ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN TRỌNG HỘI NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN BỘ KIT PCR 16 GEN GẮN HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DÂN TỘC HỌC VÀ GIÁM ĐỊNH GEN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 62420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Đình Đạt PGS.TS Nguyễn Văn Hà Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm 20 MỞ ĐẦU Ở mức độ di truyền, người ta ước tính khoảng 99,7% hệ gen người giống nhau, khác biệt hai cá thể tìm thấy 0,3% tồn ADN cịn lại thể người [38] Hệ gen người có nhiều trình tự ADN lặp lại, có trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) hay gọi trình tự lặp lại đơn giản (SSR) vi vệ tinh (microsatellite) Các STR thường có kích thước ngắn khoảng từ 100-400 bp, mang đơn vị lặp lại, đơn vị lặp thường có 2-7 bp tìm thấy vùng ADN khơng mã hóa Chúng nằm rải rác tất 22 cặp NST thường, cặp NST giới tính X Y Các STR NST thường có tính đa hình cao so với STR NST Y (Y-STR) thiếu tái tổ hợp NST Chúng có vai trị quan trọng nghiên cứu di truyền quần thể phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) [67] Vào năm 1990, locus STR sử dụng PTN phân tích ADN nhận dạng cá thể người Ngày nay, kỹ thuật phân tích STR cơng cụ khơng thể thiếu PTN phân tích ADN hình [50, 66, 123] Hiện nay, có khoảng 20.000 locus STR lặp bốn nucleotide (có 4bp đơn vị lặp lại) xác định có hệ gen người [44] CODIS 13 locus STR lõi FBI (Mỹ) lựa chọn locus STR NST thường sử dụng rộng rãi [67] Mặt khác, cơng nghệ phân tích STR giới phát triển đa dạng, bao gồm: Điện di gel polyacrlamide biến tính-nhuộm bạc [27, 99]; đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản [35, 85]; điện di mao quản vi mạch sử dụng microchip [74, 76, 101]; phân tích khối phổ (mass spectrometry) [38, 39] cơng nghệ pyrosequencing (giải trình tự tổng hợp) [53, 56, 100] Tuy nhiên, kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản cơng nghệ nghiên cứu hồn thiện sử dụng rộng rãi PTN phân tích ADN hình giới với ưu điểm: độ nhạy xác cao; thời gian phân tích mẫu nhanh (được tính phút); việc phân tích mẫu thực cách tự động phân tích với quy mơ số lượng mẫu lớn (xây dựng tàng thư ADN) [35] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR nhận dạng cá thể người phát triển mạnh mẽ từ năm 2000 đến với nghiên cứu tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho locus STR (từ 2- locus), xây dựng thang alen cho locus STR (2-3 locus), chế tạo kit PCR (3-4 locus STR) sử dụng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc để phát alen STR [1-3, 7, 9-12] Bên cạnh đó, việc nghiên cứu khảo sát tần suất alen locus STR thực dân tộc người Mường (N=107, với ba locus D5S818-D13S317-D7S820) [5] người Kinh [8, 13] Tuy nhiên, kết nghiên cứu dừng lại mức độ nghiên cứu thăm dò ban đầu, liệu tần suất alen số thống kê nhận dạng cá thể người chưa phản ánh đầy đủ cho quần thể nghiên cứu Mặt khác, công nghệ phân tách phát alen STR sử dụng nghiên cứu chủ yếu dùng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc cịn có nhiều mặt hạn chế như: Độ nhạy xác chưa cao; thời gian phân tích mẫu lâu (được tính ngày); việc phân tích mẫu khơng thực tự động kết phân tích mẫu phụ thuộc nhiều vào thao tác kinh nghiệm người làm thí nghiệm Xuất phát từ lý trên, việc thực luận án “Nghiên cứu hoàn thiện kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng nghiên cứu dân tộc học giám định gen” có ý nghĩa mang tính cấp thiết  Mục tiêu nghiên cứu Chế tạo kit PCR 16 locus (gen) gắn huỳnh quang hệ thống điện di mao quản Ứng dụng nghiên cứu dân tộc học giám định ADN  Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Nhóm đối tượng nghiên cứu cá thể người thuộc ba dân tộc Việt Nam là: người Kinh (N=300) sống khu vực Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống tỉnh Hịa Bình người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng  Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chế tạo kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang hệ thống điện di mao quản Ứng dụng kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang nghiên cứu di truyền quần thể ba dân tộc người Việt Nam (người Kinh, người Mường người Khmer) Ứng dụng kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) Việt Nam  Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Bổ sung liệu tần suất alen 15 locus STR NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX FGA) người Kinh (N=300) sống khu vực Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống tỉnh Hịa Bình người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng vào CSDL STR người Việt Nam phục vụ cho công tác nghiên cứu di truyền quần thể giám định ADN Việt Nam Tạo kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang hệ thống điện di mao quản, giúp cho chủ động công nghệ, đáp ứng nhu cầu phân tích ADN nhận dạng cá thể người, xác định huyết thống, làm thẻ ADN cá nhân, xây dựng CSDL tàng thư ADN, nghiên cứu di truyền quần thể Việt Nam  Điểm luận án Đây nghiên cứu Việt Nam việc tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang chế tạo thành công kit PCR 16 locus gắn huỳnh hệ thống điện di mao quản Bộ kit này, ứng dụng thành cơng hai lĩnh vực nghiên cứu Đó là: Nghiên cứu di truyền quần thể người Kinh (N=300) sống khu vực Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh, thu 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống tỉnh Hịa Bình, thu 132 alen/15 locus người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng, thu 145 alen/15 locus Kết nghiên cứu bổ sung vào CSDL 15 locus STR nghiên cứu quần thể người Việt Nam 32 alen so với kết nghiên cứu trước tác giả Shimada đồng nghiệp [103] Kết nghiên cứu xây dựng phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining phần mềm POPTREE [109] dựa liệu tần suất alen 13 locus thuộc CODIS 13 locus STR lõi (do FBI-Mỹ lựa chọn) quần thể nghiên cứu 14 quần thể tham khảo Cây phả hệ này, phản ánh mối quan hệ di truyền quần thể nghiên cứu với 14 quần thể khác giới Kết nghiên cứu người Kinh người Mường có quan hệ gần gũi với so với người Khmer dựa giá trị khoảng cách di truyền chuẩn Nei (DST) Phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) Việt Nam việc truy nguyên cá thể người từ dấu vết sinh phẩm thu trường số vụ án (dấu vết máu tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm tung tích nạn nhân từ mẫu cửa tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống mẹ-con với xác suất quan hệ 99,999%; xây dựng 9/10 hồ sơ ADN cá nhân 10 đối tượng cần kiểm soát an ninh (KSAN) làm 1.000 thẻ ADN cá nhân thử nghiệm phục vụ công tác an ninh dân sinh CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các locus STR sử dụng nghiên cứu di truyền quần thể phân tích ADN hình Ngày nay, người ta phát hệ gen người có chứa nhiều trình tự ADN lặp lại Những trình tự lặp lại thường nằm gen, chúng khác kích thước cá thể khác mà không ảnh hưởng đến sức khỏe di truyền cá thể [38] Các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) tìm thấy hệ gen người Các STR trở thành marker di truyền sử dụng phổ biến nghiên cứu di truyền quần thể phân tích ADN hình chúng dễ dàng nhân bội để phân tích kỹ thuật PCR đa mồi [38] Các tiêu chí để lựa chọn locus STR sử dụng phân tích ADN hình bao gồm [62, 45]: - Tính dị hợp tử cao (≥ 70 %); - Có vị trí riêng biệt NST khác nhau; - Có khả kết hợp với locus khác để tạo thành phức nhiều locus (multiplex); - Có tỷ lệ stutter thấp (