chơng trình khoa học công nghệ trọng điểm cấp nhà nớc kc 04 quốc phòng viện pháp y quân đội báo cáo tổng kết đề tài m số kc 04.23 nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật adn việc giám định hài cốt liệt sỹ chủ nhiệm đề tài: pgs.ts nguyễn trọng toàn 6103 20/9/2006 hà nội - 2006 ADN Các chữ viết tắt Axit deoxyribonucleic Bp Base pair dNTP Deoxynucleoside triphosphate dATP Deoxyadenine triphosphate dCTP Deoxycytosine triphosphate dGTP Deoxyguanine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Disodium ethylenediamintetra-acetate dihydrate HV1 Hypervariable HV2 Hypervariable MtADN Mitochondrial ADN NucADN Nuclear ADN PA Polyacrylamide PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction fragment length polymorphism STR Short tandem repeat SDS Sodium Dodecyl Sulfate Taq Themus aquaticus TBE Tris Boric EDTA TE Tris EDTA TEMED N, N, N, N- tetramethyl- ethylenediamine UV Ultra violet VNTR Variable number of tandem repeat lời mở đầu Nhận dạng cá thể nhu cầu tất yếu lĩnh vực khác đời sống xã hội: từ khảo cổ học, nhân chủng học, điều tra tội phạm đến việc tìm kiếm ngời tích nh xác định quan hệ huyết thống hài cốt liệt sĩ Trớc đây, việc xác định, nhận dạng cá thể chủ yếu dựa vào phơng pháp hình thái học, so sánh đối chiếu hồ sơ răng, lồng ảnh vào xơng sọ hệ thống gơng bán mạ kỹ thuật vi tính tái tạo lại khuôn mặt sở phân tích hài cốt Tuy nhiên kỹ thuật có độ xác không cao, lại cần có mẫu hài cốt nguyên vẹn có đặc thù riêng nh có hồ sơ răng, Các dẫn chứng khoa học chứng minh ADN tồn phần sót lại thể chết lâu năm, phần thể tốt để nghiên cứu tách chiết ADN, nhân gen mẩu xơng Sử dụng mẩu xơng ngời chết từ 500 đến 1200 năm trớc tác giả tách chiết đợc phân tử ADN nguyên vẹn bảo đảm cho việc nhân nghiên cứu gen ngời tiền sử (Hagelberg, 1989; Hanni, 1995, Kalmar, 2000) Ngày nay, với phát triển khoa học công nghệ, đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh học, việc giám định nhận dạng cá thể nhờ áp dụng kỹ thuật ADN nh AFLP, RFLP, PCR thu đợc kết tốt với độ xác cao, giải đợc trờng hợp mà phơng pháp khác giải đợc Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen đặc thù nhân bào quan khác nh ti thể, lục lạp giúp cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nh nghiên cứu khác gen đạt nhiều kết tốt Sử dụng kỹ thuật ADN để phân tích trình tự nucleotide vùng siêu biến mtADN, phòng thí nghiệm Mỹ The Armed Forces DNA Identification Laboratory (AFDIL) The U.S.Army Central Identification Laboratory, Hawaii(CILHI) xác định phả hệ hài cốt đợc quy tập từ chiến tranh chiến thứ II, chiến tranh Triều tiên, chiến tranh Việt nam (Stoneking et al., 1991; Holland et al., 1999) Đối với Việt Nam, năm có tới hàng trăm trờng hợp nạn nhân vụ án mạng, tai nạn, tự sát cha rõ tung tích, đặc biệt khoảng 200 000 trờng hợp liệt sĩ vô danh cần xác định phả hệ Nhiều hài cốt đợc quy tụ từ chiến trờng xa nghĩa trang liệt sĩ, nhng có di hài xác định đợc địa chỉ, mối quan hệ huyết thống, phả hệ Phần lớn di hài vô danh xác định đợc địa chỉ, mối quan hệ với gia đình có em bị hy sinh hai kháng chiến trớc đây, tài liệu liên quan tới liệt sĩ vô danh (nh giấy tờ, chứng liên quan tới ngày nhập ngũ, đơn vi chiến đấu, ngày hy sinh, chiến trờng hy sinh, nơi chôn cất ) không nằm rải rác địa phơng cần đợc tập hợp thành tàng th tạo điều kiện cho việc xác định hài cốt sau Vì vậy, việc xác định tên liệt sĩ vô danh, ngời anh dũng hy sinh hai kháng chiến bảo vệ Tổ Quốc trớc vấn đề mang tính xã hội nhân văn cao Đây chủ trơng lớn Đảng Nhà Nớc ta Cùng với thành tựu lĩnh vực nghiên cứu gen nhà khoa học giới, thành công ban đầu Viện Công nghệ sinh học, Viện Pháp y Quân đội nh đơn vị nghiên cứu, trờng Đại học, mạnh dạn nhận thực đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ADN việc giám định hài cốt liệt sỹ. Mục tiêu đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích ADN ty thể tách chiết từ mẫu hài cốt (răng, xơng) lâu năm qua thiết lập mối liên quan di truyền theo phả hệ dòng mẹ phục vụ cho việc giám định nhận dạng hài cốt liệt sỹ Nội dung đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình thu thập , giám định kỳ đầu bảo quản mẫu hài cốt liệt sỹ, mẫu sinh phẩm phục vụ cho việc tách chiết mtADN Thu thập, lu trữ, quản lý tàng th tài liệu liên quan tới liệt sỹ vô danh cần giám định nhận dạng phần mềm chuyên dụng phục vụ cho việc truy cập thông tin, xác định phả hệ liệt sỹ vô danh Thiết lập mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ liệt sỹ vô danh tạo điều kiện thu thập mẫu sinh phẩm chuẩn xác phục vụ cho việc tách chiết mtADN phả hệ có liên quan Nghiên cứu qui trình tách chiết mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN vùng siêu biến mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm Nghiên cứu qui trình nhân vùng siêu biến mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm Tạo dòng đoạn gen ADN để giải trình tự vùng siêu biến Tiến hành phân tích mức độ tơng đồng khác biệt trình tự vùng siêu biến mẫu giải trình tự phần mềm chuyên dụng để xác định phả hệ cho hài cốt liệt sỹ vô danh Xây dựng phần mềm quản lý sở liệu Các sản phẩm KHCN đề tài Quy trình thu thập bảo quản mẫu hài cốt, mẫu sinh phẩm Quy trình giám định kỳ đầu mẫu hài cốt Quy trình tách chiết mtADN mẫu hài cốt, sinh phẩm Quy trình nhân HV1, HV2 mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm Quy trình dòng hóa đoạn gen đặc hiệu phả hệ Quy trình giải trình tự đoạn gen đặc hiệu phả hệ, phân tích kết Phần mềm quản lý tàng th liệt sỹ, quản lý sở liệu nghiên cứu - Cột sống: có 32 đốt sống, có đốt sống dính liền tạo nên xơng đốt sống cụt dính liền tạo nên xơng cụt; - Lồng ngực: Gồm có đoạn cột sống ngực, xơng ức 12 đối xơng sờn + Xơng sọ mặt: Gồm xơng sọ 14 xơng mặt họp thành hộp sọ khối xơng mặt + Xơng chi xơng chi dới: Chi dính vào thân đai vai (gồm xơng đòn xơng vai); Chi dới dính vào thân đai chậu (gồm xơng chậu dính thẳng vào xơng cột sống) Mỗi chi có đoạn: Cánhtay đùi, cẳng tay cẳng chân, bàn tay bàn chân (gồm có cổ tay cổ chân, bàn tay bàn chân, ngón tay ngón chân) 1.1.1.2 Phân loại xơng: a Về mặt hình thể, xơng đợc phân làm loại: + Xơng dài: Xơng chi, gồm có thân xơng hai đầu, phần nối đầu thân xơng cổ xơng; + Xơng ngắn: Hình thể nh xơng dài, gồm xơng bàn tay, ngón tay, bàn chân, ngón chân; + Xơng dẹt: Xơng sọ, xơng bả vai, xơng ức, xơng chậu + Xơng khó định hình: Gồm xơng hình thể phức tạp nh: Xơng hàm trên, xơng thái dơng, xơng sàng, xơng bớm; + Xơng vừng: Các xơng nằm gân b Về mặt cấu trúc + Đại thể: - Xơng đặc: Là lớp xơng mịn, chắc, rắn, màu vàng nhạt thờng bao quanh thân xơng tạo nên ống xơng dày quãng mỏng dần hai đầu - Các tế bào xơng nằm xơng nên đợc bảo vệ tốt chống lại yếu tố bất lợi môi trờng Đây nguồn cung cấp ADN cho giám định hài cốt Phơng pháp hình thái học dựa quan sát đặc điểm hình thái: Các đặc điểm mang tính lỡng hình giới tính xơng sọ (ụ chẩm ngoài, điểm Glabella, gờ ổ mắt, xơng chũm, xơng hàm dới ), xơng chậu (vùng dới xơng mu, khuyết hông lớn, rãnh trớc diện nhĩ ) (Wilton Marion, 1903) Các đặc điểm hình thái xác định tuổi xơng sọ (độ liền khớp xơng sọ), xơng chậu (bề mặt sụn tiếp hợp xơng mu, diện nhĩ ), độ mòn (Jonathan Haas CS, 1944) Cũng nh đặc điểm đặc biệt (chấn thơng, bệnh lý ) số liệu đo đạc xơng dài nhằm trả lời câu hỏi: + Là xơng ngời hay xơng động vật ? + Chủng tộc nào? + Giới tính nào? + Tầm vóc bao nhiêu? + Tuổi chừng bao nhiêu? +Số lợng cá thể ? Tuy nhiên, phơng pháp đòi hỏi hài cốt phải tơng đối nguyên vẹn, với hài cốt bị mủn, mục, gãy, nát gần nh tiến hành đợc Mặt khác giá trị truy nguyên phơng pháp thấp, không rõ đợc hài cốt cá thể giám định nhận dạng hài cốt có giá trị sàng lọc 1.1.2 Phơng pháp nhận dạng hài cốt dựa hồ sơ Nguyên lý phơng pháp dựa so sánh đối chiếu đặc điểm hài cốt với hồ sơ nạn nhân trớc chết ( tình trạng mọc răng, tình trạng hàn ) để nhận dạng hài cốt Giá trị truy Chiến lợc thực quy trình tóm tắt nh sau: 15971 00015 16140 00145 Vùng D-loop tRNA tRNA Pro Phe 16030 16258 00274 16414 570 00389 38 chu kỳ phản ứng PCR, Tinh với Centricon-100 Xác định trình tự Thành phần phản ứng - Mồi cho phản ứng (5pmol/àl): Vị trí primer L15971 H16258 L16140 H16410 L00015 H00274 L00145 H00389 Trình tự 5-tta 5-tgg 5-tac 5-cac 5-cac 5-tgt 5-ctc 5-ctg act cca cca tta gca cc-3 ctt tgg agt tgc agt tg-3 ttg acc acc tgt agt ac-3 gga gga tgg tgg tca ag-3 cct att âc cac tca cg-3 gtg gaa agt ggc tgt gc-3 ac cta tta ttt atc gc-3 gtt agg ctg gtg tta gg-3 - 1,25mM dNTPs (nồng độ mồi 1,25mM) - 10X PCR buffer: 100mM Tris-HCl, pH=8,3, 15mM MgCl2, 500mM KCl - AmpliTaqđDNA Polymerase (5U/àl) Chu trình phản ứng PCR - Đặt nhiệt máy PCR trớc tới 940C - Trộn thành phần phản ứng sau: 20 Thành phần DNA Forward primer Thể tích Tuỳ thuộc Nồng độ cuối 0,1-1 ng àl (5pmol/àl) 0,4 àM Reverse primer àl (5pmol/àl) 0,4 àM dNTPs mix (1,25mM) àl 200àM 10X PCR buffer àl 1X 0,5 àl 2,5 U** AmpliTaqđDNA Polymerase dH2O Điều chỉnh Tổng thể tích 50 àl ** Đối với mẫu bị phân huỷ mạnh để khắc phục chất ức chế sử dụng tới 12,5 UI taq - Chu trình nhiệt phản ứng PCR: Phụ thuộc vào mồi sử dụng mà nhiệt độ phản ứng PCR cần điều chỉnh cho thích hợp Nếu sử dụng mồi 1F/1R chu trình nhiệt nh sau: 940C-30giây, 32-38 chu kỳ (940C-20giây; 620C-20 giây; 720C-30 giây), giữ 40C Nếu sử dụng mồi 2,3,4 F/2,3,4 R chu trình nhiệt nh sau: 940C-30giây, 32-38 chu kỳ (940C-20giây; 560C10 giây; 720C-30 giây), giữ 40C - Khi phản ứng PCR hoàn thành, sử dụng 5àl để kiểm tra gel agarose 1% Tinh sản phẩm PCR Sử dụng cột Centricon-100 Cho sản phẩm PCR lại vào 2ml nớc cất khử ion ống Centrion-100, ly tâm 2000-2500 G 20 phút tới lại 40àl Thêm 2ml nớc cất khử ion ống Centrion-100, ly tâm tới lại 40àl Hút sản phẩm cho vào ống eppendoft bảo quản 40C thực phản ứng sequencing để xác định trình tự nucleotide 21 Xác định trình tự nucleotide Sử dụng Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Thành phần phản ứng sequencing phụ thuộc vào hớng dẫn nhà sản xuất Tuy nhiên thành phần sử dụng quy trình là: Thành phần Sản phẩm PCR Thể tích Nồng độ cuối Tuỳ thuộc Tới 1àg (20-80ng) àl 10pmol (5pmol) Primer (cùng primer cho PCR) 9,5 àl Ready Reaction Premix dH2O Điều chỉnh Tổng thể tích 20àl - Phủ ống phản ứng với 20àl dầu PCR - Phản ứng nhiệt với 25 chu kỳ: 960C-15giây; 500C-5giây; 600C-2 phút Lu 40C - Tinh sản phẩm theo quy trình nhà sản xuất Sequencing Kit trớc tra vào máy xác định trình tự tự động Chú ý: Sử dụng cột tinh Centricon-100 cho kết tốt Những rắc rối xác định trình tự PCR Vấn đề xảy xác định trình tự mtDNA mà chủ yếu xác định trình tự sản phẩm PCR Một rắc rối dừng đỉnh liên kết tới mồi đánh dấu Nếu trình nhân PCR, sản phẩm PCR giả đợc hình thành mà mồi xác định trình tự mồi đánh dấu bắt cặp dừng đỉnh xảy liệu xác định trình tự Những sản phẩm PCR giả sản phẩm primer-dimer sản phẩm không đặc hiệu hình thành trình nhân PCR Vấn đề dừng đỉnh xảy với AmpliTaq-based cycle sequencing Sequenase-based chemistries Để tránh tợng dừng đỉnh, điều quan trọng phải tối u hoá điều kiện PCR cho tợng dimer hoá 22 mồi giảm tới mức tối thiểu hạn chế số chu kỳ phản ứng để giảm tới mức tối thiểu hình thành sản phẩm không đặc hiệu Nếu dạng sản phẩm giả hình thành trình PCR, nhng nhiễm chuyển sang Dye terminator chemistries tạo liệu trình tự tốt Nếu nhiễm chiếm phần lớn phản ứng PCR, đoạn sản phẩm PCR cần phải tinh gel để loại bỏ sản phẩm giả Nếu sản phẩm PCR cần ý - Tinh DNA khuôn - Bổ sung Taq polymerase lên tới 12,5U - Kiểm tra phân huỷ DNA - Nhân đoạn ngắn - Tăng nồng độ DNA khuôn tăng chu kỳ phản ứng - Xác định lợng DNA cho vào phản ứng PCR - Tối u hoá thông số chu trình nhiệt thành phần PCR Nếu nhiều sản phẩm PCR - Giảm nồng độ DNA khuôn giảm chu trình nhiệt - Tăng nhiệt độ bắt đầu phản úng PCR - Sử dụng phơng pháp PCR lồng - Tinh sản phẩm PCR gel cần - Tối u hoá thông số chu trình nhiệt 3.1.3.9 Phân tích gen Sau trình tự nucleotide mẫu hài cốt mẫu sinh phẩm đợc tách dòng xác định trình tự, sử dụng phần mềm chuyên dụng nh Genedoc, ClustalW, DNA-Star để so sánh, phân tích nhằm xác định mối liên quan di truyền mẫu 23 - So sánh trực tiếp trình tự mtADN mẫu hài cốt với trình tự mtADN mẫu sinh phẩm (máu, lông, tóc, móng ) thân nhân theo phả hệ dòng mẹ, nếu: + Các nucleotid vùng HV1 HV2 mẫu hài cốt mẫu sinh phẩm trùng khớp ta kết luận: Mẫu hài cốt có quan hệ huyết thống với mẫu sinh phẩm + Sai khác nucleotid ta kết luận: Mẫu hài cốt quan hệ huyết thống dòng mẹ với mẫu sinh phẩm - So sánh gián tiếp qua trình tự Anderson (1981): + Trình tự mtADN mẫu hài cốt trình tự mtADN mẫu sinh phẩm so sánh với trình tự mtADN vùng HV1 HV2 Anderson công bố năm 1981, nếu: * Cùng có số lợng vị trí đột biến nucleotid giống ta kết luận: Mẫu hài cốt có quan hệ huyết thống dòng mẹ với mẫu sinh phẩm * Sai khác số lợng vị trí đột biến nucleotid ta kết luận: Mẫu hài cốt quan hệ huyết thống dòng mẹ với mẫu sinh phẩm, hài cốt hài cốt liệt sỹ cần xác định 3.2 Các phần mềm ứng dụng: 3.2.1 Phần mềm quản lý tàng th liệt sỹ 3.2.1.1.Mục đích Việc xây dựng hệ thống phần mềm quản lí tàng th liệt sĩ xuất phát từ nhu cầu thực tế hỗ trợ cho công tác thu thập quản lí thông tin liệt sĩ Các thông tin liệt sĩ bao gồm: Thông tin cá nhân : Tên, quê quán, đơn vị, chức vụ, hoàn cảnh hi sinh Thông tin hài cốt: Thông tin răng, nhóm máu, chiều cao, hài cốt Thông tin phả hệ: Thông tin gia đình, ngời thân Thông tin kết phân tích ADN: Bao gồm ADN liệt sĩ ADN phả hệ 24 Từ thông tin trên, ngời dùng dễ dàng việc thu thập quản lí thông tin cách khoa học xác, tạo điều kiện thuận lợi cho công tác lập hồ sơ sau Bên cạnh hệ thống bao gồm số chức đáp ứng đợc vấn đề hỗ trợ tra cứu nhanh, xác thông tin 3.2.1.2 Chức phần mềm Phần mềm có cửa sổ đợc thiết lập giao diện chung: - Thông tin cá nhân Liệt sỹ: + Số hiệu: nhập thông tin số hiệu quân nhân, số hiệu sỹ quan + Họ tên: Họ tên đầy đủ theo lý lịch + Năm nhập ngũ + Quê quán: Xã (phờng), Huyện (quận) + Tỉnh, Thành phố: + Đơn vị: + Thuộc đơn vị: + Quân hàm: + Chức vụ: + Năm hy sinh: + Địa điểm hy sinh: + Thuộc tỉnh: + Thông tin di vật: + Loại di vật: Sau nhập đầy đủ thông tin cá nhân Liệt sỹ, để kết thúc nhắp chuột vào nút Chấp nhận - Thông tin hài cốt + Các thông tin tổng quát hài cốt: + Giới: Đánh dấu kiểm giới nam + Nhóm máu: ABO + Chủng tộc: Thông tin chủng tộc, dân tộc + Chiều cao: Nếu có thông tin xác điền thông tin xác, không điền chiều cao khoảng ớc lợng + Răng: Số lợng hàm trên, hàm dới Đặc điểm răng: Răng số mấy, có đặc điểm Có thể thay đổi thông tin cách nhắp chuột vào nút thay đổi chấp nhận command1 - Phả hệ liên quan + Thông tin ngời thân: Họ tên ngời thân: Địa chỉ: Mối quan hệ với Liệt sỹ: 25 Có thể thêm thông tin ngời thân, xoá thông tin sửa thông tin nhắp chuột vào nút tơng ứng + Có thể thêm thông tin đầy đủ phả hệ cửa sổ ListView_pha_he Nhập thông tin nhắp chuột vào nút Chấp nhận để kết thúc - Kết phân tích ADN + Thông tin ADN Liệt sỹ: Vị trí biến đổi bazơ so với trình tự chuẩn Anderson Đặc điểm biến đổi bazơ so với trình tự chuẩn Anderson + Thông tin ADN phả hệ: Vị trí biến đổi bazơ so với trình tự chuẩn Anderson Đặc điểm biến đổi bazơ so với trình tự chuẩn Anderson Có thể thêm, sửa, xoá, chấp nhận nhắp chuột vào nút tơng ứng Cửa sổ thông tin cá nhân 26 Cửa sổ thông tin hài cốt Cửa sổ thông tin phả hệ 27 Cửa sổ kết phân tích ADN 3.2.2 Phần mềm quản lý sở liệu Phần mềm quản lý sở liệu có th chy h iu hnh Windows 95/98/ME/NT/2000/XP Cung cp nhng chc nng c bn v vic h tr qun lý, phân tích so sánh v lu tr trình t gen c xác nh bi máy c trình t gen nh sau: Nhp d liu Sequencing mi v lu tr (to ngõn hng Gen) Phõn tớch d liu bng cỏc chc nng thờm, bt, sa, xoỏ tng ký t Nhp d liu mi v so sỏnh vi cỏc d liu ngõn hng Cú th thay i, sa xoỏ d liu Cú th a nh i din cho d liu Lm vic linh hot trờn mụi trng mng ni b v mng internet 28 S dng chut trỏi kớch hot vo biu tng ng chng trỡnh Logo v khay thc n chớnh ca chng trỡnh S dng biu tng import nhp d liu Trong ú: GenID: ký (s) hiu mu Samples: Loi mu Notes: Ghi chỳ liờn quan DNA String: Trỡnh t mu S dng Insert Picture a thờm 29 nh liờn quan n mu phõn tớch (Cõy ph h, nh ) Nhp d liu trỡnh t vo ngõn hng database cú cỏch - S dng nỳt lnh import khung DNA strinh add trỡnh t vo - Hoc s dng lnh (data/import/By form) nhp d liu Yờu cu ca d liu l ó c chuyn sang dng text trc a vo x lý Sau nhp trỡnh t vo DNAstring, chc nng data trờn cụng c s thc hin s lnh c bn nh l so sỏnh vi ngõn hng d liu sn cú ca 30 chng trỡnh hoc so sỏnh vi genbank trờn internet hoc qua mng ni b (Updating ) Khung x lý Compare Form s cho s chc nng: Load: Bn s a trỡnh t mun so sỏnh vo so sỏnh vi ngõn hng cú sn ca chng trỡnh (Trỡnh t a vo cng dng text only) Sau ó load trỡnh t, bn thc hin lnh RUN bt u so sỏnh Xut kt qu bng nỳt lnh report sau ó hon tt quy trỡnh so sỏnh Kt qu c hin th 31 khung result hoc c save di dng text file th mc gc 3.3 Minh họa số vụ giám định (có riêng) 3.3.1 Vụ PY XIII (Liệt sỹ Lê Xuân Trứ): 3.3.2.2.Vụ PY II (liệt sỹ Hà Văn Tính) 3.3.2.3 Vụ số PC21001 (Liệt sỹ Nguyễn Đình Phùng) 3.3.2.4 Vụ số PC18001 (Liệt Sỹ Phạm Văn Phúng) 3.3.2.5 Vụ số PC17001 (Liệt sỹ Trần Đức Thành) 3.3.2.6 Vụ số PC20001 (Liệt sỹ Nguyễn Huy Đoàn) 32 kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận: Từ kết đạt đợc nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: - Lần Việt Nam, đề tài nghiên cứu tách chiết thành công ADN ty thể từ mẫu xơng, lâu năm (mẫu lâu có thời gian 65 năm) bị mủn, mục nhiều - Đã nghiên cứu hoàn thiện qui trình giám định nhận dạng hài cốt liệt sỹ công nghệ phân tích ADN ty thể: + Qui trình thu thập, bảo quản giám định kỳ đầu mẫu hài cốt + Qui trình thu thập, bảo quản mẫu sinh phẩm + Qui trình tách chiết ADN ty thể từ xơng, răng, tóc, máu, móng tay, móng chân + Qui trình nhân gen kỹ thuật PCR + Qui trình tách dòng đoạn ADN đặc hiệu + Qui trình xác định trình tự nucleotid phân tích gen Các qui trình phân tích ADN ty thể giám định nhận dạng hài cốt mà đề tài nghiên cứu thành công đòi hỏi thao tác không phức tạp với điều kiện trang thiết bị, hóa chất định, nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử Việt Nam thực đợc - Đã nghiên cứu xây dựng đợc phần mềm: + Phần mềm quản lý tàng th liệt sỹ + Phần mềm quản lý sở liệu Để quản lý thông tin liên quan đến trờng hợp hài cốt liệt sỹ cách có hệ thống nhằm giúp cho việc truy cập xác định phả hệ sau - Nhận dạng thành công 30 trờng hợp hài cốt liệt sỹ hy sinh hai kháng chiến chống Pháp chống Mỹ Các trờng hợp 33 nhận dạng đợc sử dụng phơng pháp giám định khác (trong 20 trờng hợp hài cốt đợc xác định thuộc phả hệ dòng mẹ với mẫu sinh phẩm thân nhân đợc tiến hành trao trả cho gia đình thân nhân liệt sỹ) 4.2 Kiến nghị: - Cho đến hài cốt liệt sỹ cha rõ danh tính đợc qui tập nghĩa trang với số lợng lớn, mặt khác ngày nhiều thân nhân liệt sỹ có yêu cầu muốn đợc làm giám định gen với trờng hợp hài cốt liệt sỹ mà họ nghi thân nhân Bởi đề nghị đợc tiếp tục triển khai ứng dụng kết mà đề tài đạt đợc để giám định nhận dạng hài cốt liệt sỹ với qui mô lớn - Giám định mtADN phơng pháp so sánh gián tiếp qua thân nhân dòng mẹ đòi hỏi nhiều thời gian kinh phí mức độ định nên từ phải xây dựng tàng th ADN đối tợng thuộc ngành nghề có nguy rủi ro cao nh: Bộ đội hải quân, không quân, đặc công, đội công an đặc nhiệm, thuyền viên, phi hành viên, công nhân hầm mỏ, công nhân làm việc dàn khoan, nhà máy thủy điện 34 [...]... và cs., 1994) e ứng dụng Hệ gen ti thể trong giám định * Nhận dạng ngời 34 Nhận dạng thông qua mtDNA thờng dựa trên sự khác nhau về trình tự vùng HV (Hypervariable) Vùng HV gồm 2 vùng HV1 và HV2 Vùng HV1 và HV2 đều có kích thớc khoảng 400bp Nhóm nghiên cứu kỹ thuật phân tích ADN (TWGDAM) - một nhóm các phòng thí nghiệm khoa học hình sự ở Mỹ đã đa ra tiêu chuẩn cho kỹ thuật phân tích ADN - thì trình... giám định gen xác định cá thể 1.1.5.4 Phân tích ADN nhân trong giám định nhận dạng cá thể Phân tích ADN nhân trong giám định nhận dạng cá thể là phân tích các locus ADN có tính đa hình cao nằm trên các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào (nucDNA) Một Locus ADN đợc xem là một locus có tính đa hình cao nếu nh có một số lợng các Alen khác nhau đợc quan sát trong cộng đồng dân c (ví dụ 5-10 hoặc hơn) ví dụ... sử dụng để nhận dạng hài cốt các quân nhân Mỹ bị mất tích trong chiến tranh Việt Nam trong điều kiện các hài cốt đã chịu sự tác động khắc nghiệt của môi trờng với thời gian vài chục năm Mối tơng quan giữa ADN tách từ xơng với hình thái học của xơng: Đối với ADN tách từ xơng, ít có sự liên quan giữa mức độ thành công của việc nhân bản ADN với tuổi của mẫu nhng có sự liên quan giữa sự thành công của việc. .. ích để ứng dụng mtADN trong phân tích giám định đó là đặc tính di truyền theo dòng mẹ Trong quá trình thụ tinh, gần 99,9% ty thể của hợp tử nhận đợc từ tế bào trứng Vì vậy, những cá thể cùng mẹ và tất cả cá thể liên quan dòng mẹ chứa gần nh các bản sao mtADN giống nhau Đặc tính độc nhất khác của mtADN là tốc độ tiến hoá cao Nó đột biến cao gấp 5-10 lần so với ADN hệ gen nhân Một số đặc tính của mtADN... cs., 2001a) Sự tồn tại mtADN của bố đã đợc xác định bằng phơng pháp đa hình chiều dài sử dung enzym giới hạn (RFLP) ở 5 trong số 32 phôi đa bội Trong đó 2 đợc tạo ra bằng thụ tinh trong ống nghiệm, in vitro, ba đợc tạo ra bằng việc tiêm tinh trùng vào tế bào chất của trứng MtADN của bố đợc xác định trong 4 trờng hợp ở giai đoạn từ 4 đến 8 tế bào ở trên và 1 trờng hợp đợc xác định ở giai đoạn phôi bào... và cs.,1992a, Torroni và cs.,1996, Richards và cs., 1998) MtADN còn đợc sử dụng kết hợp với các dấu hiệu di truyền trong nghiên cứu di truyền quần thể Những nghiên cứu đầu tiên đã tiến hành cắt ADN bằng 1 enzym giới hạn đối với một lợng lớn mẫu hoặc nhiều enzym đối với một lợng mẫu hạn chế (Brown, 1980) Các nghiên cứu tiếp sau đã cố giắng sử dụng bộ 5 hoặc 6 enzym trên một lợng mẫu khá lớn (Johnson và... tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng của mẹ Sự khác nhau về trình tự của 4 loại nucleotid trong phân tử ADN của 23 đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định gen để xác định cá thể Tinh đa hình theo trình tự ADN có 2 dạng: + Đa hình theo trình tự: Sự khác nhau ngẫu nhiên giữa các nucleotide trong đoạn ADN, ví dụ ở locus A: Cá thể thứ nhất có trình tự:... công trong 1 số trờng hợp còn đại đa số là không thành công vì ADN bị phân hủy quá nhiều, trong khi đó kỹ thuật phân tích các đoạn lặp ngắn STR (Short Tandem Repeat) lại thành công ngay cả với các mẫu sau chết tới 11 năm Bằng kỹ thuật phân tích ADN ty thể trên xơng ngời ta đã nhận dạng thành công các thành viên trong gia đình Nga Sa Hoàng bị cách mạng 14 Bolsheviks xử bắn năm 1918 Phân tích ADN ty... hoá (ROS), có giả thuyết cho rằng sự phân bố một cách cơ học của mtADN gần màng trong, nơi có các phản ứng ôxy hoá khử xảy ra Cơ chế sửa chữa mtADN của ti thể kém phát triển, tuy nhiên các hệ sửa chữa nh cắt bỏ bazơ, photolyase và ADN methyl transferase tìm thấy trong ti thể đã chứng minh rằng các hệ này đủ đảm bảo cho việc sửa chữa mtADN (Croteau và cs., 1999) Ngời ta nhận thấy một dấu hiệu h hỏng ôxy... phân tử ADN Với mỗi gram xơng đặc còn tơng đối tơi ngời ta có thể thu đợc tới 1 microgam ADN Với những xơng xốp còn tơi nh xơng sờn có thể thu đợc lợng ADN gấp 10-20 lần, xong sau 1 thời gian dài sau chết thì lợng ADN trong các xơng xốp lại ít hơn xơng đặc Hochmeister và cộng sự đã chiết ADN từ xơng của một số xác chết đã thối rữa và nhận thấy rằng kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các đoạn ADN đợc ... việc giám định nhận dạng hài cốt liệt sỹ Nội dung đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình thu thập , giám định kỳ đầu bảo quản mẫu hài cốt liệt sỹ, mẫu sinh phẩm phục vụ cho việc tách chiết mtADN... tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ADN việc giám định hài cốt liệt sỹ. Mục tiêu đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích ADN ty thể tách chiết từ mẫu hài cốt (răng, xơng) lâu năm qua thiết... quan tới liệt sỹ vô danh cần giám định nhận dạng phần mềm chuyên dụng phục vụ cho việc truy cập thông tin, xác định phả hệ liệt sỹ vô danh Thiết lập mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ liệt sỹ vô