ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã Số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời Hƣớng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Bộ Y tế tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hoá học, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân Tích, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ nhiều trình làm thực nghiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, năm 2015 Học viên Đỗ Thị Thu Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan nhóm alkaloid 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Khái quát nhóm alkaloid .3 1.1.3 Cấu tạo số alkaloid độc 1.1.4 Tác dụng độc tính số alkaloid 1.2 Các phƣơng pháp xác định .13 1.2.1 Phƣơng pháp điện di mao quản 13 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV 14 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ 16 1.3 Sắc ký lỏng khối phổ 18 1.3.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng 18 1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS) .18 1.3.2.4 Bộ phận phát 22 1.3.3 Phân tích định tính định lƣợng LC-MS/MS .22 1.4 Lấy mẫu 23 1.5 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 23 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu 27 2.3.1 Thiết bị 27 2.3.2 Dụng cụ 27 2.3.3 Chất chuẩn 28 2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tối ƣu điều kiện tách xác định alkaloid thiết bị LC/MS/MS 30 3.1.1 Tối ƣu điều kiện detector khối phổ (MS/MS) 30 3.1.2 Tối ƣu điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 33 3.2 Tối ƣu trình xử lý mẫu .42 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết .43 3.2.2 Khảo sát dung dịch kiềm hóa 45 3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa 46 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 48 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 48 3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn 49 3.3.3 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp 51 3.3.4 Đánh giá độ lặp lại độ thu hồi 52 3.4 Phân tích mẫu thực 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN .59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 65 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học số alkaloid độc đƣợc xác định đề tài Bảng 1.2 Các giá trị LD50 chất phân tích .8 Bảng3.1: Các mảnh ion định lƣợng định tính alkaloid 30 Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu MS/MS chế đô ̣ ion dƣơng 33 Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát 34 Bảng 3.4: Diện tích alkaloid sử dụng hệ dung môi khác 36 Bảng3.5: Các chƣơng trình gradient khảo sát 37 Bảng3.6: Ảnh hƣởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc alkaloid 41 Bảng 3.7 : Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết alkaloid 44 Bảng 3.8 : Ảnh hƣởng dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid 45 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid 46 Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn alkaloid 50 Bảng 3.11: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng alkaloid 51 Bảng 3.12: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg) 53 Bảng 3.13: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 0,1-1 mg/kg 54 Bảng 3.14: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 0,2-2 mg/kg 55 Bảng 3.15: Bảng kết phân tích mẫu thực 57 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 19 Hình 1.2: Cấu tạo phân tích khối tứ cực chập ba 21 Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ ion koumin atropin 31 Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 34 Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 35 Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 35 Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 35 Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 37 Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 38 Hình 3.9: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 38 Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 38 Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tốc độ dòng 0,6 mL/phút 40 Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tốc độ dòng 0,4 mL/phút 40 Hình 3.14: Biểu đồ phụ thuộc diện tích píc alkaloid vào nồng độ amoniacetat pha động 42 Hình 3.15: Sơ đồ quy triǹ h chiế t mẫu dƣ̣ kiế n 43 Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết alkaloid 44 Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hƣởng dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid 46 Hình 3.18 : Quy trình chiết mẫu tối ƣu 47 Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn 48 Hình 3.20: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ Atropin khoảng 0,5100 ng/mL 49 Hình 3.21: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ aconitin khoảng 51000 ng/mL 49 Hình 3.22: Đƣờng chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999) 50 Hình 3.23: Sắc đồ nicotin giới hạn phát LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6) 51 Hình 3.24: Sắc đồ Brucin giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5) 52 Hình 3.26: Sắc đồ atropin mẫu thực phẩm chức thêm chuẩn mức nồng độ 0,1 mg/kg 55 Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin mẫu thực phẩm chức thêm chuẩn mức nồng độ 0,2 mg/kg 56 Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát brucin 58 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát strychnin 58 BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile acetonitril Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa áp suất khí ionization CE Collision energy Năng lƣợng va chạm ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao APCI chromatography International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LD50 Lethal Dose Liều gây chết trung bình LOD Limit of deterction Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Methanol ODS Octadecylsilan Octadecylsilan RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn UPLC- Ultral performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu kết MS/MS chromatography tandem mass nối khối phổ IUPAC spectrometry UV Ultraviolet Tử ngoại Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P2.19: Sắc đồ koumin khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Hình P2.20: Sắc đồ nicotin khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Trƣờng Đại học KHTN 76 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P2.21: Sắc đồ scopolamin khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Hình P2.22: Sắc đồ strychnin khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Trƣờng Đại học KHTN 77 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Phụ lục 3: Đánh giá phƣơng pháp phân tích Hình P3.1: Sắc đồ aconitin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 500 µg/kg Hình P3.2: Sắc đồ atropin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 50 µg/kg Trƣờng Đại học KHTN 78 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.3: Sắc đồ colchicin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 500 µg/kg Hình P3.4: Sắc đồ koumin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 500 µg/kg Trƣờng Đại học KHTN 79 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.5: Sắc đồ nicotin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 50 µg/kg Hình P3.6: Sắc đồ scopolamin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 500 µg/kg Trƣờng Đại học KHTN 80 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.7: Sắc đồ strychnin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 500 µg/kg Hình P3.8: Sắc đồ aconitin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 81 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.9: Sắc đồ brucin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Hình P3.10: Sắc đồ colchicin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 82 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.11: Sắc đồ koumin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Hình P3.12: Sắc đồ scopolamin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 0,1 mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 83 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.13: Sắc đồ strychnin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Hình P3.14: Sắc đồ aconitin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 84 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.15: Sắc đồ brucin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Hình P3.16: Sắc đồ colchicin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 85 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P3.17: Sắc đồ koumin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Hình P3.18: Sắc đồ strychnin mẫu thêm chuẩn mức nồng độ mg/kg Trƣờng Đại học KHTN 86 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Bảng P3.1: Độ lệch chuẩn tƣơng đối lặp lại tối đa theo khoảng nồng độ Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 100 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1 % 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21 0,0000001 10-9 ppb 30 Bảng P3.2: Khoảng chấp nhận độ thu hồi nồng độ khác Hàm lƣợng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%] 100 100% 98-102  10 10-1 10% 98-102 1 10-2 1% 97-103  0,1 10-3 0,1 % 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 0,0000001 10-9 ppb 40-120 Trƣờng Đại học KHTN 87 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Phụ lục 4: Phân tích mẫu thực Hình P4.1: Kết mẫu không phát alkaloid Trƣờng Đại học KHTN 88 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học Hình P4.2: Sắc đồ mẫu Gout Hoàng Tiên Đan không phát alkaloid Hình P4.3: Kết mẫu phát strychnin Hình P4.4: Kết mẫu phát brucin Trƣờng Đại học KHTN 89 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học [...]... thực phẩm chức năng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu Do vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng và giúp cơ quan chức năng quản lý đƣa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dƣợc Chúng tôi đã tiến hành đề tài: Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng. .. đối tƣợng thực phẩm chức năng có nền mẫu phức tạp là khó khăn nên chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng 8 Trƣờng Đại học KHTN 17 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học alkaloid độc này bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Đây là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao 1.3 Sắc ký lỏng khối phổ 1.3.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là... DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần có phƣơng pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảo an toàn và sức khỏe ngƣời tiêu dùng Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng một số. .. lọc và Na2SO4 khan bằng CHCl3, rồi bay hơi CHCl3 (cô khô ở 50 0 C) thu đƣợc alkaloid toàn phần Sử dụng các phƣơng pháp: chiết phân đoạn trong các môi trƣờng pH khác nhau, chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để phân lập các cấu tử alkaloid từ cặn alkaloid toàn phần Xác định độ tinh khiết và định tính bằng sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS); điều kiện sắc. .. một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin, Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS  Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài:  Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định đồng thời các alkaloid  Khảo sát, tối ƣu hóa quá trình xử lý mẫu  Thẩm định phƣơng pháp phân tích... phƣơng pháp xác định các độc tố alkaloid nhóm pyrrolizidin trong thuốc thảo dƣợc truyền thống Trung Quốc Các chất senkirkin, senecionin, retrorsin và seneciphyllin đƣợc tách bằng dung dịch đệm có chứa borat 20 mM, SDS 30 mM và methanol 20 % ở pH 9,1 Giới hạn phát hiện của các chất trong khoảng 1,19 ÷ 2,70 µg/mL; giá trị RSD đều nhỏ hơn 5 %.[34] 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV Phƣơng pháp sắc. .. quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng- lỏng) Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng... với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6] Sau đó các chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phát hiện và ghi nhận thành tín hiệu sắc ký detector Có rất nhiều loại detector nhƣ UV, RF, khối phổ Hiện nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc của các chất phân tích là detector khối phổ 1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry... nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron 1.3.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS Đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách sắc ký là thời gian lƣu của các chất do vậy dựa vào thời gian lƣu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từng chất trong hỗn hợp Dùng phƣơng pháp đƣờng chuẩn và thêm chuẩn để định lƣợng... (methanol); tốc độ dòng 0,6 mL/phút Khoảng tuyến tính của các chất trong khoảng 0,5 ÷ 50 µg/L và 0,5 ÷ 500 µg/L, LOD trong khoảng 0,1 ÷ 1 µg/L Hiệu suất thu hồi từ 81,7 ÷ 102,3%, giá trị RSD nhỏ hơn 10 % và 15 %.[23] Nhận xét: Các phƣơng pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector UV); điện di (CE) thƣờng khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hƣởng của nền mẫu Việc tách và xác định đồng thời 8 chất trong ... - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã Số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC... lọc độ xác cao 1.3 Sắc ký lỏng khối phổ 1.3.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng Sắc ký lỏng trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn chất lỏng pha động chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng- lỏng)... quan chức quản lý đƣa khuyến cáo nhằm giảm nguy ngộ độc sử dụng thực phẩm chức có ngồn gốc thảo dƣợc Chúng tiến hành đề tài: Tách xác định số độc tố nhóm alkaloids thực phẩm chức phương pháp sắc