BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO Histomonas meleagridis KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO HISTOMONAS MELEAGRIDIS KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐỨC TÂN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG KHOA SAU ĐẠI HỌC PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA HOÀNG HÀ GIANG Khánh Hòa - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh gà” công trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố công trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ quý phòng ban trường Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ sinh học Môi trường điều kiện tốt cho hoàn thành đề tài Đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Đức Tân giúp hoàn thành tốt đề tài Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cán Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng, thầy cô Viện Công nghệ sinh học Môi trường tạo điều kiện giúp đỡ trình làm luận văn tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii PHẦN MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử bệnh đơn bào Histomonas meleagridis giới Việt Nam 1.2 Đặc điểm chung Histomonas meleagridis 1.2.1 Hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.2.3 Chu trình sinh học 1.3 Đặc điểm dịch tễ 1.3.1 Vật chủ cảm nhiễm 1.3.2 Một số nghiên cứu bệnh đơn bào Histomonas meleagridis giới Việt Nam 1.3.3 Mùa nhiễm bệnh 10 1.3.4 Vật chủ trung gian Heterakis gallinarum 10 1.3.4.1 Đặc điểm sinh học giun kim Heterakis gallinarum 10 1.3.4.2 Cơ chế sinh bệnh 12 1.3.5 Đường truyền bệnh 13 1.4 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh đơn bào Histomonas meleagridis 13 1.4.1 Triệu chứng lâm sàng 14 1.4.2 Bệnh tích 15 1.5 Đặc điểm mô bệnh học 16 1.6 Đặc điểm miễn dịch học 17 1.6.1 Miễn dịch chủ động 17 1.6.2 Miễn dịch thụ động 18 v 1.7 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh 18 1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 18 1.7.2 Chẩn đoán phân biệt 19 1.7.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 20 1.7.3.1 Xét nghiệm tiêu 20 1.7.3.2 Nuôi cấy 21 1.7.3.3 Kỹ thuật PCR 22 1.8 Một số biện pháp phòng trị bệnh 22 1.8.1 Phòng bệnh 22 1.8.2 Trị bệnh 23 1.9 Giới thiệu phản ứng PCR 24 1.9.1 Định nghĩa 24 1.9.2 Nguyên lý 25 1.9.3 Một số yếu tố ảnh hưởng giải pháp tối ưu hoá phản ứng PCR 27 1.9.3.1 DNA khuôn mẫu 27 1.9.3.2 Enzyme DNA polymerase 27 1.9.3.3 Primer nhiệt độ lai 28 1.9.3.4 Nồng độ dNTP 28 1.9.3.5 Dung dịch đệm 28 1.9.3.6 Nước 28 1.9.3.7 Nhiệt độ trình ủ 29 1.9.3.8 Số lượng chu kỳ phản ứng 29 1.9.3.9 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR 29 1.9.4 Ưu nhược điểm kỹ thuật PCR 29 1.9.4.1 Ưu điểm 29 1.9.4.2 Nhược điểm 30 Chương NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Nội dung nghiên cứu 31 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 31 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm, động vật thí nghiệm 31 2.2.2 Hóa chất- sinh phẩm 31 2.2.3 Máy móc, thiết bị 32 vi 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 32 2.3.2 Nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 33 2.3.2.1 Phương pháp xét nghiệm tiêu 33 2.3.2.2 Phương pháp nuôi cấy môi trường Dwyer 33 2.3.3 Phương pháp xác định vòng đời Histomonas meleagridis 34 2.3.3.1 Xác định trình phát triển Histomonas meleagridis trứng giun kim môi trường bên 34 2.3.3.2 Xác định trình phát triển Histomonas meleagridis thể gà 34 2.3.4 Nghiên cứu xác định triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis gây 35 2.3.5 Phương pháp chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 37 2.3.5.1 Chiết tách DNA 37 2.3.5.2 Quy trình PCR để phát Histomonas meleagridis 38 2.3.5.3 Chạy điện di đọc kết 40 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 41 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết xác định số đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 42 3.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Histomonas meleagridis 42 3.1.2 Đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 44 3.1.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 44 3.1.2.2 Kết xác định vòng đời Histomonas meleagridis 46 3.2 Kết xác định triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis 49 3.2.1 Kết xác định triệu chứng lâm sàng 49 3.2.2 Kết xác định bệnh tích 51 3.2.2.1 Kết xác định bệnh tích đại thể 51 3.2.2.2 Kết xác định bệnh tích vi thể 54 3.2.3 Chẩn đoán phân biệt bệnh Histomonas meleagridis với số bệnh truyền nhiễm (Newcastle Salmonella) 55 vii 3.3 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 56 3.3.1 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa 56 3.3.2 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo phương thức chăn nuôi 58 3.3.3 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà 59 3.3.4 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagiridis theo mùa vụ 60 Chương KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 62 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAC : Bacterial artificial chromosome (Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn) DNA : Deoxyribonucleic Acid DNase : Deoxyribonuclease ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) ETS : External Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên ngoài) GOT : Glutamic-Oxaloacetic Transaminase GPT : Glutamic Pyruvic Transaminase HE : Haematoxilin – Eosin ITS : Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên trong) LDH : Lactic MDH : Malic Dehydrogenase NFX : Nifurtimox PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Tính đa hình DNA nhân Dehydrogenase ngẫu nhiên) rDNA : ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid RNase : Ribonuclease rRNA : ribosomal Ribonucleic Acid STS : Sequence Tagged Site TBE : Tris Acetate-EDTA ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 42 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Histomonas meleagridis 43 Bảng 3.2 Số lượng Histomonas meleagridis môi trường nuôi cấy theo thời gian 46 Bảng 3.3 Thí nghiệm xác định vòng đời Histomonas meleagridis 50 Bảng 3.4 Triệu chứng lâm sàng gà nhiễm Histomonas meleagridis 52 Bảng 3.5 Bệnh tích đại thể quan gà bị bệnh Histomonas meleagridis 54 Bảng 3.6 Đặc điểm khác biệt bệnh Histomonas meleagridis với bệnh Newcastle Salmonella gà 58 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa 59 Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo phương thức chăn nuôi 61 Bảng 3.9 Tình hình nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà 62 Bảng 3.10 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis theo mùa vụ 63 x có số phận cao thấp so với kết nghiên cứu số tác giả như: + Mc Dougald (2005) nghiên cứu gà có 67,00% nhiễm bệnh có biểu manh tràng 17,00% có biểu gan với dấu hiệu gà bị nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis + Nguyễn Hữu Nam cộng (2013) nghiên cứu gà thả vườn có 86,50% gà nhiễm bệnh có biểu gan 96,20% có biểu manh tràng: Manh tràng gà bị loét xuất huyết, thành manh tràng dày, chất chứa bên màng cứng, bã đậu; gan gà bị bệnh có biến đổi gan sưng to bình thường, mềm nhũn, vết loét mặt gan hình hoa cúc, rìa mép hình cưa * Bệnh tích quan khác: Ngoài gan manh tràng ra, mổ khám nhận thấy bệnh tích số quan khác như: Ruột non xung huyết với tỷ lệ 35,00%; Lách sưng to, xuất huyết chiếm tỷ lệ 16,67%; Thận sưng, phổi tụ máu, bao tim tích nước ghi nhận số ca bệnh với tỷ lệ tương ứng 12,50%; 20,00% 13,30% 3.2.2.2 Kết xác định bệnh tích vi thể Bên cạnh việc quan sát bệnh tích đại thể, tiến hành quan sát bệnh tích vi thể gan manh tràng Nghiên cứu bệnh tích vi thể nội dung quan trọng giúp cho việc đánh giá tổn thương bệnh lý cấp độ mô bào Tuy nhiên bệnh gà nhiễm Histomonas meleagridis biến đổi tập trung chủ yếu gan manh tràng, tập trung làm rõ biến đổi vi thể gan manh tràng Kết bệnh tích vi thể cho thấy: - Xuất nhiều ổ viêm, hoại tử gan manh tràng; vùng tổn thương thấy nhiều tế bào Lympho đại thực bào xâm nhập, chúng tạo thành u hạt mô manh tràng gan - Hồng cầu bạch cầu tập trung nhiều vùng tổn thương mạch máu bị tắc bị vỡ - Xuất nhiều Histomonas meleagridis dạng hình trứng xen lẫn tế bào viêm mô bào vùng bị tổn thương (Hình 3.25, 3.26, 3.27 3.28) 54 H meleagridis H meleagridis Hình 3.25 3.26 Bệnh tích vi thể gan hoại tử có nhiều tế bào viêm Histomonas meleagridis (100X) Noãn nang Hình 3.27 3.28 Bệnh tích vi thể manh tràng gà bị hoại tử với vô số noãn nang (100X) 3.2.3 Chẩn đoán phân biệt bệnh Histomonas meleagridis với số bệnh truyền nhiễm (Newcastle Salmonella) Trong nghiên cứu, thấy triệu chứng lâm sàng, bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis có số đặc điểm giống với bệnh Newcastle Salmonella gà Vì để chẩn đoán phân biệt bệnh này, nghiên cứu đưa số yếu tố khác Bảng 3.6 55 Bảng 3.6 Đặc điểm khác biệt bệnh Histomonas meleagridis với bệnh Newcastle Salmonella gà Đặc điểm so sánh Histomonosis Bệnh Newcastle Salmonellosis Căn nguyên Đơn bào Virus Vi khuẩn Phần đầu Mào thâm tím, da mép da đầu xanh xám chí xanh đen Ít biến đổi Ít biến đổi Tiêu chảy, phân màu hồng lẫn máu Tiêu chảy, phân xanh, xanh trắng có mùi Tiêu chảy lúc đầu loãng thối vàng, xanh lục (gà lớn), sau tiêu chảy trắng bạch Ít biến đổi Sưng to có nhiều điểm hoại tử trắng lấm Ít biến đổi Viêm sưng nhẹ Trạng thái phân Gan Manh tràng Sưng to, mềm nhũn nhiều ổ viêm hoại tử bề mặt gan làm cho gan có hình hoa cúc Viêm sưng to, thành manh tràng dày, ruột chứa chất cứng dạng bã đậu 3.3 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 3.3.1 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa Để chẩn đoán phương pháp PCR, tiến hành thu thập mẫu gan, manh tràng phân 130 mẫu bệnh phẩm gà nuôi sở chăn nuôi huyện Cam Ranh huyện Ninh Hòa (Khánh Hòa) Mẫu bệnh phẩm thu thập theo tiêu dịch tễ như: Địa phương, tuổi, mùa vụ địa phương bảo quản - 20ºC Các mẫu bệnh phẩm tiến hành phân loại, xử lý, chiết tách DNA thực phản ứng PCR với cặp mồi HIS5F HIS5R Huber cộng (2005) Kết tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo địa phương phương pháp PCR thể Bảng 3.7 56 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa Tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis TT Địa điểm n + % Cam Ranh 70 11,43 Ninh Hòa 60 15,00 Cộng 130 17 13,08 Ghi chú: n tổng số mẫu nghiên cứu Kết Bảng 3.7 cho thấy tổng số 130 mẫu gà nuôi điểm huyện Cam Ranh huyện Ninh Hòa tỉnh Khánh Hòa lấy mẫu xét nghiệm có 17 nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 13,08% Trong đó, tỷ lệ nhiễm gà nuôi huyện Cam Ranh 11,43% huyện Ninh Hòa 15,00% Sự khác biệt tỷ lệ nhiễm huyện đề cập không lớn ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Như vậy, tỷ lệ gà nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis huyện Cam Ranh Ninh Hòa nằm khoảng giao động 10 - 20% Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Mc Dougald (1998) cho biết tỷ lệ gà bị bệnh Mỹ giao động 10 – 20% 57 10 11 M 209 bp 600 bp 300 bp 100 bp Hình 3.29 Ảnh đại diện kết điện di sản phẩm PCR Ghi chú: M: Marker Giếng số 11: Đối chứng âm Giếng 3, 7: Dương tính với Histomonas meleagridis có band kích thước khoảng 209 bp Giếng số 1, 4, 6, 8, 10: Âm tính Hình ảnh kết chạy PCR với cặp mồi HIS5F HIS5R cho thấy mẫu bệnh phẩm thu thập cho kết dương tính với đơn bào Histomonas meleagridis Đây cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 18S rRNA Histomonas meleagridis cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng 209 bp (Hình 3.29) 3.3.2 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo phương thức chăn nuôi Ở Khánh Hòa chăn nuôi gà chủ yếu theo hộ gia đình quy mô lớn từ vài trăm đến vài ngàn trại Ngoài việc chăn nuôi gà theo phương thức chăn nuôi truyền thống (nuôi theo phương thức thả vườn) phương thức chăn nuôi công nghiệp đà phát triển Vấn đề đặt liệu yếu tố dịch tễ (phương thức chăn nuôi) có ảnh hưởng đến tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis hay không? Để trả lời câu hỏi này, đề tài tiến hành lấy mẫu điều tra tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis gà nuôi theo phương thức tỉnh Khánh Hòa Kết thể Bảng 3.8 58 Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo phương thức chăn nuôi Gà nuôi thả vườn TT Địa điểm Gà nuôi công nghiệp Giá trị p n + % n + % Cam Ranh 35 20,00 35 2,86 0,04 Ninh Hòa 30 26,67 30 3,33 0,03 Cộng 65 15 23,08 65 3,08 0,03 Theo kết trình bày Bảng 3.8, gà thả vườn Cam Ranh nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis 20,00% gà nuôi công nghiệp 2,86% Tương tự, tỷ lệ nhiễm tương ứng gà thả vườn so với gà nuôi công nghiệp Ninh Hòa 26,67% 3,33% Tính chung cho huyện điều tra gà thả vườn nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp theo tỷ lệ tương ứng 23,08% 3,08% Sự khác biệt tỷ lệ nhiễm đơn bào gà thả vườn gà nuôi công nghiệp hai huyện Cam Ranh Ninh Hòa có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Kết lý giải đơn bào Histomonas meleagridis phát triển với trứng giun kim Heterakis gallinarum sau 12 – 14 ngày gây nhiễm cho gà Đối với gà nuôi theo phương thức công nghiệp, chuồng dọn dẹp hàng ngày làm hạn chế phát triển trứng giun kim Như vậy, gà nuôi theo phương thức thả vườn có hội tiếp xúc với mầm bệnh cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp nên gà nuôi thả vườn có tỷ lệ nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả cho biết gà thả vườn có tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis cao so với gà nuôi công nghiệp (Esquenet cộng sự, 2003; Grafl cộng sự, 2011) 3.3.3 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà Trong chăn nuôi gia cầm nói chung chăn nuôi gà nói riêng, số bệnh thường xảy lứa tuổi mà gặp lứa tuổi khác Chính vậy, để có thêm thông tin cho người dân biết cách phòng chống bệnh, lấy mẫu bệnh phẩm độ tuổi khác Kết trình bày Bảng 3.9 59 Bảng 3.9 Tình hình nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà TT Địa điểm ≥ tháng < tháng Tuổi n + % n + % Giá trị p Cam Ranh 35 8,57 35 14,29 0,50 Ninh Hòa 30 13,33 30 16,67 0,76 Cộng 65 10,77 65 10 15,38 0,40 Kết Bảng 3.9 cho thấy, Cam Ranh tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà nhóm < tháng tuổi chiếm 8,57% nhóm ≥ tháng tuổi chiếm 14,29% Tương tự, Ninh Hòa tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis nhóm < tháng tuổi chiếm 13,33% nhóm ≥ tháng tuổi chiếm 16,67% Tính chung cho hai huyện tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis nhóm tuổi < tháng ≥ tháng 10,77% 15,3% Như vậy, kết điều tra cho thấy gà nhóm tuổi khác điểm tỉnh Khánh Hòa nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis sai khác tỷ lệ nhiễm nhóm tuổi ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.5.4 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagiridis theo mùa vụ Khánh Hòa tỉnh vùng Duyên hải cực Nam Trung bộ; nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm chịu ảnh hưởng khí hậu đại dương Thời tiết chia thành mùa rõ rệt: Mùa mưa ngắn, từ tháng đến tháng 12 mùa khô từ tháng đến tháng dương lịch Mùa vụ yếu tố quan trọng bệnh nói chung, có bệnh đơn bào Histomonas meleagridis gây Trên sở nắm bắt quy luật phát sinh bệnh năm mà từ đề kế hoạch biện pháp phòng chống bệnh thích hợp Chính tiến hành đánh giá tình hình nhiễm Histomonas meleagridis mùa khô mùa mưa tỉnh Khánh Hòa Kết điều tra tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis theo mùa trình bày Bảng 3.10 60 Bảng 3.10 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis theo mùa vụ TT Địa điểm Mùa mưa Mùa khô Mùa n + % n + % Giá trị p Cam Ranh 35 20,00 35 2,86 0,04 Ninh Hòa 30 26,67 30 3,33 0,03 Cộng 65 15 23,08 65 3,08 0,03 Kết Bảng 3.10 cho thấy, 35 gà điều tra huyện Cam Ranh vào mùa khô có nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 20,00%; vào mùa mưa, tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis 2,86% Tương tự, huyện Ninh Hòa tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis vào mùa khô mùa mưa chiếm tỷ lệ 23,08% 3,08% Trong tổng số 65 gà điều tra hai huyện Cam Ranh Ninh Hòa vào mùa khô có 15 bị nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 23,08% Vào mùa mưa, số 65 gà điều tra có bị nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 3,08% Như vậy, tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà vào mùa khô cao so với mùa mưa sai khác có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Sở dĩ tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà vào mùa khô cao so với mùa mưa vào mùa khô gà thường nhiễm giun kim cao so với mùa mưa tỷ lệ nhiễm cường độ nhiễm, chúng thải số lượng lớn trứng bên Hơn nữa, điều kiện khí hậu mùa khô ấm áp thuận lợi để trứng giun kim phát triển từ truyền mầm bệnh Histomonas meleagridis cho gà (Phan Thế Việt, 1977) Ngược lại, vào mùa mưa đất đai ẩm ướt, nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến tồn phát triển trứng giun kim, khả gây nhiễm cho gà thấp mùa khô Kết phù hợp với kết nghiên cứu số tác giả Everette Lund (1974), Hauck cộng (2010) cho biết bệnh thường xảy vào khoảng thời gian từ cuối mùa xuân đến đầu mùa thu, lúc mà thời tiết thường nóng ẩm 61 Chương KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận - Nghiên cứu hình thái học cho thấy: Đơn bào Histomonas meleagridis có kích thước từ - 25 µm, hình tròn oval - Về đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis: Trong môi trường nuôi cấy Dwyer, số lượng đơn bào đạt cực đại sau 24 nuôi cấy, vòng đời Histomonas meleagridis cần phát triển qua giun kim thời gian cần thiết để hoàn thành vòng đời 36 – 42 ngày - Triệu chứng lâm sàng bệnh Histomonas melagridis: Gà ủ rũ, lông xù, ỉa chảy; mào tái, thâm tím màu xanh đen; Bệnh tích đại thể bệnh: Gan xuất huyết, hoại tử hình hoa cúc; Manh tràng trưng to, chất chứa vón thành cục dạng bã đậu Bệnh tích vi thể bệnh: Tại vùng tổn thương thấy tập trung nhiều tế bào lympho, đại thực bào, hồng cầu bạch cầu - Chẩn đoán bệnh Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR hai huyện Cam Ranh Ninh Hòa cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà giao động từ 10 – 20%, tỷ lệ gà nhiễm đơn bào gà nuôi theo phương thức thả vườn cao gà nuôi theo phương thức công nghiệp (23,08% so với 3,08%), sai khác tỷ lệ nhiễm đơn bào nhóm tuổi (10,77% so với 15,38%) tỷ lệ nhiễm đơn bào mùa khô cao mùa mưa (23,08% so với 3,08%) Khuyến nghị - Phải tăng cường thường xuyên công tác quản lý, giám sát chặt chẽ việc chăn thả gà gia cầm hộ chăn nuôi, khử trùng tiêu độc định kỳ, tuyên truyền cho người chăn nuôi thấy nguy hiểm bệnh đơn bào Histomonas meleagridis - Củng cố nâng cao trình độ chuyên môn thú y cấp, đặc biệt mạng lưới thú y sở việc chẩn đoán đoán lâm sàng, lấy mẫu, vận chuyển mẫu quy định phòng thí nghiệm 62 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Xuân Bình, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, 2002, 109 Bệnh gia cầm cách phòng trị, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, p 219-223 Lê Thị Thúy Dung, 2013, Các kỹ thuật PCR ứng dụng Luận văn kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Hà Nội, p 196-204 Lại Hà Tố Hoa, 2006, Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự ITSrDNA vùng TEF, Luận văn kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Phạm Văn Khuê, Phan Lục, 1996, Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội, p 138-139 Phạm Sỹ Lăng, 2011, Bệnh Đầu đen gia cầm Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, 2010, Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, p 64-71 Nguyễn Hữu Nam, Lê Văn Năm, Nguyễn Vũ Sơn, 2013, Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh Histomonas meleagridis gây gà thả vườn, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 20(3), p 43-47 Lê Văn Năm, 2011, Bệnh đầu đen gà gà tây, Tạp chí khoa học Công nghệ Chăn nuôi 2011, 9(4), p 88-90 10 Trịnh Văn Thịnh, 1963, Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất Nông thôn, p 173-175 11 Triệu Nguyên Trung, Huỳnh Hồng Quang, 2010, Một số ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử bệnh lý vi sinh vật ký sinh trùng 12 Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê, 1977, Giun sán ký sinh động vật Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp p 121-122 63 13 Hoàng Thị Tĩnh, 2009, Tình trạng nhiễm giun, sán đường tiêu hóa gà, số đặc điểm sinh học, bệnh lý học giun Ascaridia galli biện pháp phòng trừ, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội 14 Trần Quốc Thuyết, 2011, Tình hình nhiễm giun tròn đường tiêu hóa gà thuộc ngoại thành Hà Nội, đặc điểm phát triển giun kim (Heterakis gallinarum) hiệu lực thuốc tây, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 15 Adl, SM, Simpson, AG, Farmer, MA, Andersen, RA, Anderson, OR, Barta, JR, Bowser, SS, Brugerolle, G, Fensome, RA & Fredericq, S, 2005, The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists, Journal of Eukaryotic Microbiology, 52, p 399–451 16 Aka, J, Hauck, R, Blankenstein, P, Balczulat, S & Hafez, HM, Reoccurrence of Histomonas in turkey beeder farm, Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2011, 124, p 2-7 17 Alkhalaf, AN & Mahmoud, OM, An Outbreak of Concurrent Histomonas meleagridis and Enteroccocus fecalis infection in Ducks, Asian Journal of Poultry Science, 2009, 3, p 15-18 18 Bart, A, van der Heijden, HM, Greve, S, Speijer, D, Landman, WJ & van Gool, T, Intragenomic variation in the internal transcribed spacer region of Dientamoeba fragilis as a molecular epidemiological marker, J Clin Microbiol, 2008, 46, p 32703275 19 Bleyen, N, Ons, E, De Gussem, M & Goddeeris, BM, Passive immunization against Histomonas meleagridis does not protect turkeys from an experimental infection Avian Pathol, 2009, 38, p 71-76 20 Bowen, TE, Sullivan, TW & Grace, OD, Effect of cupric sulfate on prophylactic efficacy of arsenic acid compounds against histomoniasis in young turkeys, Poultry Sci, 1971, 50, p 861-866 21 Brown, DM, Upcroft, JA, Edwards, MR & Upcroft, P, Anaerobic bacterial metabolism in the ancient eukaryote Giardia duodenalis, Int J Parasitol 1998, 28, p 149-164 22 Cepicka, I, Hampl, V & Kulda, J, Critical taxonomic revision of parabasalids with description of one new genus and three new species, Protist, 2010, 161, p 400-433 64 23 Clarkson, MJ, Immunological responses to Histomonas meleagridis in the turkeys and fowl, Immunity, 1963, 6, p 156-168 24 Desowitz, RS, Age as a factor influencing fatal infections of histomoniasis in chickens, J Com Path and Therap, 1951, 61, p 231-236 25 Dwyer, DM, An improved method for cultivating Histomonas meleagridis, J Parasitol, 1970, 56, p 191-192 26 Esquenet, C, De Herdt, P, De Bosschere, H, Ronsmans, S, Ducatelle, R & Van Erun, J, An outbreak of Histomonas in free-range layer hens, Avian Pathol, 2003, 32, p 305-308 27 Farr, M, Further observations on survival of the protozoan parasite Histomonas melelagridis and eggs of poultry nematodes in feces of infected birds, Cornell Vet, 1961, 51, p 3-13 28 Flowers, AI, Hall, CF & Grumbles, LC, Chemotherapy of histomoniasis of turkeys, I Value of 1-2-dimethyl-5-nitroimidazole intreatment, Avian Dis, 1965, 9, p 394406 29 Grafl, B, Liebhart, D, Windisch, M, Ibesich, & Hess, C, Seroprevalence of Histomonas meleagridis in pullets and laying hens determined by ELISA, Vet Rec 2011, 6, p 160-168 30 Graybill, HW, Smith, T, Production of fatal blackhead in turkeys by feeding embryonated eggs of Heterakis papillosa, J Exp Med, 1920, 31, p 647-655 31 Graybill, HW, Blackhead and other causes of loss of turkeys in California, U Cal Agri Exper Sta Circ, 1925, 291, p 1-14 32 Griffiths, HJ, A Handbook of Veterinary Parasitology: Domestic Animals of North America, USA: University of Minnesota Press, Minneapolis, USA, 1978, p 23-25 33 Grumbles, LC, Boney, WA & Turk, RD, Chemotherapy of enterohepatitis of turkeys, I The value of 2-amino-5-nitrothiazole inprevention and treatment, Am J Vet Res, 1952, 13, p 383-385 34 Hafec, HM, Hauck, R, Luschow, D & Mc Dougald, LR, Comparision of the sppecificity and sensitivity of PCR, nested PCR and realtime PCR for diagnosis of Histomonas meleagridis, Avian Dis, 2005, 49, p 366-370 35 Hauck, R, Fuller AL, Greif G & McDougald, LR, Evaluation of nifurtimox for potential use in control of histomoniasis in turkeys, Avian Dis, 2010, 54, p 28-32 65 36 Hauck R, Lotfi A & Hafez, HM, Factors influencing the activity of tiamulin against Histomonas meleagridis in vitro, Avian Dis, 2010, 54, p 936-938 37 Hess M, Grabensteiner, E & Liebhart, D, Rapid transmission of the protozoan parasite Histomonas meleagridis in turkeys and specific pathogen free chickens following cloacal infection with a mono-eukaryotic culture, Avian pathol 2006, 35, p 280-285 38 Huber, K, Chauve, C & Zenner, L, Detection of Histomonas meleagridis in turkeys cecal droppings by PCR amplification of the small subunit ribosomal DNA sequence, Vet Parasitol, 2005, 131, p 311-316 39 Dinev, I, Histomonosis, 2005 Available from: 40 Martinez Guerrero Jose, H, Pereda Solis Martin, E, Rosales Alferez Federico & Herrera Casio Hector, M, First Report of Heterakis gallinarum in Gould’s Wild Turkey (Meleagris gallopavo mexicana) in Mexico, 2010, Available from: 41 McDougald, LR, Hansen, MF, Histomonas meleagridis: Effect on plasma enzymes in chickens and turkeys, Exp Parasitol, 1970, 27, p 235-239 42 McDougald, LR, Studies on Histomonas meleagridis and histomoiasis in chickens and turkeys, USA: The University of Georgia, 2002 43 McDougald, LR, Fuller, L, Blackhead disease in turkeys: direct transmission of Histomonas meleagridis from bird to bird in a laboratory model, Avian Dis, 2005, 49, p 328-331 44 Mc Dougald, LR, Molecular characterization of Histomonas meleagridis and other parabasalids in the united states using the 5.8S, ITS-1, and ITS-2 rRNA regions, USA: The University of Georgia, 2010 45 Milks, HJ, A preliminary report on some diseases of chickens, La Agr Exp Sta Bull, 1908, 108, p 1-17 46 Muller, M, Review article: the hydrogenosome, J Gen Microbiol, 1993, 139, p 2879-2889 66 47 Lui, W, Peng, J, Li, F, Sun, H, Ding, Y & He, J, Identification of Histomonas meleagridis by in vitro microculture and polymerase chain reaction, R Parasitol 2011, 1, p 1-6 48 Lund, EE & Chute, AM, Reciprocal transfer of Heterakis gallinarum Larvae between Ring-necked pheasants and Japanese quail: Effects on H gallinarum, Histomonas meleagridis, and Parahistomonas wenrichi, Proceedings of the Helm Soc Wash, 1974, 41, p 73-76 49 Ohara, T & Reid, WM, Histomoniasis in chickens Age of greatest susceptibility and pathogenicity studies, Avian Dis, 1961, 5, p 355-361 50 Permin, A & Hansen, JW, The Epidemiology, Diagnosis and Control of Poultry Parasites, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy, 1998 51 Smith, T, An infectious disease among turkeys caused by Protozoa (infectious entero-hepatitis), USDA Bur Anim Ind Bull 1895, 8, p 3-27 52 Smith, T & Graybill, HW, Blackhead in chickens and its experimental production by feeding embryonated eggs of Heterakis papillosa, J Exp Med, 1920, 32, p 143152 53 Tachezy, J, Sánchez, LB & Muller, Mitochondrial type iron-sulfur cluster assembly in the amitochondriate eukaryotes Trichomonas vaginalis and Giardia intestinalis, as indicated by the phylogeny of IscS, Mol Biol Evol, 2001, 18, p 1919-1928 54 Tyzzer, EE, The flagellate character and reclassification of the parasite producing “Blackhead” in turkeys – Histomonas meleagridis, J Parasitol, 1920, 6, p 31-124 55 Tyzzer, EE, Observations on the transimission of “blackhead” in turkeys, The common fowl as a source of infection, J Med Res, 1920, 41, p 219-237 56 Wilson, SG & Perie, NM, A study of the blood changes caused by Histomonas meleagridis in chickens, Tijdshr, Diergeneesk, 1967, 91, p 509-522 57 Windisch, M & Hess, M, Establishing an indirect sandwich enzyme-linkedimmunosorbent-assay (ELISA) for the detection of antibodies against Histomonas meleagridis from experimentally infected specific pathogen-free chickens and turkeys, Vet Parasitol, 2009, 161, p 25-30 67 58 Whitmore, JH, Sullivan, TW & Grace, D, Prophylactic efficacy of vitamin A and certain compounds against histomoniasis in turkeys, Poult Sci, 1968, 47, p 159164 59 Van der Heijden, HM, Stegeman, A & Landman, WJ, Development of a blocking – ELISA for the detection of antibodies against Histomonas meleagridis in chickens and turkeys, Vet Parasitol, 2010, 171, p 3-4 60 Venkataratnam, A & Clarkson, MJ, The effect of histomoniasis on the blood cells of the fowl, Res Vet Sci, 1963, 4, p 603-607 61 Zaragatzki, E, Hess, M, Grabensteiner, E, Abdel-Ghaffar, F, Al-Rasheid, KA & Mehlhorn, H, Light and transmission electron microscopic studies on the encystation of Histomonas meleagridis, Res Parasitol, 2010, 106, p 977-983 68 [...]... giữa đơn bào Histomonas meleagridis và vật chủ tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà 1 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được đặc điểm hình thái cấu tạo, vòng đời của Histomonas meleagridis - Xác định được triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis gây ra - Chẩn đoán Histomonas meleagridis. .. tiến hành đề tài Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà Mục tiêu của đề tài là xác định được đặc điểm hình thái cấu tạo, vòng đời của Histomonas meleagridis; triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh; chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR nhằm làm cơ sở cho việc phòng chống bệnh do Histomonas meleagridis gây ra trên gà, góp phần phát triển... Để đáp ứng mục tiêu trên, đề tài tiến hành xác định các đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học của đơn bào bằng phương pháp xét nghiệm tiêu bản và nuôi cấy trên môi trường Dwyer; bố trí thí nghiệm sự phát triển của mầm bệnh ở môi trường tự nhiên và gây nhiễm mầm bệnh trên gà để nghiên cứu vòng đời (chu kỳ sinh học) Ngoài các phương pháp thường quy trong nghiên cứu đơn bào ký sinh, đề tài còn sử... thấy bị nhiễm Histomonas meleagridis tuy nhiên không có triệu chứng lâm sàng (Tyzzer, 1920a; Vander Heijden, 2010) 1.3.2 Một số nghiên cứu về bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis trên thế giới và tại Việt Nam Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về Histomonas meleagridis như: - Permin và Hansen (1998) cho biết, đơn bào Histomonas meleagridis có thể gây nhiều bệnh tích ở ruột, đặc biệt là... cho thấy, về hình thái học đơn bào Histomonas meleagridis có kích thước từ 8 – 25 µm dạng hình tròn hoặc oval Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học cho thấy, số lượng đơn bào nuôi cấy trong môi trường Dwyer đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và vòng đời của đơn bào Histomonas meleagridis là 36 – 42 giờ Triệu chứng lâm sàng chính của bệnh là gà ủ rũ, mào tái, thâm tím Bệnh tích đặc trưng là tổn thương... hàn Đặc biệt là bệnh Đầu đen do đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà đã làm ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả chăn nuôi như: Gà còi cọc, chậm lớn, giảm sản lượng thịt, trứng, Bệnh Đầu đen (Blackhead disease) là một bệnh xảy ra chủ yếu ở gà ta và gà tây do một loại đơn bào Histomonas meleagridis gây ra Bệnh lần đầu xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc, đến nay bệnh cũng đã phát hiện được ở một số. .. hydrogenosomes, một roi duy nhất, có nhiều ribosome và một số lượng lớn hạt glycogen trong tế bào chất và không bào 1.2.3 Chu trình sinh học Chu trình sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis được cho thấy ở Hình 1.2: Đơn bào Histomonas meleagridis gây bệnh cho gia cầm thông qua đường ăn uống, khi gia cầm nuốt phải trứng giun kim Heterakis gallinarum có chứa Histomonas meleagridis Sau khi đi xuống ruột của. .. nhân (một nhân to và một nhân nhỏ), từ nhân to mọc ra một roi duy nhất, dạng này thường tìm thấy trong phân gia cầm (Smith, 1895) 4 Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của Histomonas meleagridis (Milks, 1908) A, B: Histomonas meleagridis ở dạng hình amip C: Histomonas meleagridis ở dạng hình trùng roi Tyzzer (1920a) và Zaragatzki (2010) đã nghiên cứu về hình thái học và mô tả sự tồn tại của Histomonas meleagridis. .. 12 - 21µm, đơn bào có các tế bào chất ưa kiềm và một lượng nhỏ chất dạng lưới hoặc dạng hạt ở xung quanh hạt nhân - Giai đoạn 3: Đơn bào Histomonas meleagridis có kích thước nhỏ hơn khoảng từ 5 – 22 µm và có sự xuất hiện của lớp màng kép giống với cấu trúc u nang của ký sinh trùng Các tế bào kích thước nhỏ ở giai đoạn này được đặc trưng bởi cấu trúc dạng hạt khác nhau Đơn bào Histomonas meleagridis. .. và phạm vị nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Đơn bào Histomonas meleagridis trên gà ở các lứa tuổi 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Địa điểm lấy mẫu tại Cam Ranh và Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa - Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phân viện Thú y Miền Trung Nha Trang; Bộ môn Ký sinh trùng và bộ môn bệnh lý, Khoa chăn nuôi thú y, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội - Thời gian: Tháng 5/2014 – Tháng 5/2015 4 Ý nghĩa của đề tài 4.1 ... im hỡnh thỏi cu to, c im sinh hc ca Histomonas meleagridis 42 3.1.1 c im hỡnh thỏi cu to ca Histomonas meleagridis 42 3.1.2 c im sinh hc ca Histomonas meleagridis 44 3.1.2.1... c im sinh hc ca n bo Histomonas meleagridis ký sinh trờn g Mc tiờu ca ti l xỏc nh c c im hỡnh thỏi cu to, vũng i ca Histomonas meleagridis; triu chng lõm sng v bnh tớch ca bnh; chn oỏn Histomonas. .. Histomonas meleagridis - Nghiờn cu vũng i ca Histomonas meleagridis - Nghiờn cu xỏc nh triu chng lõm sng ca bnh Histomonas meleagridis g - Nghiờn cu bnh tớch i th v vi th ca bnh Histomonas meleagridis