glycogen phosphorylase mốc bánh mì Neurospora crassa gọi phosphorylase a dạng phosphoryl hoá phosphorylase b dạng bị loại bỏ Phosphate (Hình 16.25) Phosphorylase b bất hoạt chất hoạt hố AMP mà cần thường khơng có mặt mức độ đủ cao Dạng phosphoryl hoá phosphorylase a hoạt động khơng có mặt AMP Glycogen phosphorylase kích thích thơng qua việc phosphoryl hóa phosphorylase b thành phosphorylase a Việc gắn nhánh Phosphate làm thay đổi hình thể enzyme chuyển thành dạng hoạt động Phản ứng phosphoryl hoá loại bỏ Phosphate xúc tác enzyme riêng rẽ enzyme điều chỉnh Hình 16.25: Sự cải biến cộng hóa trị thuận nghịch glycogen phosphorylase Phosphorylase a dạng hoạt động tổng hợp phosphoryl hóa bị bất hoạt Phosphate bị loại bỏ thủy phân để tạo thành phosphorylase b bất hoạt (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) 47 Các enzyme điều chỉnh nhờ liên kết với nhóm khác Phosphate Một enzyme nghiên cứu chi tiết Glutamine synthetase E coli Đây enzyme lớn, phức tạp tồn hai dạng Khi nhánh acid adenylic liên kết với 12 dưới-đơn vị enzyme tạo thành enzyme adenyl hoá, glutamine synthetase hoạt động yếu Việc loại bỏ nhóm AMP tạo glutamine synthetase adenyl hoạt động glutamine tổng hợp Hệ thống glutamine synthetase khác hệ thống phosphorylase hai điểm: 1) AMP dùng tác nhân cải biến; 2) Dạng cải biến Glutamine synthetase hoạt động Glutamine synthetase điều chỉnh dị lập thể Việc sử dụng cải biến cộng hoá trị để điều chỉnh hoạt tính enzyme có số ưu điểm Các enzyme chuyển hố qua lại thường enzyme dị lập thể Vì dạng đáp ứng khác với effector dị lập thể nên hệ thống enzyme cải biến cộng hố trị có khả đáp ứng với nhiều chất kích thích đường thay đổi phức tạp Cũng điều chỉnh enzyme xúc tác cải biến cộng hoá trị, bổ sung vào hệ thống mức độ điều chỉnh thứ hai 16.5.3 Kìm hãm phản hồi kìm hãm sản phẩm cuối (Feedback inhibition) Như nói phần trên, tốc độ nhiều đường trao đổi chất điều chỉnh thông qua điều khiển hoạt tính enzyme điều chỉnh Mỗi đường có enzyme dẫn-tốc độ (pacemaker) xúc tác phản ứng chậm hạn chế tốc độ đường Vì phản ứng khác diễn nhanh phản ứng dẫn-tốc độ thay đổi hoạt tính enzyme trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ đường Thông thường, bước thứ đường phản ứng dẫn tốc độ xúc tác enzyme điều chỉnh Sản phẩm cuối đường thường kìm hãm enzyme điều chỉnh Q trình nói gọi kìm hãm sản phẩm cuối Kiểu kìm hãm bảo đảm cho tạo thành cân sản phẩm cuối đường Nếu tích luỹ với nồng độ cao sản phẩm cuối kìm hãm enzyme điều chỉnh làm giảm tốc độ tổng hợp sản phẩm Khi nồng độ sản phẩm cuối giảm, hoạt tính đường lại tăng nhiều sản phẩm tạo thành Sự kìm hãm sản phẩm cuối cùng, nhờ vậy, tự động phối hợp việc cung cấp theo nhu cầu sản phẩm Aspartate carbamoyltransferase ví dụ điển hình kìm hãm sản phẩm đường sinh tổng hợp thường phân nhánh tạo thành sản phẩm cuối Trong tình việc tổng hợp sản phẩm cuối đường phải phối hợp cách xác Khơng thể để sản phẩm cuối có mặt dư thừa sản phẩm cuối khác lại thiếu Sự phân nhánh đường sinh tổng hợp thường tạo nên cân sản phẩm cuối qua việc sử dụng enzyme điều chỉnh điểm phân nhánh (Hình 16.26) Khi có mặt nồng độ dư thừa sản phẩm cuối thường kìm hãm enzyme điểm phân nhánh chuỗi dẫn đến tạo thành sản phẩm này, nhờ mà điều chỉnh việc tổng hợp sản phẩm khơng ảnh hưởng đến tổng hợp sản phẩm khác Hình 16.26 cho thấy sản phẩm kìm hãm enzyme mở đầu đường Sự dư thừa sản phẩm làm chậm dòng C vào đường kìm hãm 48 enzyme thích hợp điểm phân nhánh Vì phân nhánh khơng hoạt động cần C kìm hãm sản phẩm cuối enzyme dẫn tốc độ ban đầu giúp cho điều hoà cung cầu đường phân nhánh Việc điều chỉnh đường phân nhánh nhiều thường thực phức tạp có mặt izoenzyme tức enzyme khác xúc tác phản ứng Bước đầu dẫn tốc độ ban đầu số izoenzyme xúc tác, izoenzyme chịu điều hồ riêng rẽ độc lập Trong tình vậy, dư thừa sản phẩm cuối làm giảm hoạt tính đường khơng hồn tồn kìm hãm chức đường số izoenzyme cịn hoạt động Hình 16.26: Kìm hãm phản hồi Trên hình kìm hãm phản hồi đường phân nhánh với sản phẩm cuối Các enzyme điểm phân nhánh xúc tác chuyển hóa chất trung gian E thành F G điều chỉnh kìm hãm phản hồi Các sản phẩm P Q kìm hãm phản ứng mở đầu đường Tín hiệu ① P Q kìm hãm enzyme xúc tác bước tín hiệu (Theo Prescott, Harley Klein, 2005) 49 ... Xử lý 121°C, ví dụ D 121 phút 15.3 CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA CÁC NHÂN TỐ KHÁNG VI SINH VẬT Làm chết ức chế sinh trưởng vi sinh vật không đơn giản, nhân tố kháng vi sinh vật (nhân. .. lớn vi sinh vật dài so với lượng nhỏ vi sinh vật Có thể tham khảo số liệu bảng 15.1 hình 15.1 Cùng nguyên lý nhân tố hóa học kháng vi sinh vật 2- Thành phần quần thể vi sinh vật: vi sinh vật. .. làm chết ức chế sinh trưởng vi sinh vật) chịu ảnh hưởng yếu tố sau đây: 1- Số lượng quần thể vi sinh vật: Vì khoảng cách thời gian số lượng vi sinh vật chết theo cấp số nhau, thời gian làm chết
