ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  - MẪN HỒNG PHƢỚC NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  - MẪN HỒNG PHƢỚC NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60.42.01.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trƣớc hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới hỗ trợ tài nhƣ phƣơng pháp từ đề tài cấp Nhà nƣớc mã số KC04.03/11-15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên ĐHQGHN, đặc biệt tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội chia sẻ khó khăn, giúp triển khai nội dung đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo, gia đình, bạn bè động viên nhiệt tình ủng hộ để hoàn thành khóa học Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Mẫn Hồng Phước MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ 1.1.1 Cá mú 1.1.2 Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN) 1.1.3 Tình hình dịch bệnh VNN 1.1.4 Phòng điều trị bệnh VNN .9 1.2 VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS VIRUS NNV) 10 1.2.1 Nguồn gốc .10 1.2.2 Bộ gen Betanodavirus 10 1.2.3 Cơ chế gây bệnh Betanodavirus .13 1.3 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƢƠNG VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH VNN CHO CÁ MÚ 16 1.3.1 Đáp ứng miễn dịch cá xƣơng .16 1.3.2 Một số kết nghiên cứu vắc xin phòng bệnh VNN cá mú 19 1.3.3 Các loại vắc xin sử dụng cho cá 20 1.3.4 Nguyên tắc dùng vắc xin cho cá 22 1.4 MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT GEN 25 1.4.1 Các enzyme sử dụng kỹ thuật gen 25 1.4.2 Vector plasmid 27 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .30 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 30 2.1.2 Các sinh phẩm 30 2.1.3 Hóa chất 30 2.1.4 Môi trƣờng dung dịch 31 2.1.5 Thiết bị 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Phƣơng pháp tách dòng 33 2.2.2 Phƣơng pháp biểu 41 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 46 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA NNV 52 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số 52 3.1.3 Kết tách dòng gen .55 3.1.4 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEMT-T4 Easy vào E coli JM109 56 3.1.5 Kiểm tra PCR phản ứng cắt enzyme giới hạn 57 3.1.6 Kết giải trình tự gen T4 mã hóa kháng nguyên vỏ NNV 59 3.2 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA NNV 61 3.2.1.Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 61 3.2.2 Biểu gen T4 vi khuẩn E coli BL21(DE3) 66 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP 72 3.3.1 Kết đánh giá khả tạo kháng thể trung hòa kháng nguyên tái tổ hợp thỏ .72 3.3.2 Kết đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp cá mú 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 79 PHỤ LỤC 87 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Bốn kiểu gen Betanodavirus 12 Bảng 2.1 Mồi khuếch đại gen T4 .30 Bảng 2.2 Thiết bị dùng nghiên cứu 32 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt gen T4 .36 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 pGEM - T 37 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 39 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 enzyme hạn chế 40 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) 42 Bảng 3.1 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự đoạn gen T4 thu đƣợc .59 Bảng 3.2 Kết xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh hệ thống in vitro .73 Bảng 3.3 Kết xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh mô hình in vivo .73 Bảng 3.4 Kết xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus 75 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số loài cá mú nuôi chủ yếu Hình 1.2 Cấu trúc không gian Betanodavirus 10 Hình 1.3 Cấu trúc gen Betanodavirus .11 Hình 1.4 Sơ đồ pGEM – T vector dùng tách dòng gen 28 Hình 1.5 Plasmid pET-32a+ .28 Hình 2.1 Quy trình tách dòng gen T4 33 Hình 2.4 Quy trình biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt NNV 41 Hình 2.5 Quy trình đánh giá khả tạo kháng thể kháng nguyên tái tổ hợp 46 Hình 3.1 Biểu cá mú mắc bệnh hoại tử thần kinh .52 Hình 3.2 Kết điện di RNA tổng số 53 Hình 3.3 Kết RT-PCR 10 mẫu RNA tổng số 54 Hình 3.4 Kết tinh sản phẩm RT-PCR 55 Hình 3.5 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEMT- T4 56 Hình 3.6 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp môi trƣờng LB có Ampicilin, chất thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG 57 Hình 3.7 Tách plasmid từ khuẩn lạc trắng 57 Hình 3.8 Điện di PCR kiểm tra mang gen T4 plasmid tách đƣợc 58 Hình 3.9 Điện di sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra mang gen T4 plasmid tách đƣợc EcoRI 58 Hình 3.10 So sánh độ tƣơng đồng đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 Betanodavirus mã số HM017077.1 61 Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+- T4 62 Hình 3.12 Cắt vector pGEMT-T4(A) vector pET32a+ (B) enzyme EcoRI 63 Hình 3.13 Tinh sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 vector pET32a+ 64 Hình 3.14 Đĩa khuẩn lạc thu đƣợc sau chuyển gen pET32a+-T4 vào E coli JM109 64 Hình 3.15 Điện di đồ kiểm tra tạo thành vector pET32a+-T4 vi khuẩn E coli JM109 .65 Hình 3.16 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen T4 vector tái tổ hợp 65 Hình 3.17 Đĩa khuẩn lạc sau biến nạp pET32a+-T4 vào E.coli BL21 66 Hình 3.18 Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 67 Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) 67 Hình 3.20 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% mẫu thuộc dòng số 68 Hình 3.21 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 3, 69 Hình 3.22 Kết Westen blot protein tái tổ hợp T4 .71 Hình 3.23 Điện di protein T4 tinh gel SDS-PAGE 72 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BFNNV : Barfin flounder nervous necrosis virus CNS : Central nervous system CPE : Cytopathic effect ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay GGNNV : Greasy grouper nervous necrosis virus GNNV : Grouper nervous necrosis virus GS : Grouper spleen IFAT : Indirect fluorescent antibody test IPTG : isopropyl β-D- thiogalactoside NNV : Nervous necrosis virus NCR : Non coding region ORF : Open reading frame RGNNV : Red spotted grouper nervous necrosis virus SJNNV : Stripped jack nervous necrosis virus UV : Ultraviolet light TCID50 : 50% Tissue culture infective dose VNN : Viral nervous necrosis TBS : Tris Buffer Saline TBST : TBS - Tween BSA : Bovine Serum Albumin EDTA : Ethyllene diamine tetra acetic acid TAE : Tris - acetate - EDTA LB : Lubria – Bertani PBS : Phosphate buffer IgG : Immunoglobulin G KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tách dòng thành công xác định đƣợc trình tự gen T4 mã hóa cho kháng nguyên bề mặt virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Trình tự gen có độ tƣơng đồng đạt 99% so với trình tự Genbank Đã biểu thành công gen mã hóa kháng nguyên bề mặt NNV hệ biểu pET-32a(+), E.coli BL21 Chủng vi khuẩn biểu E.coli BL21pET32/T4 đƣợc phát kháng thể đặc hiệu với NNV thành phần protein có kích thƣớc 25 kDa Chủng vi khuẩn E.coli BL21-pET32/T4 biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt NNV có khả tạo kháng thể trung hòa đặc hiệu thỏ cá mú Kiến nghị - Tối ƣu hóa điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ IPTG để thu đƣợc lƣợng protein tối đa - Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện sản phẩm vắc xin nhằm phục vụ sản xuất đƣợc vắc xin phòng bệnh cho cá mú nuôi công nghiệp 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2012), Thông tư ban hành Danh mục bệnh thủy sản phải công bố dịch, Hà Nội, tháng năm 2012 Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh, Trƣơng Hồng Việt (2005), “Bệnh thƣờng gặp cá mú nuôi Vũng Tàu”, Hội thảo quốc gia Phát triển thủy sản vùng hạ lưu sông Mekong, Bộ Thủy sản, 01, 529-534 Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Ngọc Du (2008), Bài giảng Tổng quan bệnh nguy hiểm thường gặp động vật nuôi biển, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, TP Hồ Chí Minh Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên (2008), “Bệnh tử hoại thần kinh cá biển nuôi Khánh Hòa”, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy Sản, 01, 19-24 Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Thu Hiền, Vũ Tiến Lâm, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Nghiên cứu khả gây bệnh gây đáp ứng miễn dịch virut gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú nuôi Việt Nam”, Khoa học kỹ thuật thú y, 19 (6), 76-79 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thi Vui (2012), Phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú, Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp, Trƣờng đại học Vinh, Nghệ An 78 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Arimoto M., Mushiake K., Mizuta Y., Nakai T., Muroga K., Furusawa I (1992), “Detection of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA)”, Fish Pathol, 27, pp 191-195 Arimoto M., Sato J., Maruyama K., Mimura G and Furusawa (1996), “Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV)”, Aquaculture, 143, pp 15-22 10 Azad I.S., Shekar M.S., Thirunavukkarasu A.R., Poornima M., Kailasan M., Rajan J.S., Ali S.A., Abraham M., Ravichandran P (2005), “Nodavirus infection causes mortalities in hatchery produced larvae of Lates calcarifer First report from India”, Dis Aquat Organ, 63, pp 113-118 11 Azad I.S., Shekhar M.S., Thirunavukkarasu A.R., Jithendran K.P (2006), “Viral nerve necrosis in hatchery-produced fry of Asian seabass Lates calcarifer: sequential microscopic analysis of histopathology”, Dis Aquat Organ, 73, pp 123-130 12 Baeck G.W., Gomez D.K., Oh K.S., Kim J.H., Choresca C.H., Park S.C (2007), “Detection of piscine nodaviruses from apparently healthy wild marine fish in Korea”, Bull Eur Assoc Fish Pathol, 27, pp 116-122 13 Barke D.E., MacKinnon A.M., Boston L., Burt M.D., Cone D.K., Speare D.J., Griffiths S., Cook M., Ritchie R., Olivier G (2002), “First report of piscine nodavirus infecting wild winter flounder Pleuronectes americanus in Passamaquoddy Bay, New Brunswick”, Canada Dis Aquat Organ, 49, pp 99-105 14 Bloch B., Gravningen K & Larsen J L (1991), “Encephalomyelitis among turbot associated with picoARNvirus-like agent”, Diseases of Aquatic Organisms, 10, pp 126-139 79 15 Breuil G., Bonami J.R., Pepin J.F., and Pichot Y (1991), “Viral infection (picoARN-like virus) associated with mass mortalities in hatchery-reared sea-bass (Dicentrarchus labrax) larvae and juveniles”, Aquaculture, 97, pp 109-116 16 Cherif N., Gagne N., Groman D., Kibenge F., Iwamoto T., Yason C., Hammami S (2010), “Complete sequencing of Tunisian redspotted grouper nervous necrosis virus betanodavirus capsid gene and ARN-dependent ARN polymerase gene”, J Fish Dis, 33, pp 231-240 17 Chi S.C., Lo C.F., Kou G.H., Chang P.S., Peng S.E., Chen S.N (1997), “Mass mortalities associated with viral nervous necrosis (VNN) disease in two species of hatchery-reared grouper, Epinephelus fuscogutatus and Epinephelus akaara (Temminck & Schlegel)”, J Fish Dis, 20, pp 185-193 18 Chi S.C., Shieh J.R., Lin S.J (2003), “Genetic and antigenic analysis of betanodavirus isolated from aquatic organisms in Taiwan”, Dis Aquat Organ, 55, pp 221-228 19 Chi S.C., Wu Y.C., Cheng T.M (2005), “Persistent infection of betanodavirus in a novel cell line derived from the brain tissue of barramundi Lates calcarifer”, Dis Aquat Organ, 65, pp 91-98 20 Chua F.H.C., Loo J.J., Wee J.Y (1995), “Mass mortality in juvenile greasy grouper, Epinephelus tauvina, associated with vacuolating encephalopathy and retinopathy”, Dis Asian Aquac, 11, pp 235-241 21 Comps M., Trindade M., Delsert C.L (1996), “Investigation of encephalitis viruses (FEV) expression in marine fishes using DIG-labelled probes”, Aquaculture, 143, pp 113-121 22 Crane M., Hyatt A (2011), “Review Viruses of fish: an overview of significant pathogens”, ViruseS, 3(11), pp 2025-46 80 23 Danayadol Y., Direkbusarakom S., Supamattaya K (1995), “Viral nervous necrosis in brownspotted grouper”, Epinephelus malabaricus 24 Delsert C., Morin N & Comps M (1997), “Fish nodavirus lytic cycle and semipermissive expression in mammalian and ®sh cell culture”, JouARNl of Virology, 71, pp 5673-5677 25 Fenner B.J., Thiagarajan R., Chua H.K., Kwang J (2006), “Betanodavirus B2 is a ARN interference antagonist that facilitates intracellular viral ARN accumulation”, J Virol, 80, pp 85-94 26 Frerichs G.N., Rodger H.D & Peric Z (1996), “Cell culture isolation of piscine neuropathy nodavirus from juvenile sea bass, Dicentrarchus labrax”, J Gen Virol, 77, pp 2067-2071 27 Frerchs G.N., Tweedie A., Starkey W.G and Richards R.H (2000), “Temperature, pH and electrolyte sensitivity and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus”, Aquaculture, 185, pp 12-24 28 Glazebrook J.S., Heasman M.P and de Beer S.W (1990), “PicoARN-like viral particles associated with mass mortalities in larval barramundi, Lates calcarifer Bloch”, JouARNl of Fish Diseases, 13, pp 245-249 29 Grotmol S., Bergh O., Totland G.K (1999), “Transmission of viral encephalopathy and retinopathy (VER) to yolk-sac larvae of the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus: occurrence of nodavirus in various organs and a possible route of infection”, Dis Aquat Organ, 36, pp 95-106 30 Grotmol S., Nerland A.H., Beering E., Totland G.K., Nishizawa T (2000), “Characterisation of the capsid protein gene from a nodavirus strain affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an optimal RT– PCR (RTPCR) detection assay”, Dis Aquat Organ, 39, pp 79-88 81 31 Husgar S., Grotmol S., Hjeltnes B.K., Rodseth O.M., Biering E (2001), “Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus, and evaluation of a vaccine against SJNNV”, Dis Aquat Organ, 45, pp 33-44 32 Iwamoto T., Mise K., Takeda A., Okinaka Y., Mori K.I., Arimoto M., Nakai T (2005), “Characterization of striped jack nervous necrosis virus sub genomic ARN3 and biological activities of its encoded protein B2”, J Gen Virol, 6, pp 2807-2816 33 Johansen R., Sommerset I., Tørud B., Korsnes K., Hjortaas M.J., Nilsen F., Nerland A.H., Dannevig B.H (2004), “Characterization of nodavirus and viral encephalopathy and retinopathy in farmed turbot, Scophthalmus maximus”, J Fish Dis, 27, pp 591-601 34 Johnson S.C., Sperker S.A., Leggiadro C.T., Groman D.B., Griffiths S.G., Ritchie R.J., Cook M.D., Cusack R.R (2002), “Identification and characterization of a piscine neuropathy and nodavirus from juvenile Atlantic cod from the Atlantic coast of North America”, J Aquat Anim Health, 14, pp 124-133 35 Lai Y.S., Chiu H.C., Murali S., Guo I.C., Chen S.C., Fang K & Chan C.Y (2001a), “In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper, Epinephelus awoara (Temmink & Schlegel)”, J Fish Dis, 24, pp 237-244 36 Liu H., Teng Y., Zheng X., Wu Y., Xie X., He J., Ye Y., Wu Z (2012), “Complete sequence of a viral nervous necrosis virus (NNV) isolated from red-spotted grouper (Epinephelus akaara) in China”, Arch Virol, 157, pp 777-782 82 37 Maltese C and Bovo G (2001), “Effects of some chemico-phisical treatments on the virus causing the Viral Encephalo-Retinopathy in farmed sea bass (Dicentrarchus labrax)”, Bol Soc It Patol Ittica, 31, pp 3-16 38 Manin B.O., Ransangan J (2011), “Experimental evidence of horizontal transmission of betanodavirus in hatchery-produced Asian seabass, Lates calcarifer and brown-marbled grouper, Epinephelus fuscoguttatus fingerling”, Aquaculture, 321, pp 157-165 39 Mezeth K.B., Patel S., Henriksen H., Szilvay A.M., Nerland A.H (2009), “B2 protein from betanodavirus is expressed in recently infected but not in chronically infected fish”, Dis Aquat Organ, 83, pp 97-103 40 Mladineo I (2003), “The immunohistochemical study of nodavirus changes in larva, juvenile and adult sea bass tissue”, J Appl Ichthyol, 19, pp 366-370 41 Mori K.I., Nakai T , Muroga K., Arimoto M., Mushiake K and Furusawa I (1992), “Properties of a new virus belonging to nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis”, Virology, 187, pp 368-371 42 Munday B.L., Kwang J., Moody N (2002), “Betanodavirus infections of teleost fish: a review”, J Fish Dis, 25, pp 127-142 43 Munday B.L., Langdon J.S., Hyatt A & Humpphrey J.D (1992), “Mass mortality associated with a viral-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundi”, Lates calcarifer (Bloch), Aquaculture, 103, pp 197-211 44 Nakai T., Mori K., Nishizawa T., Muroga K (1995), “Viral nervous necrosis of larval and juvenile marine fish In: Proceedings of the ARN intetional symposium on biotechnology applications in aquaculture”, Asian Fisheries Society, 10, pp 147-52 83 45 Nakai T., Mori K., Sugaya T., Nishioka T., Mushiake K., Yamashita H (2009), “Current knowledge on viral nervous necrosis (VNN) and its causative betanodaviruses”, Isr J Aquacult-Bamid, 61, pp 198-207 46 Nguyen H.D., Nakai T., Muroga K (1996), “Progression of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) infection in naturally and experimentally infected striped jack Pseudocaranxdentex larvae”, Dis Aquat Organ, 24, pp 99-105 47 Nishizawa T., Mori K., Furuhashi M., Nakai T., Furusawa I., Muroga K (1995), “Comparison of the coat protein genes of five fish nodaviruses, the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish”, J Gen Virol, 76, pp 1563-1569 48 Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Nakai T., Muroga K.(1997), “Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene”, Appl Environ Microbiol, 63, pp 1633-1636 49 Panzarin V., Fusaro A., Monne I., Cappellozza E., Patarnello P., Bovo G., Capua I., Holmes E.C., Cattoli G (2012), “Molecular epidemiology and evolutionary dynamics of betanodavirus in southern Europe”, Infect Genet Evol, 12(1), pp 63-70 50 Peducasse S., Castric J., Thiery R., Jeffroy J., Le Ven A & Baudin Laurencin F (1999), “Comparative study of viral encephalopathy and retinopathy in juvenile sea bass Dicentrarchus labrax infected in diferent ways”, Dis Aquat Org, , 36, pp 11-20 51 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A laboratory manua Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor 52 Scherer W.F $ Hurtbut H.S (1967), “Nodamura virus from Japan, a new and unusual arbovirus resistant to diethyl ether and chloroform”, Am.J.Epidemiol, 86, pp 271-285 84 53 Schneemann A., Ball A.L., Delsert C., Johnson J.E., Nishizawa T (2005), “Family Nodaviridae In Virus taxonomy”, Academic Press San Diego, pp 865-872 54 Skliris G.P., Richard R.H (1999), “Induction of nodavirus disease in sea bass, Dicentrarchus labrax, using different infection models”, Virus Res, 63, pp 85-93 55 Skliris G.P., Krondiris J.V., Sideris D.C., Shinn A.P., Starkey W.G., Richard R.H (2001), “Phylogenetic and antigenic characterization of new fish nodavirus isolates from Urope and Asia”, Virus Res, 75, pp 59-67 56 Sommerset I., Nerland A.H (2004), “Complete sequence of ARN1 and subgenomic ARN3 of Atlantic halibut nodavirus (AHNV)”, Dis Aquat Organ, 58, pp 117-125 57 Tanaka S., Mori K., Arimoto M., Iwamoto T., Nakai T (2001), “Protective immunity of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunberg, against experimental viral nervous necrosis”, J Fish Dis, 24, pp 15-22 58 Thiery R., Cozien J., Cabon J., Lamour F., Baud M., Schneemann A (2006), “Induction of a protective immune response against viral nervous necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using betanodavirus virus-like particle”, J Virol, 80, pp 10201-10207 59 Watanabe K., Nishizawa T., Yoshimizu M (2000), “Selection of broodstok candidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis Aquat Organ, 41, pp 219-223 60 Yamashita Y., Fujita Y., Kawakami H., Nakai T (2005), “The efficacy of inactivated virus vaccine against viral nervous necrosis (VNN)”, Fish Pathol, 40, pp 15-21 61 Yoshimizu M., Suzuki K., Nishizawa T., Winton J.R., Ezura Y (1997), “Antibody screening for the identification of nervous necrosis in flounder 85 broodstock In: Proceedings NRIA inteARNtional workshop on new approaches to viral diseases of aquatic animals”, Kyoto: USGS, p 124-30 62 Yuasa K., Koesharyani I., Roza D., Mori K., Katata M., Nakai T (2002), “Immune response of humpback grouper, Cromileptes altivelis (Valenciennes) injected with the recombinant coat protein of betanodavirus”, J Fish Dis, 25, pp 53-56 63 Zafran K.I., Johnny F., Yuasa K., Harada T., Hatai K (2000), “Viral nervous necrosis in humpback grouper Cromileptes altivelis larvae and juveniles in Indonesia”, Fish Pathol, 35, pp 95-96 MỘT SỐ TRANG WEB 64 http://www.vietlinh.com.vn/library/aquaculture_fish_and_others/mu_giong.asp 65 http://vi.wikipedia.org/wiki/Epinephelus 66 http://en.wikipedia.org/wiki/Betanodavirus 67 tepbac.com/disease/full/1/Benh-hoai-tu-than-kinh.htm 68 www.fisheries.noaa.gov/mb/sk/pdf/report_18.pdf 69 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 86 PHỤ LỤC CÁC DUNG DỊCH CẦN PHA Tris-HCl 1M, pH 8,0 (1 L) Hòa tan 121,1 g Tris base 800 ml H2O Điều chỉnh pH đạt đến 8,0 với HCl Sau bổ sung H2O đến đủ lít trùng EDTA 0,5M, pH 8,0 (500 ml) Hòa tan 95,5 g Na2EDTA 400 ml H2O Điều chỉnh pH đạt đến 8,0 với NaOH Sau bổ sung lƣợng nƣớc đến đủ 500 ml trùng NaCl 5M (100 ml) Hòa tan 29,22 g NaCl 80 ml H2O Sau bổ sung thêm nƣớc đến đủ 100 ml trùng Đệm potassium phosphate 0,1M, pH 7,5 (500 ml) Hòa tan 7,26 g K2HPO4 1,13 g KH2PO4 400 ml H2O Sau bổ sung nƣớc đạt tới đủ 500 ml TE (500 ml) Tên hóa chất Thể tích Nồng độ cuối M Tris-HCl, pH 8.0 ml 10 mM 0.5 M EDTA, pH 8.0 ml mM H2 O 493 ml TAE 50X (1L) Tris base 242,2 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0 100 ml Hòa tan, sau bổ sung nƣớc đến đủ L Dung dịch dùng để làm thí nghiệm TAE 1X Ethidium bromide (10 ml) Hòa tan 100 mg EtBr 10 ml H2O Khuấy bảo quản 4oC bóng tối SDS 10% (100 ml) Hòa tan 10 g sodium dodecyl sulfate 80 ml H2O Bổ sung nƣớc vừa đủ 100 ml Acrylamide 30% stock solution (500 ml) Hòa tan 150 g acrylamide g bis-acrylamide 350 ml H2O Sau bổ sung lƣợng nƣớc vừa đủ 500 ml Bảo quản 4oC 10 Tris-HCl M, pH 8,8 (1 L) Hòa tan 121,1 g tris base 800 ml H2O Điều chỉnh pH đến 8,8 với HCl Sau bổ sung nƣớc vừa đủ L trùng 11 Tris-HCl M, pH 6,8 (1 L) Hòa tan 121,1 g tris base 800 ml H2O Điều chỉnh pH đến 6,8 với HCl Sau bổ sung nƣớc vứa đủ L trùng 12 Gel tách 15% Acrylamide stock solution 30% 2,5 ml Tris-HCl M, pH 8,8 1,9 ml H2 O 0,5 ml SDS 10% 50 µl APS10% 50 µl TEMED µl 13 Gel cô 5% (2 ml) Acrylamide stock solution 30% 330 µl Tris-HCl M, pH 6,8 250 µl H2 O 1,38 ml SDS 10% 20 µl APS 10% 20 µl TEMED µl 14 Sample buffer 5X (cho SDS-PAGE) (10 ml) Hóa chất Thể tích Nồng độ cuối Tris-HCl M, pH 6,8 2,25 ml 0,225 M ml 50% Glycerol SDS 0,5 g 5% Bromophenol blue mg 0,05% M DTT 2,5 ml 0,25 M 15 Electrophoresis buffer 5X (1 L) Nồng độ cuối Tris base 60,6 g 0,5 M Glycine 144,1 g 1,92 M 5g 0, 5% SDS 16 TBS 10X (1 L) Hòa tan 12,1 g Tris base 87,66 g NaCl 800 ml H2O Điều chỉnh pH đến 7,4 với HCl Sau bổ sung nƣớc vừa đủ L 17 TBST Bổ sung ml Tween 20 vào 999 ml TBS Bovine Serum Albumin 3% (BSA) Hòa tan grams BSA vào TBST để thể tích cuối 100 ml 18 Transfer buffer cho phản ứng Western blot (1 L) Tris base 3,0 g 25 mM Glycine 11,3 g 150 mM Methanol 200 ml 20% 19 Solution I (50 ml) 50 mM glucose 25 mM Tris HCl pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 Bổ sung H2O đến đủ 50 ml 20 Solution II ( 50 ml) 200 mM NaOH 10% SDS Bổ sung H2O vừa đủ 50 ml 21 Solution III (100ml) 60 ml potassium acetate 5M 11,5 ml acid acetic Bổ sung H2O vừa đủ 100 ml [...]... kinh ở cá mú Epinephelus sp phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp 2 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus phục vụ công tác chẩn đoán và nghiên cứu nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú 2.2 Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu đƣợc gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú - Xác định... vắc xin có hiệu lực cao hơn, đem lại khả năng phòng bệnh tốt hơn, giúp giảm thiểu sự thất thoát do bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng đến việc tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV làm tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cho cá mú, chúng tôi đã chọn đề tài: Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá. .. năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp T4 trên động vật thí nghiệm làm cơ sở nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh cho cá 3 Nội dung nghiên cứu (1) Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T4 của virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) ở cá mú (2) Biểu hiện gen thành công kháng nguyên bề mặt của NNV trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21(DE3) (3) Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên. .. lực của chủng vi sinh vật gây bệnh đƣợc tổng hợp và đƣa trực tiếp vào cơ thể cá hoặc đƣợc nhân lên trong vi sinh vật mang trƣớc khi đƣa vào cá Đây là công nghệ sản xuất vắc xin mới nhất và thƣờng áp dụng trong việc sản xuất vắc xin phòng bệnh do virus gây ra .Vắc xin tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở hai dạng, vắc xin tiểu phần và vắc xin DNA Vắc xin tiểu phần đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng một đoạn phân tử. .. nguyên tái tổ hợp: - Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ - Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ 1.1.1 Cá mú Cá mú hay cá song là giống cá có tên khoa học là Epinephelus (tên tiếng Anh: groupers) thuộc họ (Serranidase), bộ cá vƣợc... dụng vắc xin mà lƣợng kháng sinh đƣợc sử dụng cho cá hồi giảm từ 600kg/800 ngàn tấn cá năm 2003 19 xuống còn 300 kg/1000 tấn cá năm 2008, điều này chứng tỏ vai trò của vắc xin trong nuôi trồng thủy sản ngày càng lớn Đối với bệnh do virus, vắc xin phòng bệnh chủ yếu đƣợc sản xuất từ kháng nguyên bất hoạt và tái tổ hợp Vắc xin bất hoạt đƣợc sản xuất từ virus nuôi cấy trên các dòng tế bào liên tục của cá. .. do bệnh gây ra dao động từ 50- 100% tùy thuộc vào loài và giai đoạn xuất hiện bệnh [4] Từ tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi các biện pháp phòng bệnh hiệu quả Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó vắc xin phòng bệnh cho cá là giải pháp hữu hiệu Ở nƣớc ta hiện tại vắc xin sử dụng để phòng bệnh cho cá mú là vắc xin bất... ở vùng biển Thái Bình Dƣơng Theo Viện Hải dƣơng học Nha Trang, nƣớc ta có khoảng trên 30 loài cá mú, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế cao, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu nhƣ: cá 4 mú vạch (E brunneus), cá mú chấm tổ ong (E merra), cá mú đỏ (E akaara), cá mú hoa nâu (E fuscoguttatus), cá mú cáo (E megachir), cá mú đen (E heeberi), cá mú mỡ (E tauvina) Vùng biển Bắc Bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú. .. hiện tại, vắc- xin này đã đƣợc sản xuất để phòng bệnh do IPNV gây trên cá hồi Vắc xin DNA hoạt động theo nguyên tắc tạo đáp ứng miễn dịch di truyền, hệ thống miễn dịch của vật chủ đƣợc chủng vắc xin phản ứng với kháng nguyên do chính nó tổng hợp từ một đoạn DNA hoặc RNA mã hóa kháng nguyên của mầm bệnh đƣợc đƣa vào cơ thể Thay cho việc sản xuất kháng nguyên, ngƣời ta phân lập gen mã hóa kháng nguyên đặc... khuyến cáo - Đối với cá nuôi lồng bè trên biển, thả giống kích cỡ nhỏ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn, nhƣng do nguy cơ của bệnh VNN gây tác hại lớn ở giống cỡ nhỏ, vì vậy nên thả giống cỡ lớn để hạn chế tác hại của bệnh VNN 9 1.2 VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS VIRUS - NNV) 1.2.1 Nguồn gốc Virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) thuộc giống Betanodavirus, họ Nodaviridae Tên gọi Nodavirus ... Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp virus gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú Epinephelus sp phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu gen mã hóa kháng. .. TỰ NHIÊN  - MẪN HỒNG PHƢỚC NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Vi sinh vật học... kháng nguyên tái tổ hợp T4 virus phục vụ công tác chẩn đoán nghiên cứu nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú 2.2 Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu đƣợc gen mã hóa kháng nguyên