BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM  MƠN: HĨA SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE GVHD: NGUYỄN THỊ TRANG NHĨM STT TÊN MSSV Hồng Thị Thanh Nga 14063011 Nguyễn Thị Đờ Lin 14049971 Nguyễn Thị Ngân 14080081 Nguyễn Thị Thảo Nguyên 14047721 Nhóm trưởng Tp.hcm, Ngày 18 tháng năm 2015 2014-2015 Mở đầu Ngày với phát triển mạnh mẽ Công Nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Trong đó, Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như; chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm cho phomát,làm mềm thịt, bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm sản xuất bia Xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm (sản xuất chất tẩy rửa, thuốc da, y tế, nông nghiệp ) Phần - Phương pháp tách chiết enzyme protease Để tách tinh chế enzyme nói chung protease nói riêng có số phương pháp hóa - lý khác Có thể chia làm ba nhóm sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) động vật (gan, dày bê, ) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Phần - Thu nhận làm enzyme protease từ vi sinh vật thực vật 2.1 Thu nhận làm enzyme protease từ vi sinh vật Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn Quá trình sản xuất chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm giai đoạn chủ yếu: Tuyển chọn cải tao giống vi Sinh vật Phương pháp bảo quản giống Vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh Tổng hợp enzyme Tách làm chế phẩm enzyme Tuy nhiên thu canh trường nồng độ enzyme thấp nên tách thu hồi enzyme có giá thành cao Tốn điện cho khuấy trộn, không bảo đảm vô trùng bị nhiễm hàng loạt, toàn gây tổn thương lớn 2.2 Tách làm chế phẩm enzyme Một điều cần nói thêm enzyme thường chứa tế bào vi sinh vật gọi enzyme tế bào (intracellular), vi sinh vật tiết môi trường sống Đó enzyme ngồi tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết enzyme ngoại bào Các phân tử enzyme khơng có khả qua màng tế bào màng cấu tử tế bào Do chiết rút enzyme nội bào, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa enzyme chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị đồng hóa (homogenzizator) Muốn tách enzyme cấu tử tế bào, người ta phải dùng đến yếu tố vật lí hóa học khác sóng siêu âm Dùng dung môi hữu buthanol, aceton, glycerin, ethyl acetate chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ cấu tử tế bào quan thường chứa mỡ Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme chiết nước cất, dung dịch đệm thích hợp dung dịch muối trung tính Có số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rút cần lưu ý Trước hết nhiệt độ Để tránh hoạt tính chí vơ hoạt, cần chiết rút tiến hành kết tủa enzyme nhiệt độ thấp (từ đến 50C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện li làm tăng trình chiết rút enzyme NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng chúng phụ thuộc vào phương pháp dùng chiết rút Để loại bỏ muối khoáng loại đường Là tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng lọc qua gel sephadex Để loại bỏ protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ,các phương pháp sắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion) điện li, phương pháp lọc gel Mục đích yêu cầu: chế phẩm enzyme sử dụng dạng khác theo mức độ tinh khiết( hoạt độ riêng) Trong số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme sử dụng trực tiếp dạng thô không cần tách tạp chất chúng không gay ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm qui trình cơng nghệ sau này( ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da) Cũng có người ta cẩn sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học Enzyme nói chung dễ giảm hoạt tính tác dụng tác nhân bên tách tinh chế enzyme để tránh biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng nhiệt độ thấp, độ pH thấp khơng có mặt chất gây biến hình enzyme 2.2.1 Phương pháp kết tủa Phương pháp kết tủa phân đoạn (NH4)2SO4 dựa sở khác khả kết tủa protein enzyme nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hòa) xác định dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp dung dịch enzyme loại muối dùng (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Người ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 tốt khơng làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết loại enzyme Loại muối lại rẻ phổ biến Độ hòa tan lại lớn (bão hịa 767 g/l 250C) 2.2.2 Phương pháp sắc ký Các kỹ thuật sắc ký cột Dịch chiết enzyme loại bỏ phần lớn protein tạp chưa đảm bảo độ đồng cần thiết Do dịch chiết enzyme tiếp tục làm phương pháp sắc ký cột Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - lọc filtration) Cơ sở phương pháp lọc gel dựa vào khác kích thước hình dạng phân tử lượng enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất không hòa tan tương đối bền với yếu tố học sinh học Ngoài chất sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải chất khơng có tính đàn hồi(khơng co) phải chất ưa nước (hydrophyl) Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào khác diện tích tổng số protein enzyme Hãy nói cách khác, phương pháp dựa sở phản ứng trao đổi ion protein tan nước dung dịch đệm loãng tác nhân trao đổi ion Tác nhân ( hay nguyên liệu) trao đổi ion chất nhựa có tích nhóm sinh ion chất ionit Đây chất giá trơ, khơng tan nước, có chất cellulose chất gel dextran có lưới phân nhánh ( Sephadex, Molselect) chất nhựa polystiron Chất giá thể thường kết hợp với nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose, sephadex, molselect thông thường dùng để tách protein enzyme, cịn chất trao đổi ion có chất giá polystirol ( ví dụ Dowex, Amberlite) dùng để tách peptid có trọng lượng phân tử nhỏ Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) dẫn xuất este cellulose C2H5 C2H5 Cellulose - O – CH2 - N C2H5 Trong H2O phân li: Cellulose – C2H4 – N – (C2H5) + H2O C2H5 + OH Cellulose – O – C2H4 – N+ C2H5 H Đây chất trao đổi anion Nếu chất sephadex thì có chất trao đổi ion sephadex Đó loại DEAE – sephadex CM – sephadex Ưu điểm loài vừa tách protein enzyme kích thước diện tích tổng số protein enzyme Trường hợp CM – sephadex chất giá sephadex có gắn nhóm COO- - O – CH2 - COOH Phân ly COO – (mang điện tích) Đây chất trao đổi cation Ngồi ra, có phương pháp: - Phương pháp dùng cháy phụ - Phương pháp dùng chất phụ đặc biệt hiệu sinh học phương pháp sắc ký lực ( afinity chromatography) 2.2.3 Phương pháp tách hệ hai pha nước Cơ sở kỷ thuật dựa vào phân bố khác hỗn hợp dung dịch hai pha khơng hịa tan vào Các hệ hai pha đặc trưng cách trộn hệ dung môi vào để tạo thành hai pha riêng biệt Hệ dung môi sử dụng phương pháp polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) dextran heejpolymer/muối PEG patasium phosphate, sodium phosphate, sodium sulphate… Các protein mảnh vỡ tế bào có khả hịa tan khác hai pha, phương pháp dùng cho hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào phân chia enzyme suốt trình tinh protein Hệ hai pha nước xem phương pháp tốt cho việc phân tách tinh hỗn hợp, phân tách chất lỏng có mật độ khác dễ dàng phân tách chất rắn khỏi chất lỏng So với phương pháp tinh khác hệ hai pha nước có số ưu điểm như: + Có độ hịa tan nước hai pha lớn (70 – 80,5) + Đạt độ tinh cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng quy mô lớn + Và đặc biệt polymer tái sử dụng Sự phân tách đạt hiệu cao tùy thuộc vào thông số khối lượng phân tử điện tích đối tượng nghiên cứu, nồng độ khối lượng phân tử polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion hỗn hợp diện loại muối đa hóa trị phosphate sulphate… Phần - Xác định hoạt độ protease Cách xác định hoạt độ protease từ đu đủ nấm mốc Aspergillus oryzae 3.1 Hóa chất dụng cụ - Quả đu đủ, nấm mốc Aspergillus oryzae - Dung dịch tartaric acid 1%; dung dịch trichloacetic acid 0,3M; dung dịch casein 2%; dung dịch đệm Britton Robinson (acetic acid, phosphoric acid, boric acid); dung dịch HCl 0,2N; dung dịch tyrosine mM; dung dịch Folin - Dụng cụ thủy tinh (bình tam giác, ống nghiệm, pipete…) - Tủ ấm, bếp đun cách thủy - Máy so màu 3.2 Nguyên tắc Dùng dịch chiết có enzyme thủy phân protein Sau diệt enzyme kết tủa protein chưa bị thủy phân trichloacetic acid Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine Đơn vị hoạt độ protease lượng enzyme phân giải protein tạo thành sản phẩm hòa tan trichloacetic acid tương ứng với micromol tyrosine (0,181 mg) phút, 300C Protease dịch chiết xác định pH 7,2 ± 0,2 3.3 Các bước tiến hành a Chuẩn bị dung dịch đệm Britton Robinson pH 7,2 - Dung dịch A: Acetic acid 0,04M (2,32 ml pha thành 1000 ml), phosphoric acid 0,04M, boric acid 0,04M - Dung dịch B: 8g NaOH hòa tan nước cất dẫn nước đến 1000 ml - Dung dịch đệm Britton Robinson có pH khác phụ thuộc vào tỉ lệ pha thể tích dung dịch A B Pha đệm pH 7,2: lấy 100 ml dung dịch A 55 ml dung dịch B, dẫn nước cất đến 200 ml b Dung dịch casein 2% Hòa tan 2g casein vào 90 ml đệm Britton Robinson pH 7,2 Nếu pH dung dịch thấp 7,2 dùng vài giọt NaOH 1N để điều chỉnh, dẫn đệm đến 100 ml c Dung dịch enzyme - Cân 1g đu đủ, nghiền với đệm Britton Robinson pH 7,2 Đổ dịch nghiền vào bình định mức loại 100 ml Dùng đệm rửa cối chày, nước rửa cho vào bình định mức Bổ sung đệm đến vạch ngấn Lắc đều, lọc lấy dịch - Chuẩn bị dịch enzyme từ dịch lên men vi nấm A oryzae : Nuôi cấy A oryzae môi trường dịch thể Czapek−Dox vô trùng (saccharose 30g; 3,5g; 1,5g; 0,5g; KCl 0,5g; 0,01g thêm 20 ml sữa đặc 10g gelatin, casein, nước cất 1000 ml) điều kiện nhiệt độ phòng máy lắc 200 vòng/phút sau 72 thu lấy dịch lọc d Tiến hành phản ứng Cho vào ống nghiệm, ống 20 ml chất (casein), đặt vào chậu ổn nhiệt 300C Sau 10 phút cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch enzyme (cũng 300C), lắc trộn để 10 phút 300C Sau cho vào ống nghiệm dung dịch trichloacetic acid 0,3M; lắc trộn nhanh để protein dư hợp chất cao phân tử khác kết tủa, giữ ống nghiệm 300C thêm 20 phút lọc lấy dịch Lấy ml dịch lọc ml dung dịch 0,5M cho vào ống nghiệm, trộn thêm ml thuốc thử Folin Sau 20 phút phản ứng, dung dịch có màu xanh da trời, mang đo máy so màu Thí nghiệm đối chứng thay dung dịch enzyme 20 ml nước cất So sánh kết thí nghiệm đối chứng e Xây dựng đường chuẩn tyrosine Pha dung dịch gốc tyrosine có nồng độ 10−3 (1 mM): cân 181,12 mg tyrosine, hòa tan dung dịch HCl 0,2N định mức đến 100 ml HCl 0,2N Từ dung dịch gốc pha loãng thành dãy nồng độ dung dịch sau: Tyrosine(ml ) HCl 0,2N(ml) Nồng độ tyrosine (mM) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5 0,02 0,44 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30 10 Mỗi dung dịch lấy ml cho vào ống nghiệm, cho thêm vào ống ml 0,5M ml thuốc thử Folin, lắc Mẫu đối chứng thay ml dung dịch tyrosine ml nước cất Giữ hỗn hợp phản ứng 20 phút, sau đo máy so màu bước sóng 720 nm Lấy số liệu trung bình hai ống nghiệm dựng đường chuẩn tyrosine với trục hoành nồng độ tyrosine (e) tính theo micromol/ml, trục tung mật độ quang (OD) 3.4 Tính kết 3.4.1 Định tính hoạt độ protease + Kiểm tra hoạt độ protease môi trường chứa casein gelatin tinh khiết: Dùng môi trường thạch đĩa Czapek−Dox thêm 10g gelatin, dùng khoan đồng khoan bỏ thỏi thạch cho vào ml dịch nuôi A oryzae trên, sau 24 dùng thuốc thử HCl 1% dung dịch bão hòa đổ lên bề mặt môi trường thạch đĩa, A oryzae sinh protease có vịng suốt xung quanh lỗ khoan protein bị phân giải, vùng khơng bị phân giải có màu trắng đục Căn vào đường kính vùng phân giải để xác định hoạt độ protease 3.4.2 Định lượng hoạt độ protease Hoạt độ protease (Hdp) tính đơn vị/gam hay đơn vị/ml theo cơng thức: Trong đó: OD - mật độ quang đo mẫu - Tỷ lệ thể tích hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme Sau thêm trichloacetic acid: A - Đương lượng tyrosine xác định theo đường chuẩn (mật độ quang mà micromol tyrosine có ml dung dịch chuẩn, phản ứng cho thuốc thử Folin.) 10 - Thời gian thủy phân chất (phút) 11 W - Lượng chế phẩm enzyme (lấy để thủy phân chất tyrosine tính mg có ml dung dịch enzyme) 1000 - Hệ số chuyển sang gam chế phẩm 3.5 Những điểm cần lưu ý Khi tiến hành thí nghiệm dụng cụ phải vệ sinh Cách xác định định tính hoạt độ protease từ A oryzae dùng phương pháp đục lỗ dùng thuốc thử bão hòa để phát vùng thủy phân protein Chọn (đu đủ xanh) thu hoạch, không bị dập nát, hư hỏng Điều kiện thủy phân: Nồng độ protein 1% (nồng độ chất dung dịch), thủy phân vòng 10 phút nhiệt độ 300C Trước tiến hành phản ứng thủy phân, dung dịch chất dung dịch enzyme phải đưa đến 300C Làm ngừng phản ứng cách cho lượng dung dịch trichloacetic acid 0,3M thể tích hỗn hợp phản ứng, trộn đều, giữ 300C 20 phút, lọc lấy dịch Lượng enzyme cần cho phản ứng cho mật độ quang dung dịch so màu nằm phạm vi 0,2−0,6 Phần - Ứng dụng protease 4.1 Trong công nghiệp thịt -Trong cơng nghiệp thịt, dùng chế phẩm protease để làm mềm thịt - Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường papain hay hỗn hợp papain với protease vi sinh vật - Tùy theo tính chất thịt mà sử dụng chế phẩm - Chất lượng loại thịt nâng cao - Thời gian chín thịt rút nhiều lần - Kĩ thuật làm mềm thịt khơng phức tạp lắm.Có thể: 12 + Ngâm thịt phức hợp emzyme pH, nhiệt độ, nồng độ thích hợp + Rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột có chứa enzyme chất phụ gia + Tiêm dung dich vào mô + Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước giết thịt - - - - - - 4.2 Trong công nghiệp sữa Protease có khả đơng tụ sữa Tính chất từ lâu ứng dụng vào thực phẩm Ứng dụng chính: sản xuất phomat + Renin đóng vai trị quan trọng cơng nghệ + Người ta cố tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự thay phần renin 4.3 Trong công nghiệp thuộc da Chất quan da collagen, tác dụng protase, chất nhờn tách ra, số liên kết sợi collagen bị phá hủy Kết da thu độ mềm định Trước thường dùng protease thu từ đường tiêu hóa động vật ,ngày hiệu enzyme thu từ vi khuẩn nấm móc Rút ngắn thời gian làm mềm, tách long xuống nhiều lần , chất lượng tốt ,số lượng lông thu nhiều, khơng xử lí thêm Người ta ngâm nguyên liệu da dung dịch enzyme dung dịch enzyme phết hồ enzyme lên bề mặt 4.4 Trong sản xuất tơ tằm Qúa trình làm tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp khó khăn Sợi sau kéo kén thường có khoảng 30% xerixin Muốn tách xerixin phải nấu dung dịch xà phòng Một lượng nhỏ xerixin nằm lại lụa làm giảm độ đàn hồi lụa Để tách xerixin lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm móc, vi khuẩn 13 4.5 - Trong sản xuất chất tẩy rửa - Phân hủy vết bẩn dạng protein vải - Có tác dụng tẩy rửa giống máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước sốt thức ăn, Và có hoạt tính dung dịch giặt 4.6-Trong sản xuất hương phẩm, mỹ phẩm - Hiện số nước sản xuất loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu - Dưới tác dụng protease kem, Các biểu bì da chết tách ra, da non xuất bề mặt, phát triển lông, tóc chậm lại 4.7-Trong y học - Protease sử dụng để sản xuất môt trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng ni cấy vi khuẩn vi sinh vật khác - Dùng chế phẩm protease để cô đặc tinh chế huyết kháng độc - Ứng dụng chữa số bệnh đường tiêu hóa 14 ... Căn vào đường kính vùng phân giải để xác định hoạt độ protease 3.4.2 Định lượng hoạt độ protease Hoạt độ protease (Hdp) tính đơn vị/gam hay đơn vị/ml theo cơng thức: Trong đó: OD - mật độ quang... cation Ngồi ra, có phương pháp: - Phương pháp dùng cháy phụ - Phương pháp dùng chất phụ đặc biệt hiệu sinh học phương pháp sắc ký lực ( afinity chromatography) 2.2.3 Phương pháp tách hệ hai pha... nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion hỗn hợp diện loại muối đa hóa trị phosphate sulphate… Phần - Xác định hoạt độ protease Cách xác định hoạt độ protease từ đu đủ nấm mốc Aspergillus oryzae 3.1 Hóa